Az immunmoduláló metabolitok a tumor mikro-környezetének (TME) kulcsfontosságú jellemzői, de néhány kivételtől eltekintve identitásuk nagyrészt ismeretlen. Ebben a tanulmányban magas malignitású szerózus karcinómában (HGSC) szenvedő betegek tumoraiból és asciteséből származó tumorokat és T-sejteket elemeztünk, hogy feltárjuk ezen különböző TME-kompartmentek metabolomját. Az ascites és a tumorsejtek metabolitjai között jelentős különbségek vannak. Az asciteshez képest a tumorba infiltrálódó T-sejtek jelentősen gazdagabbak 1-metilnikotinamidban (MNA). Bár az MNA szintje a T-sejtekben emelkedett, a nikotinamid-N-metiltranszferáz (egy olyan enzim, amely katalizálja a metilcsoportok átvitelét az S-adenozil-metioninból a nikotinamidba) expressziója a fibroblasztokra és a tumorsejtekre korlátozódik. Funkcionálisan az MNA a T-sejteket a tumort elősegítő citokin, a tumor nekrózis faktor alfa szekréciójára indukálja. Ezért a TME-ből származó MNA hozzájárul a T-sejtek immunszabályozásához, és potenciális immunterápiás célpontot jelent az emberi rák kezelésében.
A tumor eredetű metabolitok jelentős gátló hatást gyakorolhatnak a tumorellenes immunitásra, és egyre több bizonyíték utal arra, hogy a betegség progressziójának kulcsfontosságú hajtóerejeként is szolgálhatnak (1). A Warburg-effektus mellett a közelmúltban elkezdődött a tumorsejtek metabolikus állapotának és a tumor mikrokörnyezet (TME) immunállapotával való kapcsolatának jellemzésére irányuló munka. Egérmodelleken és emberi T-sejteken végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a glutamin-anyagcsere (2), az oxidatív anyagcsere (3) és a glükóz-anyagcsere (4) egymástól függetlenül is hathat a különböző immunsejt-alcsoportokra. Ezen útvonalakon belül számos metabolit gátolja a T-sejtek tumorellenes funkcióját. Bebizonyosodott, hogy a koenzim tetrahidrobiopterin (BH4) blokkolása károsíthatja a T-sejtek proliferációját, és a BH4 szintjének növekedése a szervezetben fokozhatja a CD4 és CD8 által közvetített tumorellenes immunválaszt. Ezenkívül a kinurenin immunszuppresszív hatása a BH4 adagolásával helyreállítható (5). Az izocitrát-dehidrogenáz (IDH) mutáns glioblasztómában az enantiometabolikus (R)-2-hidroxiglutarát (R-2-HG) szekréciója gátolja a T-sejtek aktiválódását, proliferációját és citolízis aktivitását (6). Nemrégiben kimutatták, hogy a glikolízis mellékterméke, a metilglioxál, mieloid eredetű szuppresszor sejtekben termelődik, és a metilglioxál T-sejtekbe történő átvitele gátolhatja az effektor T-sejtek működését. A kezelés során a metilglioxál semlegesítése legyőzheti a mieloid eredetű szuppresszor sejtek (MDSC) aktivitását, és szinergikusan fokozhatja az ellenőrzőpont-blokád terápiát egérmodellekben (7). Ezek a tanulmányok együttesen hangsúlyozzák a TME-ből származó metabolitok kulcsszerepét a T-sejtek működésének és aktivitásának szabályozásában.
A T-sejtek diszfunkciójáról széles körben beszámoltak petefészekrák esetén (8). Ez részben a hipoxiában és a rendellenes tumor érrendszerben rejlő metabolikus jellemzőknek köszönhető (9), amelyek a glükóz és a triptofán melléktermékekké, például tejsavvá és kinureninné alakulását eredményezik. A túlzott extracelluláris laktát csökkenti az interferon-γ (IFN-γ) termelését, és elősegíti a mieloszuppresszív alcsoportok differenciálódását (10, 11). A triptofán fogyasztása közvetlenül gátolja a T-sejtek proliferációját és gátolja a T-sejt receptor jelátvitelét (12-14). Ezen megfigyelések ellenére számos munkát végeztek az immunmetabolizmussal kapcsolatban in vitro T-sejtkultúrában optimalizált táptalajok alkalmazásával, vagy homológ egérmodellekre korlátozva in vivo, amelyek egyike sem tükrözi teljes mértékben az emberi rákok heterogenitását és a fiziológiai makro- és mikrokörnyezetet.
A petefészekrák gyakori jellemzője a hashártya átterjedése és az ascites megjelenése. A sejtfolyadék felhalmozódása az ascitesben előrehaladott betegséggel és rossz prognózissal jár (15). A jelentések szerint ez az egyedülálló kompartment hipoxiás, magas a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) és az indoleamin-2,3-dioxigenáz (IDO) szintje, és T-szabályozó sejtek és mieloid gátló sejtek infiltrálják (15-18). Az ascites metabolikus környezete eltérhet magától a tumortól, így a T-sejtek átprogramozása a hashártya térben nem világos. Ezenkívül az ascites és a tumor környezetében jelen lévő metabolitok közötti legfontosabb különbségek és heterogenitás akadályozhatja az immunsejtek infiltrációját és azok tumorokon betöltött szerepét, ezért további kutatásokra van szükség.
Ezen problémák megoldása érdekében egy érzékeny sejtszeparációs és folyadékkromatográfiás tandem tömegspektrometriás (LC-MS/MS) módszert terveztünk különböző sejttípusok (beleértve a CD4+ és CD8+ T-sejteket), valamint a tumorokon belüli és azok közötti vizsgálatokra. Metabolitjai a beteg ascitesében és tumorkörnyezetében lévő sejteket is magukban foglalják. Ezt a módszert nagydimenziós áramlási citometriával és egysejtes RNS-szekvenálással (scRNA-seq) együtt alkalmazzuk, hogy nagy felbontású képet kapjunk e kulcsfontosságú populációk metabolikus állapotáról. Ez a módszer az 1-metilnikotinamid (MNA) szintjének jelentős növekedését mutatta ki a tumor T-sejtekben, és in vitro kísérletek kimutatták, hogy az MNA immunmoduláló hatása a T-sejtek működésére korábban ismeretlen volt. Általánosságban elmondható, hogy ez a módszer feltárja a tumorok és az immunsejtek közötti kölcsönös metabolikus kölcsönhatásokat, és egyedülálló betekintést nyújt az immunszabályozás metabolitjaiba, ami hasznos lehet a T-sejt-alapú petefészekrák immunterápiájának kezelésében. Kezelési lehetőségek.
Nagydimenziós áramlási citometriát alkalmaztunk a glükózfelvétel [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-dezoxiglükóz (2-NBDG)] és a mitokondriális aktivitás [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) egyidejű mennyiségi meghatározására. Ezek egymás melletti tipikus markerek, amelyek megkülönböztetik az immunsejteket és a tumorsejt-populációkat (S2. táblázat és S1A. ábra). Ez az elemzés kimutatta, hogy a T-sejtekhez képest az ascites és a tumorsejtek magasabb glükózfelvételi szinttel rendelkeznek, de kisebb különbségek mutatkoznak a mitokondriális aktivitásban. A tumorsejtek átlagos glükózfelvétele [CD45-EpCAM (EpCAM)+] háromszorosa a T-sejtekének, a CD4+ T-sejtek átlagos glükózfelvétele pedig 1,2-szerese a CD8+ T-sejtekének, ami azt jelzi, hogy a tumorba infiltrálódó limfocitáknak (TIL) eltérő metabolikus igényeik vannak még ugyanabban a TME-ben is (1A. ábra). Ezzel szemben a tumorsejtek mitokondriális aktivitása hasonló a CD4+ T-sejtekéhez, és mindkét sejttípus mitokondriális aktivitása magasabb, mint a CD8+ T-sejteké (1B. ábra). Általánosságban elmondható, hogy ezek az eredmények az anyagcsere szintjét mutatják. A tumorsejtek metabolikus aktivitása magasabb, mint a CD4+ T-sejteké, és a CD4+ T-sejtek metabolikus aktivitása magasabb, mint a CD8+ T-sejteké. Ezen sejttípusok közötti hatások ellenére nincs következetes különbség a CD4+ és CD8+ T-sejtek metabolikus állapotában vagy relatív arányukban az ascitesben a tumorokhoz képest (1C. ábra). Ezzel szemben a CD45-sejtfrakcióban az EpCAM+ sejtek aránya a tumorban megnőtt az asciteshez képest (1D. ábra). Az EpCAM+ és az EpCAM- sejtkomponensek között is egyértelmű metabolikus különbséget figyeltünk meg. Az EpCAM+ (tumor) sejtek nagyobb glükózfelvétellel és mitokondriális aktivitással rendelkeznek, mint az EpCAM- sejtek, ami jóval magasabb, mint a fibroblasztok metabolikus aktivitása a tumorsejtekben a TME-ben (1., E. és F. ábra).
(A és B) A glükózfelvétel (2-NBDG) (A) és a CD4+ T-sejtek mitokondriális aktivitásának medián fluoreszcencia-intenzitása (MFI) (MitoTracker sötétvörös) (B) Reprezentatív grafikonok (balra) és táblázatos adatok (jobbra), CD8+ T-sejtek és EpCAM+CD45-tumorsejtek ascitesből és tumorból. (C) A CD4+ és CD8+ sejtek (CD3+ T-sejtek) aránya ascitesben és tumorban. (D) Az EpCAM+ tumorsejtek aránya ascitesben és tumorban (CD45−). (E és F) EpCAM+CD45-tumor és EpCAM-CD45-mátrix glükózfelvétel (2-NBDG) (E) és mitokondriális aktivitás (MitoTracker sötétvörös) (F) reprezentatív grafikonok (balra) és táblázatos adatok (jobbra) Ascites és tumorsejtek. (G) A CD25, CD137 és PD1 expressziójának reprezentatív grafikonjai áramlási citometriával. (H és I) CD25, CD137 és PD1 expresszió CD4+ T-sejteken (H) és CD8+ T-sejteken (I). (J és K) Naiv, centrális memória (Tcm), effektor (Teff) és effektor memória (Tem) fenotípusok a CCR7 és CD45RO expressziója alapján. Reprezentatív képek (balra) és táblázatos adatok (jobbra) CD4+ T-sejtekről (J) és CD8+ T-sejtekről (K) ascitesben és tumorokban. Párosított t-próbával meghatározott P-értékek (*P<0,05, **P<0,01 és ***P<0,001). A vonal a párosított betegeket jelöli (n = 6). FMO, fluoreszcencia mínusz egy; MFI, medián fluoreszcencia intenzitás.
További elemzések további jelentős különbségeket tártak fel a nagymértékben felbontott T-sejt fenotípusos státusza között. Az aktivált (1. ábra, G-I) és az effektor memória (1. ábra, J és K) tumorokban sokkal gyakoribb, mint az ascites (CD3+ T-sejtek aránya). Hasonlóképpen, a fenotípusnak az aktivációs markerek (CD25 és CD137) és a kimerülési markerek [programozott sejthalál fehérje 1 (PD1)] expressziója szerinti elemzése azt mutatta, hogy bár ezen populációk metabolikus jellemzői eltérőek (S1. ábra, B-E), a naiv, az effektor vagy a memória alcsoportok között nem figyeltek meg következetesen szignifikáns metabolikus különbségeket (S1. ábra, F-I). Ezeket az eredményeket gépi tanulási módszerek alkalmazásával megerősítették a sejtfenotípusok automatikus hozzárendelése (21), ami tovább tárta fel a csontvelői sejtek (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) jelenlétét a beteg ascitesében (S2A. ábra). Az összes azonosított sejttípus közül ez a mieloid sejtpopuláció mutatta a legmagasabb glükózfelvételt és mitokondriális aktivitást (S2. ábra, B-G). Ezek az eredmények rávilágítanak a HGSC-s betegek ascitesében és tumoraiban található többféle sejttípus közötti erős metabolikus különbségekre.
A TIL metabonomikai jellemzőinek megértésében a fő kihívást a megfelelő tisztaságú, minőségű és mennyiségű T-sejt minták izolálásának szükségessége a tumorokból. A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy az áramlási citometrián alapuló válogatási és gyöngydúsítási módszerek változásokhoz vezethetnek a sejtek metabolitprofiljaiban (22-24). Ennek a problémának a leküzdésére optimalizáltuk a gyöngydúsítási módszert, hogy a TIL-t sebészeti úton eltávolított emberi petefészekrákból izoláljuk és izoláljuk az LC-MS/MS elemzés előtt (lásd Anyagok és módszerek; 2A. ábra). Annak érdekében, hogy felmérjük a protokoll metabolitváltozásokra gyakorolt ​​teljes hatását, összehasonlítottuk az egészséges donorok által a fenti gyöngyszeparációs lépés után aktivált T-sejtek metabolitprofiljait a nem gyöngyszeparált, hanem jégen maradt sejtekkel. Ez a minőségellenőrzési elemzés megállapította, hogy magas korreláció van e két feltétel között (r = 0,77), és a 86 metabolitból álló csoport technikai ismételhetősége magas ismételhetőségű (2B. ábra). Ezért ezek a módszerek pontos metabolit-elemzést végezhetnek a sejttípus-dúsuláson áteső sejtekben, ezáltal biztosítva az első nagy felbontású platformot a HGSC-ben lévő specifikus metabolitok azonosítására, lehetővé téve ezáltal az emberek számára, hogy mélyebben megértsék a sejtek specifitását a szexuális anyagcsere-programban.
(A) A mágneses gyöngyös dúsítás vázlatos rajza. Az LC-MS/MS elemzés előtt a sejtek három egymást követő mágneses gyöngyös dúsítási körön esnek át, vagy jégen maradnak. (B) A dúsítás típusának hatása a metabolitok mennyiségére. Három mérés átlaga minden dúsítási típusnál ± SE. A szürke vonal 1:1 arányú kapcsolatot jelöl. Az ismételt mérések osztályon belüli korrelációja (ICC) a tengelycímkén látható. NAD, nikotinamid-adenin-dinukleotid. (C) A beteg metabolit-elemzésének munkafolyamatának vázlatos rajza. Asciteseket vagy tumorokat gyűjtenek a betegektől és kriokonzerválják. Minden minta kis részét áramlási citometriával elemezték, míg a fennmaradó mintákat három dúsítási körön keresztül CD4+, CD8+ és CD45- sejtekre. Ezeket a sejtfrakciókat LC-MS/MS segítségével elemezték. (D) A standardizált metabolit-abundanciának hőtérképe. A dendrogram a minták közötti euklideszi távolságok Ward-féle klaszterezését jelenti. (E) A minta metabolit-térképének főkomponens-elemzése (PCA), amely minden minta három ismétlését mutatja, az ugyanazon betegtől származó mintákat egy vonal köti össze. (F) A páciensen kondicionált minta metabolitprofiljának PCA-ja (azaz részleges redundanciát alkalmazva); a minta típusát a konvex burok korlátozza. PC1, 1. főkomponens; PC2, 2. főkomponens.
Ezután ezt a dúsítási módszert alkalmaztuk hat HGSC-s beteg primer ascitesében és tumoraiban található CD4+, CD8+ és CD45-sejtfrakciókban található 99 metabolit elemzésére (2C. ábra, S3A. ábra és S3. és S4. táblázat). Az adott populáció az eredeti nagyméretű élő sejtminta 2–70%-át teszi ki, és a sejtek aránya betegek között nagymértékben változik. A gyöngyök elválasztása után az adott dúsított frakció (CD4+, CD8+ vagy CD45-) átlagosan az összes élő sejt több mint 85%-át teszi ki a mintában. Ez a dúsítási módszer lehetővé teszi számunkra, hogy emberi tumorszövet anyagcseréjéből származó sejtpopulációkat elemezzünk, ami nagyméretű mintákból lehetetlen. Ezzel a protokollal megállapítottuk, hogy az l-kinurenin és az adenozin, ez a két jól jellemzett immunszuppresszív metabolit, emelkedett szinten volt jelen a tumor T-sejtekben vagy a tumorsejtekben (S3., B. és C. ábra). Ezek az eredmények tehát igazolják sejtszeparációs és tömegspektrometriás technológiánk pontosságát és képességét a biológiailag fontos metabolitok megtalálására a betegek szöveteiben.
Elemzésünk a sejtek erős metabolikus elkülönülését is feltárta a betegeken belül és a betegek között (2D. ábra és S4A. ábra). Különösen a többi beteghez képest a 70-es beteg mutatott eltérő metabolikus jellemzőket (2E. ábra és S4B. ábra), ami arra utal, hogy jelentős metabolikus heterogenitás lehet a betegek között. Érdemes megjegyezni, hogy a többi beteghez képest (1,2-2 liter; S1. táblázat) a 70-es betegnél összegyűjtött ascites teljes mennyisége (80 ml) kisebb volt. A betegek közötti heterogenitás kontrollja a főkomponens-elemzés során (például részleges redundancia-analízis alkalmazásával) következetes változásokat mutat a sejttípusok között, és a sejttípusok és/vagy a mikro-környezet egyértelműen aggregálódik a metabolitprofil szerint (2F. ábra). Az egyes metabolitok elemzése kiemelte ezeket a hatásokat, és jelentős különbségeket tárt fel a sejttípusok és a mikro-környezet között. Érdemes megjegyezni, hogy a legszélsőségesebb megfigyelt különbség az MNA, amely általában a CD45- sejtekben, valamint a tumorba infiltrálódó CD4+ és CD8+ sejtekben dúsul fel (3A. ábra). A CD4+ sejtek esetében ez a hatás a legnyilvánvalóbb, és a CD8+ sejtekben lévő MNA-t is erősen befolyásolja a környezet. Ez azonban nem fontos, mivel a hat beteg közül csak háromnál lehet értékelni a tumor CD8+ pontszámát. Az MNA mellett az ascites és a tumorok különböző sejttípusaiban más, a TIL-ben rosszul jellemzett metabolitok is eltérően gazdagok (S3. és S4. ábra). Ezért ezek az adatok ígéretes immunmoduláló metabolitokat mutatnak a további kutatásokhoz.
(A) Az ascites és tumor CD4+, CD8+ és CD45- sejtjeinek normalizált MNA-tartalma. A dobozdiagram a mediánt (vonal), az interkvartilis tartományt (keretzsanér) és az adattartományt mutatja, az interkvartilis tartomány legfeljebb 1,5-szereséig (kerethajlat). A Beteganyagok és módszerek részben leírtak szerint a P-érték meghatározásához a beteg limmaértékét kell használni (*P<0,05 és **P<0,01). (B) Az MNA-anyagcsere sematikus ábrája (60). Metabolitok: S-adenozil-1-metionin; SAH, S-adenozin-1-homocisztein; NA, nikotinamid; MNA, 1-metilnikotinamid; 2-PY, 1-metil-2-piridon-5-karboxamid; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboxamid; NR, nikotinamid-ribóz; NMN, nikotinamid-mononukleotid. Enzimek (zöld): NNMT, nikotinamid-N-metiltranszferáz; SIRT, szirtuinok; NAMPT, nikotinamid-foszforibozil-transzferáz; AOX1, aldehid-oxidáz 1; NRK, nikotinamid-ribozid-kináz; NMNAT, nikotinamid-mononukleotid-adenilát-transzferáz; Pnp1, purin-nukleozid-foszforiláz. (C) Ascites (szürke) és tumor (piros; n = 3 beteg) scRNS-szekvenálásának t-SNE-je. (D) NNMT expresszió különböző sejtpopulációkban, scRNS-szekvenálás segítségével azonosítva. (E) NNMT és AOX1 expressziója SK-OV-3-ban, humán embrionális vese (HEK) 293T-ben, T-sejtekben és MNA-val kezelt T-sejtekben. A hajtogatott expresszió az SK-OV-3-hoz képest látható. A SEM-mel készült expressziós mintázat látható (n = 6 egészséges donor). A 35-nél nagyobb Ct-értékeket nem detektálhatónak (UD) tekintjük. (F) Az SLC22A1 és SLC22A2 expressziója SK-OV-3, HEK293T, T-sejtekben és 8mM MNA-val kezelt T-sejtekben. A feltekeredett expressziót az SK-OV-3-hoz viszonyítva mutatjuk be. A pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM) készült expressziós mintázat látható (n = 6 egészséges donor). A 35-nél nagyobb Ct-értékeket nem detektálhatónak (UD) tekintjük. (G) Sejt MNA-tartalma aktivált egészséges donor T-sejtekben 72 órás MNA-inkubáció után. A pásztázó elektronmikroszkóppal készült expressziós mintázat látható (n = 4 egészséges donor).
Az MNA-t úgy állítják elő, hogy a metilcsoportot az S-adenozil-1-metioninról (SAM) nikotinamidra (NA) viszi át a nikotinamid-N-metiltranszferáz (NNMT; 3B. ábra). Az NNMT számos emberi rákban túltermelődik, és összefüggésben áll a proliferációval, invázióval és áttétekkel (25-27). Annak érdekében, hogy jobban megértsük az MNA forrását a TME T-sejtjeiben, scRNA-szekvenálást alkalmaztunk az NNMT expressziójának jellemzésére a különböző sejttípusokban három HGSC-s beteg ascitesében és tumoraiban (S5. táblázat). Körülbelül 6500 sejt elemzése kimutatta, hogy ascitesben és tumoros környezetben az NNMT expressziója a feltételezett fibroblaszt és tumorsejt-populációkra korlátozódott (3., C és D ábra). Érdemes megjegyezni, hogy nincs nyilvánvaló NNMT expresszió egyetlen olyan populációban sem, amely PTPRC-t (CD45+) expresszál (3D. ábra és S5A. ábra), ami arra utal, hogy a metabolit spektrumban kimutatott MNA bejutott a T-sejtekbe. Az aldehid-oxidáz 1 (AOX1) expressziója az MNA-t 1-metil-2-piridon-5-karboxamiddá (2-PYR) vagy 1-metil-4-piridon-5-karboxamiddá (4-PYR) alakítja; 3B. ábra) szintén a COL1A1-et expresszáló fibroblasztok populációjára korlátozódik (S5A. ábra), amelyek együttesen azt jelzik, hogy a T-sejtek nem képesek a hagyományos MNA-anyagcserére. Ezen MNA-val kapcsolatos gének expressziós mintázatát egy második független sejtadatkészlettel igazolták HGSC-betegek asciteséből (S5B. ábra; n = 6) (16). Ezenkívül az MNA-val kezelt egészséges donor T-sejtek kvantitatív polimeráz láncreakciós (qPCR) elemzése kimutatta, hogy a kontroll SK-OV-3 petefészek tumorsejtekhez képest az NNMT vagy az AOX1 szinte nem expresszálódott (3E. ábra). Ezek a váratlan eredmények arra utalnak, hogy az MNA a fibroblasztokból vagy tumorokból a szomszédos T-sejtekbe szekretálódhat TME-ben.
Bár a jelöltek között szerepel az oldható hordozó 22 (SLC22) család (SLC22A1, SLC22A2 és SLC22A3) által kódolt szerves kation transzporterek 1-3 családja (OCT1, OCT2 és OCT3), az MNA potenciális transzporterei még mindig nem meghatározottak (28). Az egészséges donor T-sejtekből származó mRNS QPCR-je alacsony SLC22A1 expressziós szintet mutatott, de kimutathatatlan SLC22A2 szintet, ami megerősítette, hogy korábban már beszámoltak róla az irodalomban (3F. ábra) (29). Ezzel szemben az SK-OV-3 petefészek tumorsejtvonal mindkét transzporter magas szintjét expresszálta (3F. ábra).
Annak tesztelésére, hogy a T-sejtek képesek-e idegen MNA-t abszorbeálni, egészséges donor T-sejteket 72 órán át tenyésztettek különböző MNA-koncentrációk jelenlétében. Exogén MNA hiányában az MNA sejtes tartalma nem volt kimutatható (3G. ábra). Az exogén MNA-val kezelt aktivált T-sejtek azonban dózisfüggő MNA-tartalom-növekedést mutattak a sejtekben, akár 6 mM MNA-ig (3G. ábra). Ez az eredmény azt jelzi, hogy a transzporter expressziójának alacsony szintje és az intracelluláris MNA-anyagcseréért felelős fő enzim hiánya ellenére a TIL továbbra is képes felvenni az MNA-t.
A betegek T-sejtjeiben található metabolitok spektruma és az in vitro MNA abszorpciós kísérletek növelik annak a lehetőségét, hogy a rákhoz kapcsolódó fibroblasztok (CAF) MNA-t választanak ki, és a tumorsejtek szabályozhatják a TIL fenotípusát és funkcióját. Az MNA T-sejtekre gyakorolt ​​hatásának meghatározásához egészséges donor T-sejteket in vitro aktiváltak MNA jelenlétében vagy hiányában, és értékelték proliferációjukat és citokintermelésüket. Az MNA legmagasabb dózisának 7 napos hozzáadása után a populáció megduplázódási száma mérsékelten csökkent, míg az életerő minden dózisnál megmaradt (4A. ábra). Ezenkívül az exogén MNA-kezelés a tumor nekrózis faktor-α-t (TNFα; 4B. ábra) expresszáló CD4+ és CD8+ T-sejtek arányának növekedését eredményezte. Ezzel szemben az IFN-γ intracelluláris termelése szignifikánsan csökkent a CD4+ T-sejtekben, de nem a CD8+ T-sejtekben, és az interleukin 2 (IL-2; 4. ábra, C és D) szintjében sem volt szignifikáns változás. Ezért az ezen MNA-val kezelt T-sejtkultúrák felülúszóinak enzimhez kötött immunszorbens vizsgálata (ELISA) a TNFα jelentős növekedését, az IFN-γ csökkenését és az IL-2 változásának hiányát mutatta (4. ábra, E-G). Az IFN-γ csökkenése arra utal, hogy az MNA szerepet játszhat a T-sejtek daganatellenes aktivitásának gátlásában. Az MNA T-sejt által közvetített citotoxicitásra gyakorolt ​​hatásának szimulálása érdekében egészséges donor perifériás vér mononukleáris sejtjeiben (PBMC) folátreceptor α-t célzó kiméra antigén receptor T (FRα-CAR-T) sejteket és zöld fluoreszcens fehérje (GFP) által szabályozott CAR-T (GFP) sejteket állítottak elő. A CAR-T sejteket 24 órán át MNA jelenlétében tenyésztették, majd humán SK-OV-3 petefészek tumorsejtekkel együtt tenyésztették, amelyek folátreceptor α-t expresszálnak 10:1 effektor-célpont arányban. Az MNA-kezelés a FRα-CAR-T sejtek ölő aktivitásának jelentős csökkenését eredményezte, ami hasonló volt az adenozinnal kezelt FRα-CAR-T sejtekéhez (4H. ábra).
(A) Az összes életképes sejtszám és a populációduplázódás (PD) közvetlenül a tenyészetből a 7. napon. Az oszlopdiagram hat egészséges donor átlagát + SEM-et jelöl. Legalább n = 3 független kísérlet adatait mutatja. (B-től D-ig) CD3/CD28 és IL-2 antitesteket használtak a T-sejtek aktiválására a megfelelő MNA-koncentrációkban 7 napig. Az elemzés előtt a sejteket PMA/ionomicinnel és GolgiStoppal stimulálták 4 órán át. TNFα (B) expresszió T-sejtekben. Példakép (balra) és táblázatos adatok (jobbra) a TNFα expressziójáról élő sejtekben. IFN-γ (C) és IL-2 (D) expresszió T-sejtekben. A citokinek expresszióját áramlási citometriával mérték. Az oszlopdiagram az átlagot (n = 6 egészséges donor) + SEM-et jelöli. A P-érték meghatározásához egyutas varianciaanalízist és ismételt méréseket (*P<0,05 és **P<0,01) alkalmaztak. Legalább n = 3 független kísérlet adatait mutatja. (E-től G-ig) A CD3/CD28 és IL-2 sejteket a T-sejtek aktiválására használtuk a megfelelő MNA-koncentrációkban 7 napig. A táptalajt 4 órás PMA/ionomicin stimuláció előtt és után gyűjtöttük össze. A TNFα (E), IFN-γ (F) és IL-2 (G) koncentrációit ELISA-val mértük. Az oszlopdiagram az átlagot (n = 5 egészséges donor) + SEM-et jelöli. A p-értéket egyutas varianciaanalízissel és ismételt mérésekkel határoztuk meg (*P<0,05). A szaggatott vonal a kimutatási határt jelzi. (H) Sejtlízis vizsgálat. Az FRα-CAR-T vagy GFP-CAR-T sejteket adenozinnal (250 μM) vagy MNA-val (10 mM) kezeltük 24 órán át, vagy kezeletlenül hagytuk (Ctrl). Az SK-OV-3 sejtek százalékos pusztulását mértük. A p-értéket Welch t-próbával határoztuk meg (*P<0,5 és **P<0,01).
Az MNA-függő TNFα expresszió szabályozásának mechanisztikus megértése érdekében értékelték az MNA-val kezelt T-sejtek TNFα mRNS-ének változásait (5A. ábra). Az MNA-val kezelt egészséges donor T-sejtek a TNFα transzkripciós szintjének kétszeres növekedését mutatták, ami arra utal, hogy az MNA a TNFα transzkripciós szabályozásától függ. Ennek a lehetséges szabályozási mechanizmusnak a vizsgálatához két ismert, a TNFα-t szabályozó transzkripciós faktort, nevezetesen az aktivált T-sejt nukleáris faktort (NFAT) és a specifikus fehérjét 1 (Sp1) értékelték az MNA proximális TNFα promoterhez való kötődésére adott válaszként (30). A TNFα promoter 6 azonosított NFAT kötőhelyet és 2 Sp1 kötőhelyet tartalmaz, amelyek egy helyen átfedésben vannak [-55 bázispár (bp) az 5'-cap-tól] (30). A kromatin immunprecipitáció (ChIP) kimutatta, hogy MNA-val kezelve az Sp1 kötődése a TNFα promoterhez háromszorosára nőtt. Az NFAT beépülése is megnőtt, és elérte a fontosságot (5B. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az MNA az Sp1 transzkripción keresztül szabályozza a TNFα expresszióját, és kisebb mértékben az NFAT expresszióját.
(A) Az MNA nélkül tenyésztett T-sejtekhez képest a TNFα expressziójának szoros változása MNA-val kezelt T-sejtekben. Az SEM-mel készült expressziós mintázat látható (n = 5 egészséges donor). Legalább n = 3 független kísérletből származó adatokat képvisel. (B) Az NFAT és Sp1 után 8 mM MNA-val kezelt vagy nem kezelt T-sejtek TNFα promóterét (Ctrl) és PMA/ionomicin stimulációval kombináltuk 4 órán át. Az immunprecipitációhoz negatív, illetve pozitív kontrollként immunglobulin G-t (IgG) és H3-at használtunk. A ChIP mennyiségi meghatározása azt mutatta, hogy az Sp1 és az NFAT kötődése a TNFα promóterhez MNA-val kezelt sejtekben többszörösére nőtt a kontrollhoz képest. Legalább n = 3 független kísérletből származó adatokat képvisel. A P-értéket többszörös t-próbával határoztuk meg (*** P <0,01). (C) A HGSC asciteséhez képest a T-sejtek (nem citotoxikusak) fokozott TNF expressziót mutattak a tumorban. A színek különböző betegeket jelölnek. A megjelenített sejteket véletlenszerűen, 300-szor vettük mintába, és remegtettük a túlrajzolás korlátozása érdekében (** Padj = 0,0076). (D) A petefészekrák MNA-jának javasolt modellje. Az MNA-t tumorsejtek és fibroblasztok termelik a TME-ben, és a T-sejtek veszik fel. Az MNA növeli az Sp1 kötődését a TNFα promoterhez, ami fokozott TNFα transzkripcióhoz és TNFα citokin termeléshez vezet. Az MNA az IFN-γ csökkenését is okozza. A T-sejtek működésének gátlása a sejtölő képesség csökkenéséhez és a tumor növekedésének felgyorsulásához vezet.
Jelentések szerint a TNFα elülső és hátulról függő daganatellenes és daganatellenes hatásokkal rendelkezik, de jól ismert szerepe van a petefészekrák növekedésének és áttétképződésének elősegítésében is (31-33). Jelentések szerint a TNFα koncentrációja petefészekrákos betegek ascitesében és daganatos szöveteiben magasabb, mint a jóindulatú szövetekben (34-36). A mechanizmust tekintve a TNFα szabályozhatja a fehérvérsejtek aktivációját, működését és proliferációját, valamint megváltoztathatja a rákos sejtek fenotípusát (37, 38). Ezekkel az eredményekkel összhangban a differenciális génexpressziós elemzés kimutatta, hogy a TNF szignifikánsan felregulálódott a tumoros szövetek T-sejtjeiben az asciteshez képest (5C. ábra). A TNF-expresszió növekedése csak a nem citotoxikus fenotípusú T-sejtpopulációkban volt megfigyelhető (S5A. ábra). Összefoglalva, ezek az adatok alátámasztják azt a nézetet, hogy az MNA kettős immunszuppresszív és daganatot elősegítő hatással rendelkezik a HGSC-ben.
Az áramlási citometrián alapuló fluoreszcens jelölés vált a TIL-anyagcsere vizsgálatának fő módszerévé. Ezek a tanulmányok kimutatták, hogy a perifériás vér limfocitáihoz vagy a másodlagos nyirokszervekből származó T-sejtekhez képest az egér és az emberi TIL-ek nagyobb hajlamot mutatnak a glükózfelvételre (4, 39), és a mitokondriális funkció fokozatosan csökken (19, 40). Bár ebben a vizsgálatban hasonló eredményeket figyeltünk meg, a legfontosabb fejlesztés a tumorsejtek és az ugyanazon reszekált tumorszövetből származó TIL anyagcseréjének összehasonlítása. E korábbi jelentésekkel összhangban az ascitesből és tumorokból származó tumorsejtek (CD45-EpCAM+) nagyobb glükózfelvétellel rendelkeznek, mint a CD8+ és CD4+ T-sejtek, ami alátámasztja, hogy a tumorsejtek magas glükózfelvétele összehasonlítható a T-sejtekével. A T-sejt-verseny koncepciója. TME. A tumorsejtek mitokondriális aktivitása azonban magasabb, mint a CD8+ T-sejteké, de a mitokondriális aktivitás hasonló a CD4+ T-sejtekéhez. Ezek az eredmények megerősítik azt a felmerülő témát, hogy az oxidatív anyagcsere fontos a tumorsejtek számára (41, 42). Azt is sugallják, hogy a CD8+ T-sejtek fogékonyabbak lehetnek az oxidatív diszfunkcióra, mint a CD4+ T-sejtek, vagy hogy a CD4+ T-sejtek a glükóztól eltérő szénforrásokat használhatnak a mitokondriális aktivitás fenntartásához (43, 44). Meg kell jegyezni, hogy ascitesben nem figyeltünk meg különbséget a glükózfelvételben vagy a mitokondriális aktivitásban a CD4+ T effektorok, a T effektor memória és a T központi memória sejtek között. Hasonlóképpen, a CD8+ T-sejtek differenciálódási állapota tumorokban semmi köze a glükózfelvétel változásaihoz, ami kiemeli az in vitro tenyésztett T-sejtek és az in vivo humán TIL közötti jelentős különbséget (22). Ezeket a megfigyeléseket megerősítette az elfogulatlan automatikus sejtpopuláció-allokáció alkalmazása is, amely továbbá kimutatta, hogy a tumorsejtekhez képest nagyobb glükózfelvételű és mitokondriális aktivitású CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ sejtek elterjedtek, de metabolikusan aktív sejtpopulációval rendelkeznek. Ez a populáció a scRNA-seq analízis során azonosított myeloid szupresszor sejtek vagy plazmacitoid dendritikus sejtek feltételezett alpopulációját képviselheti. Bár mindkettőt kimutatták emberi petefészekdaganatokban [45], további munkára van szükség e mieloid alpopuláció leírásához.
Bár az áramlási citometrián alapuló módszerek tisztázhatják a sejttípusok közötti glükóz- és oxidatív anyagcsere-általános különbségeket, a glükóz vagy más szénforrások által a mitokondriális anyagcseréhez a TME-ben termelt pontos metabolitokat még nem határozták meg. A metabolitok jelenlétének vagy hiányának egy adott TIL-alcsoporthoz való rendelése megköveteli a sejtpopuláció tisztítását a kimetszett szövetből. Ezért a sejtdúsítási módszerünk tömegspektrometriával kombinálva betekintést nyújthat a T-sejtekben és a tumorsejt-populációkban eltérően dúsuló metabolitokba a párosított betegmintákban. Bár ennek a módszernek vannak előnyei a fluoreszcencia-aktivált sejtszortírozással szemben, bizonyos metabolitkönyvtárak érintettek lehetnek a belső stabilitásuk és/vagy a gyors turnover sebességük miatt (22). Mindazonáltal módszerünk képes volt azonosítani két elismert immunszuppresszív metabolitot, az adenozint és a kinurenint, mivel ezek nagymértékben eltérnek a mintatípusok között.
A tumorok és a TIL altípusok metabonómiai elemzése további betekintést nyújt a metabolitok szerepébe a petefészek TME-ben. Először is, áramlási citometria segítségével megállapítottuk, hogy nincs különbség a mitokondriális aktivitásban a tumorok és a CD4 + T-sejtek között. Az LC-MS/MS analízis azonban jelentős változásokat mutatott a metabolitok mennyiségében ezen populációk között, ami arra utal, hogy a TIL anyagcseréjére és annak általános metabolikus aktivitására vonatkozó következtetések gondos értelmezést igényelnek. Másodszor, az MNA az a metabolit, amelyben a legnagyobb különbség mutatkozik a CD45-sejtek és a T-sejtek között az ascitesben, nem a tumorokban. Ezért a kompartmentalizáció és a tumor elhelyezkedése eltérő hatással lehet a TIL anyagcseréjére, ami rávilágít az adott mikro-környezetben rejlő lehetséges heterogenitásra. Harmadszor, az MNA-termelő enzim, az NNMT expressziója főként a CAF-ra korlátozódik, ami kisebb mértékben a tumorsejtekre korlátozódik, de kimutatható MNA-szintek figyelhetők meg a tumor eredetű T-sejtekben. Az NNMT túltermelése a petefészek CAF-ban ismert rákkeltő hatással bír, részben a CAF anyagcseréjének, a tumor inváziójának és áttétképződésének elősegítése miatt (27). Bár a TIL összességében mérsékelt, az NNMT expressziója a CAF-ban szorosan összefügg a Cancer Genome Atlas (TCGA) mezenchimális altípusával, amely rossz prognózissal jár (27, 46, 47). Végül az MNA lebontásáért felelős AOX1 enzim expressziója is a CAF populációra korlátozódik, ami arra utal, hogy a T-sejtek nem képesek az MNA metabolizálására. Ezek az eredmények alátámasztják azt az elképzelést, hogy bár további munkára van szükség ennek a megállapításnak az igazolásához, a T-sejtekben az MNA magas szintje immunszuppresszív CAF mikro-környezet jelenlétére utalhat.
Tekintettel az MNA transzporterek alacsony expressziós szintjére és az MNA anyagcseréjében részt vevő kulcsfontosságú fehérjék kimutathatatlan szintjére, az MNA jelenléte a T-sejtekben váratlan. Sem az NNMT, sem az AOX1 nem volt kimutatható két független kohorsz scRNS-szekvenálásával és célzott qPCR-jével. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az MNA-t nem a T-sejtek szintetizálják, hanem a környező TME-ből szívják fel. In vitro kísérletek azt mutatják, hogy a T-sejtek hajlamosak exogén MNA-t felhalmozni.
In vitro tanulmányaink kimutatták, hogy az exogén MNA indukálja a TNFα expresszióját T-sejtekben, és fokozza az Sp1 kötődését a TNFα promoterhez. Bár a TNFα-nak mind daganatellenes, mind daganatellenes funkciója van, petefészekrákban a TNFα elősegítheti a petefészekrák növekedését (31-33). A TNFα semlegesítése petefészekdaganat-sejtkultúrában vagy a TNFα-jel eliminálása egérmodellekben javíthatja a TNFα által közvetített gyulladásos citokinek termelését és gátolhatja a tumor növekedését (32, 35). Ezért ebben az esetben a TME-ből származó MNA gyulladáskeltő metabolitként működhet egy TNFα-függő mechanizmuson keresztül az autokrin hurokon keresztül, ezáltal elősegítve a petefészekrák kialakulását és terjedését (31). Ezen lehetőség alapján a TNFα-blokádot potenciális terápiás szerként vizsgálják a petefészekrák kezelésében (37, 48, 49). Ezenkívül az MNA rontja a CAR-T-sejtek citotoxicitását a petefészekdaganat-sejtekkel szemben, további bizonyítékot szolgáltatva az MNA által közvetített immunszuppresszióra. Összességében ezek az eredmények egy olyan modellre utalnak, amelyben a tumorok és a CAF-sejtek MNA-t választanak ki az extracelluláris TME-be. (i) TNF által kiváltott petefészekrák-növekedés stimuláción és (ii) MNA által kiváltott T-sejt citotoxikus aktivitás gátláson keresztül ez kettős tumorhatással járhat (5D. ábra).
Összefoglalva, a gyors sejtdúsítás, az egysejt-szekvenálás és az anyagcsere-profilozás kombinációjának alkalmazásával ez a tanulmány feltárta a tumorok és az ascites sejtek közötti hatalmas immunometabolomikai különbségeket HGSC-betegekben. Ez az átfogó elemzés kimutatta, hogy a T-sejtek glükózfelvétele és mitokondriális aktivitása között eltérések vannak, és az MNA-t nem sejtes autonóm immunszabályozó metabolitként azonosította. Ezek az adatok hatással vannak arra, hogy a TME hogyan befolyásolja a T-sejtek anyagcseréjét emberi rákos megbetegedésekben. Bár a T-sejtek és a rákos sejtek közötti közvetlen tápanyagversenyről beszámoltak, a metabolitok közvetett szabályozóként is működhetnek, elősegítve a tumor progresszióját, és esetleg elnyomva az endogén immunválaszokat. Ezen szabályozó metabolitok funkcionális szerepének további leírása alternatív stratégiákat nyithat meg a tumorellenes immunválasz fokozására.
A betegek mintáit és klinikai adatait a Kanadai Tissue Repository Network által hitelesített BC rákos daganatszövet-repozitóriumon keresztül szereztük be. A BC Rákkutatási Etikai Bizottság és a British Columbia Egyetem által jóváhagyott protokoll (H07-00463) szerint minden beteg mintájától és klinikai adatától írásbeli beleegyezést kértünk, vagy hivatalosan lemondtunk a beleegyezésről. A mintákat a hitelesített BioBankban (BRC-00290) tároljuk. A betegek részletes jellemzőit az S1. és S5. táblázat mutatja. A krioprezervációhoz szikével mechanikusan lebontjuk a beteg daganatmintáját, majd egy 100 mikronos szűrőn átnyomjuk, hogy egyetlen sejtszuszpenziót kapjunk. A beteg ascitesét 1500 fordulat/perc sebességgel 10 percig 4°C-on centrifugáljuk a sejtek pelletálására és a felülúszó eltávolítására. A tumorból és az ascitesből nyert sejteket 50%-os hővel inaktivált humán AB szérumban (Sigma-Aldrich), 40%-os RPMI-1640-ben (Thermo Fisher Scientific) és 10%-os dimetil-szulfoxidban krioprezerváljuk. Ezeket a tartósított egysejt-szuszpenziókat felolvasztották, és az alábbiakban leírt metabolomikai és metabolit-meghatározáshoz használták.
A teljes táptalaj 0,22 μm-es szűrt, 50:50 arányban kiegészített RPMI 1640:AimV-ből áll. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific), kiegészítve 10% hővel inaktivált humán AB szérummal (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes-sel (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutaminnal (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific, 1 x Penicillin Streptomycin (PenStrep) oldattal (Thermo Fisher Scientific) és 50 μMB-merkaptoetanollal. Az AimV-t (Invitrogen) 20 mM Hepes-sel (Thermo Fisher Scientific) és 2 mM l-glutaminnal (Thermo Fisher Scientific) egészítettük ki. Az áramlási citométer festőpuffere 0,22 μm-es szűrt foszfáttal pufferolt sóoldatból (PBS; Invitrogen) állt, kiegészítve 3% hővel inaktivált AB humán szérummal (Sigma). A sejtdúsító puffer 0,22 μm-es szűrt PBS-ből áll, és 0,5% hővel inaktivált humán AB szérummal (Sigma-Aldrich) van kiegészítve.
37°C-os komplett táptalajban a sejteket 10 nM MT DR-rel és 100 μM 2-NBDG-vel festettük 30 percig. Ezután a sejteket eF506 életképesség-jelző festékkel festettük 4°C-on 15 percig. A sejteket FC Blockban (eBioscience) és Brilliant Stain Bufferben (BD Biosciences) reszuszpendáltuk, áramlási citométer festőpufferben hígítottuk (a gyártó utasításai szerint), és 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A sejteket antitestkészlettel (S2. táblázat) festettük áramlási citometriás festőpufferben 4°C-on 20 percig. Az elemzés előtt a sejteket áramlási citometriás festőpufferben (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguráció) reszuszpendáltuk. A sejtszámadatok elemzéséhez SpectroFlo és FlowJo V10 szoftvert használtunk, az adatok létrehozásához pedig GraphPad Prism 8 szoftvert használtunk. A 2-NBDG és az MT DR medián fluoreszcencia-intenzitását (MFI) log-normalizáltuk, majd párosított t-próbát alkalmaztunk statisztikai elemzéshez az egyező betegek figyelembevételére. Távolítsunk el minden olyan populációt az elemzésből, amely kevesebb, mint 40 eseményt tartalmazott; adjunk 1 MFI-értéket minden negatív értékhez a statisztikai elemzés és az adatvizualizáció elvégzése előtt.
A fenti folyamatpanel manuális kapuzási stratégiájának kiegészítéseként az alakrestrikciós fa (FAUST) (21) teljes annotációját használtuk a sejtek automatikus populációhoz rendeléséhez a FlowJo-ban az elhalt sejtek eltávolítása után. A kimenetet manuálisan kezeljük, hogy összevonjuk a látszólag rosszul elosztott populációkat (PD1+ és PD1-tumorsejtek kombinálása) és a megtartott populációkat. Minden minta átlagosan több mint 2%-nyi sejtet tartalmaz, így összesen 11 populációt kapunk.
A PBMC-ket Ficoll gradiens sűrűségcentrifugálással választottuk el a leukocita elválasztási termékektől (STEMCELL Technologies). A CD8+ T-sejteket PBMC-ből CD8 MicroBeads (Miltenyi) segítségével izoláltuk, majd TransAct (Miltenyi) felhasználásával teljes táptalajban tenyésztettük 2 hétig a gyártó utasításai szerint. A sejteket 5 napig IL-7-et (10 ng/ml; PeproTech) tartalmazó teljes táptalajban hagytuk állni, majd TransAct-tal újra stimuláltuk. A 7. napon, a gyártó utasításai szerint, humán CD45 MicroBeads (Miltenyi) segítségével dúsítottuk a sejteket három egymást követő körben. A sejteket áramlási citometriás analízishez aliquot részekre osztottuk (a fent leírtak szerint), és egymillió sejtet háromszor aliquot részekre osztottunk LC-MS/MS analízishez. A mintákat LC-MS/MS-sel dolgoztuk fel az alábbiakban leírtak szerint. A hiányzó metabolit értékét 1000-es ionszámmal becsültük meg. Minden mintát a teljes ionszámmal (TIC) normalizáltunk, logaritmikusan átszámítottunk és automatikusan normalizáltunk a MetaboAnalystR-ben az elemzés előtt.
Minden beteg egysejt-szuszpenzióját felolvasztották, majd 40 μm-es szűrőn keresztül teljes táptalajba szűrték (a fent leírtak szerint). A gyártó protokollja szerint három egymást követő pozitív szelekciós kört alkalmaztak mágneses gyöngyszeparációval MicroBeads (Miltenyi) segítségével a minták CD8+, CD4+ és CD45- sejtekre való dúsítására (jégen). Röviden, a sejteket sejtdúsító pufferben reszuszpendálták (a fent leírtak szerint), és megszámolták. A sejteket humán CD8 gyöngyökkel, humán CD4 gyöngyökkel vagy humán CD45 gyöngyökkel (Miltenyi) inkubálták 4°C-on 15 percig, majd sejtdúsító pufferrel mosták. A mintát átengedték az LS oszlopon (Miltenyi), és a pozitív és negatív frakciókat összegyűjtötték. Az időtartam csökkentése és a sejt-visszanyerési lépés maximalizálása érdekében a CD8-frakciót a CD4+ dúsítás második köréhez, a CD4-frakciót pedig a következő CD45-dúsításhoz használták. Az elválasztási folyamat során az oldatot végig jégen tartották.
A metabolit-elemzéshez szükséges minták előkészítéséhez a sejteket egyszer mostuk jéghideg sóoldattal, majd minden mintához 1 ml 80%-os metanolt adtunk, vortexeltük és folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottuk. A mintákat három fagyasztás-felolvasztási ciklusnak vetettük alá, majd 14 000 fordulat/perc sebességgel 15 percig 4°C-on centrifugáltuk. A metabolitokat tartalmazó felülúszót szárazra pároltuk. A metabolitokat 50 μl 0,03%-os hangyasavban újra feloldottuk, vortexeltük az összekeveréshez, majd centrifugáltuk a törmelék eltávolítása érdekében.
A metabolitokat a fent leírtak szerint vonjuk ki. A felülúszót metabolomikai kutatásokhoz nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás palackba visszük át. Véletlenszerű kezelési protokollt alkalmazzunk, hogy minden mintát hasonló számú sejttel kezeljünk, hogy elkerüljük a tételhatásokat. A globális metabolitok kvalitatív értékelését korábban az AB SCIEX QTRAP 5500 tripla kvadrupól tömegspektrométeren (50) publikáltuk. A kromatográfiás analízist és a csúcsterület-integrációt MultiQuant 2.1-es verziójú szoftverrel (Applied Biosystems SCIEX) végeztük.
1000-es ionszámot használtunk a hiányzó metabolit értékének becslésére, és minden minta TIC-jét használtuk az egyes detektált metabolitok normalizált csúcsterületének kiszámításához, hogy korrigáljuk a mintafeldolgozás során a műszeres elemzés által bevezetett változásokat. A TIC normalizálása után a MetaboAnalystR(51) (alapértelmezett paraméter) a logaritmikus konverzióhoz és az automatikus norma vonal skálázásához. PCA-t használtunk vegan R csomaggal a metabolitok közötti különbségek feltáró elemzéséhez a mintatípusok között, és részleges redundanciaanalízist alkalmaztunk a betegek elemzéséhez. Ward-módszert használtunk egy hőtérkép dendrogram létrehozásához, hogy klaszterezzük a minták közötti euklideszi távolságot. A limma (52) módszert használtuk a standardizált metabolitbundanciára, hogy azonosítsuk a különböző bőségű metabolitokat a teljes sejttípusban és mikro-környezetben. A magyarázat egyszerűsítése érdekében a csoportátlag paramétert használtuk a modell meghatározásához, és a mikro-környezetben lévő sejttípusokat tekintettük minden csoportnak (n = 6 csoport); a szignifikancia teszthez három ismételt mérést végeztünk minden metabolitra. A téves replikáció elkerülése érdekében a beteget akadályként vettük fel a limma-tervbe. A különböző betegek közötti metabolitok közötti különbségek ellenőrzése érdekében a limma modellt rögzített módon vettük figyelembe. Jelentjük a sejttípus és a Padj <0,05 mikro-környezet közötti előre meghatározott kontraszt szignifikanciáját (Benjamini-Hochberg korrekció).
Miltenyi Dead Cell Removal Kit segítségével végzett vigor dúsítás után (>80% életképesség), egysejtű transzkriptom szekvenálást végeztünk a teljes élő, fagyasztott ascites és tumor mintákon 10x 5'-gén expressziós protokollal. Öt, egyező tumorral és ascitesszel rendelkező esetet elemeztünk, bár az egyik tumorminta alacsony életképessége megakadályozta a bevonását. A betegek többszörös kiválasztása érdekében a 10x krómkontroller sávjaiban egyesítettük az egyes betegek mintáit, és külön elemeztük az ascites és a tumor helyeket. Szekvenálás után [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp párosított vég (PE), Quebec genom; átlagosan 73 488, illetve 41 378 leolvasás sejtenként tumor és ascites esetén]], CellSNP és Vireo (53) programokat használtunk (a CellSNP alapján, mivel a GRCh38 által biztosított közös emberi SNP (VCF) donor identitáshoz van rendelve. Az SNPRelate programot használjuk a beteg genotípus státuszának (IBS) legközelebbi azonosságának (IBS) megállapítására, kizárva a nem hozzárendelt sejteket és a duplexként azonosított sejteket, valamint az ascites és a tumor minták közötti donorok egyeztetését (54). E feladat alapján három, a tumorban és az ascitesben bőséges sejtreprezentációval rendelkező esetet tartottunk meg a downstream elemzéshez. Miután tömeges szűrési lépést végeztünk a scater (55) és scran (56) BioConductor csomagolásban, 6975 sejtet (2792, illetve 4183 sejtet a tumorból, illetve az ascitesből) kaptunk az elemzéshez. Az igraph (57) Louvain-klaszterezését használtuk a megosztott legközelebbi szomszéd hálózat (SNN) számára, a Jaccard távolság alapján a klasztersejtektől expresszió szerint. A A klasztereket manuálisan annotálták a feltételezett sejttípusokhoz a markergén expressziója alapján, és t-SNE-vel vizualizálták. A citotoxikus T-sejteket a CD8A és a GZMA expressziója határozza meg, kizárva az alacsony riboszomális fehérjeexpressziójú alklasztereket. Izar és munkatársai (16) publikált adatait használtuk, beleértve a t-SNE beágyazódásukat is, amely szabályozhatja az immunsejt markerek és az NNMT expresszió közötti expressziós átfedést.
A PBMC-ket Ficoll gradiens sűrűségcentrifugálással választottuk el a leukocita elválasztási termékektől (STEMCELL Technologies). A CD3+ sejteket CD3 gyöngyökkel (Miltenyi) izoláltuk a PBMC-ből. MNA jelenlétében vagy hiányában a CD3+ sejteket lemezhez kötött CD3-mal (5μg/ml), oldható CD28-cal (3μg/ml) és IL-2-vel (300 U/ml; Proleukin) aktiváltuk. Az expanzió utolsó napján az életképességet (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) és a proliferációt (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) áramlási citometriával értékeltük. Az effektor funkció értékeléséhez stimuláljuk a sejteket PMA-val (20 ng/ml) és ionomicinnel (1 μg/ml) GolgiStop segítségével 4 órán át, majd monitorozzuk a CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) és TNFα-fluoreszcein-izotiocianát (FITC) (MAb11, BD) szintjét. Stimuláljuk a qPCR és ChIP sejteket PMA-val (20 ng/ml) és ionomicinnel (1 μg/ml) 4 órán át. Az ELISA felülúszót a PMA-val (20 ng/ml) és ionomicinnel (1 μg/ml) 4 órán át történő stimuláció előtt és után gyűjtöttük.
Az RNS izolálásához RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) segítségével kövesse a gyártó protokollját. A minta homogenizálásához használja a QIAshredder (QIAGEN) készüléket. A komplementer DNS (cDNS) szintéziséhez használjon nagy kapacitású RNS-cDNS kitet (Thermo Fisher Scientific). A génexpresszió mennyiségi meghatározásához használja a TaqMan Rapid Advanced Master Mix-et (Thermo Fisher Scientific) (a gyártó protokollja szerint) a következő próbákkal: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldehid-3-foszfát hidrogén előállítása nélkül (GAPDH)] és Hs01010726_m1 (SLC22A2). A mintákat a StepOnePlus valós idejű PCR rendszeren (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) futtatták MicroAmp gyors optikai 96-lyukú reakciólemezen (Applied Biosystems) MicroAmp optikai filmmel. A 35-nél nagyobb Ct-értékeket a kimutatási küszöb felettinek tekintik, és kimutathatatlanként jelölik.
A ChIP-et a korábban leírtak szerint végezzük (58). Röviden, a sejteket formaldehiddel kezeltük (végső koncentráció 1,42%), és szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk. Használjunk kiegészített duzzasztópuffert (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl és 0,1% NP-40) jégen 10 percig, majd a leírtak szerint reszuszpendáljuk immunprecipitációs pufferben (58). A mintát ezután a következő ciklusokkal ultrahanggal kezeltük: 10 ciklus (20 1 másodperces impulzus) és 40 másodperces statikus idő. Inkubáljunk ChIP-minőségű immunglobulin G-t (Cell Signaling Technology; 1 μl), hiszton H3-at (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT-ot (Invitrogen; 3 μl) és SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) antitesteket a mintával 4°C-on, majd egy éjszakán át rázatjuk. Inkubáljuk a protein A gyöngyöket (Thermo Fisher Scientific) a mintával 4°C-on, gyengéd rázogatás mellett 1 órán át, majd chelex gyöngyökkel (Bio-Rad) dúsítsuk a DNS-t, és proteináz K-val (Thermo Fisher) emésztsük a fehérjét. A TNFα promótert PCR-rel detektáltuk: előre, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; ellenkezőleg, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207 bp-os termék). A képeket az Image Lab (Bio-Rad) készítette, és ImageJ szoftverrel kvantifikáltuk.
A sejtkultúra felülúszóját a fent leírtak szerint gyűjtöttük össze. A meghatározást a humán TNFα ELISA készlet (Invitrogen), a humán IL-2 ELISA készlet (Invitrogen) és a humán IFN-γ ELISA készlet (Abcam) gyártói eljárásai szerint végeztük. A gyártó protokollja szerint a felülúszót 1:100 arányban hígítottuk a TNFα és az IL-2 kimutatására, illetve 1:3 arányban az IFN-γ kimutatására. Az abszorbancia 450 nm-en történő méréséhez EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) készüléket használtunk.
A PBMC-ket Ficoll gradiens sűrűségcentrifugálással választottuk el a leukocita elválasztási termékektől (STEMCELL Technologies). A CD3+ sejteket CD3 gyöngyökkel (Miltenyi) izoláltuk a PBMC-ből. MNA jelenlétében vagy hiányában a CD3+ sejteket lemezre kötött CD3-mal (5μg/ml), oldható CD28-cal (3μg/ml) és IL-2-vel (300 U/ml; Proleukin) aktiváltuk 3 napig. 3 nap elteltével a sejteket összegyűjtöttük és 0,9%-os sóoldattal mostuk, majd a pelletet gyorsfagyasztottuk. A sejtszámlálást áramlási citometriával (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguráció) végeztük 123count eBeads alkalmazásával.
A metabolitokat a fent leírtak szerint extraháljuk. A szárított kivonatot 4000 sejtegyenérték/μl koncentrációban rekonstituáltuk. A mintát fordított fázisú kromatográfiával (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) és CORTECS T3 oszloppal (2,1×150 mm, részecskeméret 1,6 μm, pórusméret 120 Å; #186008500, Waters) elemezzük. Poláris tömegspektrométer (6470, Agilent), amelyben az elektrospray ionizáció pozitív módban működik. Az A mozgófázis 0,1% hangyasav (H2O-ban), a B mozgófázis 90% acetonitril, 0,1% hangyasav. Az LC gradiens 0-2 perc 100% A esetén, 2-7,1 perc 99% B esetén és 7,1-8 perc 99% B esetén. Ezután az oszlopot újra ekvilibráljuk az A mozgófázissal 0,6 ml/perc áramlási sebességgel 3 percig. Az áramlási sebesség 0,4 ml/perc, és az oszlopkamrát 50°C-ra melegítjük. Az MNA tiszta kémiai standardját (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) használjuk a retenciós idő (RT) és az átalakulás (RT = 0,882 perc, 1. átalakulás = 137→94,1, 2. átalakulás = 137→92, 3. konverzió = 137→78) meghatározásához. Amikor mindhárom átmenet a megfelelő retenciós időben történik, az 1. átalakulás segítségével határozzuk meg a specificitást. Az MNA (Toronto Research Chemical Company) standard görbéjét a törzsoldat (1 mg/ml) hat sorozathígításával állítottuk elő, így 0,1, 1,0, 10 és 100 ng/ml, illetve 1,0 és 10 μg/ml koncentrációjú folyadék standardokat kaptunk. A kimutatási határ 1 ng/ml, a lineáris válasz 10 ng/ml és 10 μg/ml között van. Az LC/MS analízishez a minta és a standard minden egyes injekcióját két mikroliterre injektáltuk, és nyolcadik injekcióként kevert minőségellenőrzési mintát futtattunk az analízis platform stabilitásának biztosítása érdekében. Az összes MNA-val kezelt sejtminta MNA-válasza a vizsgálat lineáris tartományán belül volt. Az adatelemzést MassHunter kvantitatív elemző szoftverrel (v9.0, Agilent) végeztük.
A második generációs αFR-CAR konstrukciót Song és munkatársai (59) kutatásából vettük át. Röviden, a konstrukció a következőket tartalmazza: CD8a vezető szekvencia, humán αFR-specifikus egyláncú variábilis fragmens, CD8a csukló- és transzmembrán régió, CD27 intracelluláris domén és CD3z intracelluláris domén. A teljes CAR szekvenciát GenScript segítségével szintetizáltuk, majd a transzdukciós hatékonyság értékelésére használt GFP expressziós kazetta előtti második generációs lentivirális expressziós vektorba klónoztuk.
A lentivírust HEK293T sejtek transzfekciójával állítják elő [American Type Culture Collection (ATCC); Dulbecco-féle módosított Eagle táptalajon tenyésztik, amely 10% magzati szarvasmarha-szérumot (FBS) és 1% PenStrep-et tartalmaz, CAR-GFP vektort használnak, a csomagoló plazmidok (psPAX2 és pMD2.G, Addgene) pedig lipofekciós amint (Sigma-Aldrich) használnak. A vírust tartalmazó felülúszót a transzfekció után 48 és 72 órával gyűjtötték össze, szűrték, majd ultracentrifugálással koncentrálták. A koncentrált vírusfelülúszót -80°C-on tárolják a transzdukcióig.
A PBMC-ket egészséges donor leukocita elválasztási termékeitől (STEMCELL Technologies) Ficoll gradiens sűrűségcentrifugálással választják el. Pozitív szelekciós CD8 mikrogyöngyöket (Miltenyi) használnak a CD8+ sejtek PBMC-ből történő izolálására. A T-sejteket TransAct-tal (Miltenyi) és TexMACS táptalajban [Miltenyi; 3% hővel inaktivált humán szérummal, 1% PenStrep-pel és IL-2-vel (300 U/ml) kiegészítve] stimulálják. A stimulációt követő huszonnégy órában a T-sejteket lentivírussal transzdukálják (10 μl koncentrált vírus felülúszó 106 sejtenként). A Cytek Aurorán történő transzdukció után 1-3 nappal (FSC (előre szórás)/SSC (oldalra szórás), Singlet, GFP+) kimutatták, hogy a sejtek GFP expressziója legalább 30%-os.
A CAR-T sejteket 24 órán át Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep-pel kiegészítve) táptalajban tenyésztettük a következő körülmények között: kezeletlen, 250 μM adenozinnal vagy 10 mM MNA-val kezelt. Az előkezelés után a CAR-T sejteket PBS-sel mostuk, majd 20 000 SK-OV-3 sejttel [ATCC; McCoy 5A táptalajban (Sigma-Aldrich), 10% FBS-sel és 1% PenStrep-pel kiegészítve, 10:1-es koncentrációban kombináltuk. Az effektor:célpont arányt 1-nek megfelelő értékre állítottuk be, triplikátumban, kiegészített Immunocult táptalajban. Negatív, illetve pozitív kontrollként SK-OV-3 sejteket és digitálisz szaponinnal (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) lizált SK-OV-3 sejteket használtunk. 24 órás együttes tenyésztés után a felülúszót összegyűjtöttük, és a laktát-dehidrogenáz (LDH) szintjét a gyártó utasításai szerint mértük (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Az LDH felülúszót 1:50 arányban hígítottuk LDH pufferben. Az elölés százalékos arányát a következő képlettel mértük: elölés százalékos aránya = korrekció százalékos aránya / maximális elölési arány x 100%, ahol korrekció százalékos aránya = csak T-sejtek együttes kultúrája, és maximális elölési arány = pozitív kontroll-negatív kontroll.
A szövegben vagy az anyagokban és módszerekben leírtak szerint a statisztikai elemzéshez GraphPad Prism 8, Microsoft Excel vagy R v3.6.0 programot kell használni. Ha ugyanattól a betegtől több mintát veszünk (például ascites és tumor), párosított t-próbát alkalmazunk, vagy a beteget véletlenszerű hatásként vonjuk be egy lineáris vagy általánosított modellbe, az adott esettől függően. Metabolomikai elemzés esetén a fontossági tesztet háromszor végezzük el.
A cikkhez kapcsolódó kiegészítő anyagokért kérjük, látogassa meg a http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 weboldalt.
Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, amely a Creative Commons Nevezd meg! – Ne add el! Licenc feltételei szerint kerül terjesztésre, amely lehetővé teszi a felhasználást, terjesztést és sokszorosítást bármilyen médiumban, feltéve, hogy a végső felhasználás nem kereskedelmi célú, és a feltétel az, hogy az eredeti mű helyes. Hivatkozás.
Megjegyzés: Csak azért kérjük az e-mail címed megadását, hogy az oldalra ajánlott személy tudja, hogy szeretnéd, ha látná az e-mailt, és hogy az nem spam. Nem fogunk rögzíteni semmilyen e-mail címet.
Ez a kérdés arra szolgál, hogy teszteljük, látogató-e, és megakadályozzuk az automatikus spamküldést.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J.B.R. De Bellard. G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
Az MNA hozzájárul a T-sejtek immunszuppressziójához, és potenciális immunterápiás célpontot jelent az emberi rák kezelésében.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J.B.R. De Bellard. G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
Az MNA hozzájárul a T-sejtek immunszuppressziójához, és potenciális immunterápiás célpontot jelent az emberi rák kezelésében.
©2021 American Association for the Advancement of Science. minden jog fenntartva. Az AAAS a HINARI, az AGORA, az OARE, a CHORUS, a CLOCKSS, a CrossRef és a COUNTER partnere. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.