A propionsav (PPA), egy gombaellenes szer és gyakori étrend-kiegészítő, egerekben rendellenes neurofejlődést okoz, amit gyomor-bélrendszeri diszfunkció kísér, amit a bél diszbiózisa okozhat. Felmerült már az összefüggés az étrendi PPA-expozíció és a bél mikrobiota diszbiózisa között, de ezt közvetlenül még nem vizsgálták. Jelen tanulmányunkban a bél mikrobiota összetételében a PPA-val összefüggő változásokat vizsgáltuk, amelyek diszbiózishoz vezethetnek. Kezeletlen diétával (n=9) és PPA-val dúsított diétával (n=13) etetett egerek bél mikrobiomját hosszú távú metagenomikai szekvenálással szekvenáltuk, hogy felmérjük a mikrobiális összetétel és a bakteriális anyagcsere-útvonalak közötti különbségeket. Az étrendi PPA jelentős taxonok, köztük számos Bacteroides, Prevotella és Ruminococcus faj számának növekedésével járt együtt, amelyek tagjait korábban már összefüggésbe hozták a PPA-termeléssel. A PPA-nak kitett egerek mikrobiomjában több, a lipidanyagcseréhez és a szteroid hormon bioszintézishez kapcsolódó útvonal is volt. Eredményeink azt mutatják, hogy a PPA megváltoztathatja a bél mikrobiotát és a hozzá kapcsolódó metabolikus útvonalakat. Ezek a megfigyelt változások rávilágítanak arra, hogy a fogyasztásra biztonságosnak minősített tartósítószerek befolyásolhatják a bélmikrobiota összetételét, és ezáltal az emberi egészséget. Ezek közül a P, G vagy S kerül kiválasztásra az elemzett osztályozási szinttől függően. A téves pozitív osztályozások hatásának minimalizálása érdekében 1e-4 (1/10 000 leolvasás) minimális relatív abundancia küszöbértéket alkalmaztunk. A statisztikai elemzés előtt a Bracken által jelentett relatív abundancia értékeket (fraction_total_reads) a centrált log-ratio (CLR) transzformációval transzformáltuk (Aitchison, 1982). A CLR módszert választottuk az adattranszformációhoz, mert skálainvariáns és megfelelő a nem ritka adathalmazokhoz (Gloor et al., 2017). A CLR transzformáció a természetes logaritmust használja. A Bracken által jelentett darabszám adatokat a relatív logaritmikus kifejezéssel (RLE) normalizáltuk (Anders és Huber, 2010). Az ábrákat a matplotlib v. 3.7.1, a seaborn v. 3.7.2 és a szekvenciális logaritmusok kombinációjával generáltuk (Gloor et al., 2017). 0.12.2 és stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). A Bacillus/Bacteroidetes arányt minden mintára normalizált baktériumszámok segítségével számítottuk ki. A táblázatokban közölt értékek 4 tizedesjegyre kerekítettük. A Simpson diverzitási indexet a KrakenTools v. 1.2 csomagban található alpha_diversity.py szkripttel számítottuk ki (Lu et al., 2022). A szkriptben Bracken-jelentés található, az -an paraméterhez pedig az „Si” Simpson indexet adtuk meg. Az abundancia szignifikáns különbségeit ≥ 1 vagy ≤ -1 átlagos CLR-különbségként definiáltuk. A ±1 átlagos CLR-különbség a mintatípus abundancia 2,7-szeres növekedését jelzi. A (+/-) jel azt jelzi, hogy a taxon a PPA mintában, illetve a kontroll mintában van-e nagyobb mennyiségben jelen. A szignifikanciát Mann-Whitney U-teszttel határoztuk meg (Virtanen et al., 2020). A Statsmodels v. 0.14-et (Benjamini és Hochberg, 1995; Seabold és Perktold, 2010) használtuk, és a Benjamini-Hochberg eljárást alkalmaztuk a többszörös tesztelés korrigálására. A statisztikai szignifikancia meghatározásához küszöbértékként 0,05 vagy annál kisebb korrigált p-értéket használtunk.
Az emberi mikrobiomot gyakran „a test utolsó szervének” nevezik, és létfontosságú szerepet játszik az emberi egészségben (Baquero és Nombela, 2012). Különösen a bélmikrobiom ismert rendszerszintű befolyásáról és számos alapvető funkcióban betöltött szerepéről. A kommenzális baktériumok nagy számban fordulnak elő a bélben, több ökológiai fülkét foglalnak el, tápanyagokat használnak fel, és versengenek a potenciális kórokozókkal (Jandhyala et al., 2015). A bélmikrobiota változatos bakteriális összetevői képesek esszenciális tápanyagok, például vitaminok előállítására és az emésztés elősegítésére (Rowland et al., 2018). A bakteriális metabolitokról azt is kimutatták, hogy befolyásolják a szövetek fejlődését, és fokozzák az anyagcsere- és immunrendszer működését (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Az emberi bélmikrobiom összetétele rendkívül változatos, és olyan genetikai és környezeti tényezőktől függ, mint az étrend, a nem, a gyógyszerek és az egészségi állapot (Kumbhare et al., 2019).
Az anyai étrend kritikus fontosságú a magzati és újszülöttkori fejlődésben, és feltételezhetően olyan vegyületek forrása, amelyek befolyásolhatják a fejlődést (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Az egyik ilyen érdekes vegyület a propionsav (PPA), egy rövid szénláncú zsírsav melléktermék, amelyet bakteriális fermentáció során nyernek, és élelmiszer-adalékanyag (den Besten et al., 2013). A PPA antibakteriális és gombaellenes tulajdonságokkal rendelkezik, ezért élelmiszer-tartósítószerként és ipari alkalmazásokban a penész- és baktériumnövekedés gátlására használják (Wemmenhove et al., 2016). A PPA-nak eltérő hatásai vannak a különböző szövetekben. A májban a PPA gyulladáscsökkentő hatású azáltal, hogy befolyásolja a citokinek expresszióját a makrofágokban (Kawasoe et al., 2022). Ezt a szabályozó hatást más immunsejtekben is megfigyelték, ami a gyulladás szabályozásának csökkenéséhez vezet (Haase et al., 2021). Az agyban azonban az ellenkező hatást figyelték meg. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a PPA-expozíció autizmusszerű viselkedést vált ki egerekben (El-Ansary et al., 2012). Más tanulmányok kimutatták, hogy a PPA gliózist indukálhat és aktiválhatja a gyulladáskeltő utakat az agyban (Abdelli et al., 2019). Mivel a PPA egy gyenge sav, a bélhámszöveten keresztül bejuthat a véráramba, és így átjuthat a korlátozó akadályokon, beleértve a vér-agy gátat, valamint a méhlepényt is (Stinson et al., 2019), kiemelve a PPA fontosságát, mint baktériumok által termelt szabályozó metabolitot. Bár a PPA autizmus kockázati tényezőjeként betöltött potenciális szerepét jelenleg vizsgálják, az autista egyénekre gyakorolt hatásai túlmutathatnak az idegi differenciálódás kiváltásán.
Az olyan gyomor-bélrendszeri tünetek, mint a hasmenés és a székrekedés, gyakoriak a neurofejlődési rendellenességekben szenvedő betegeknél (Cao et al., 2021). Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az autizmus spektrumzavarral (ASD) élő betegek mikrobiomja eltér az egészséges egyénekétől, ami a bélmikrobiota diszbiózis jelenlétére utal (Finegold et al., 2010). Hasonlóképpen, a gyulladásos bélbetegségekben, elhízásban, Alzheimer-kórban stb. szenvedő betegek mikrobiomjának jellemzői is eltérnek az egészséges egyénekétől (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). A mai napig azonban nem állapítottak meg ok-okozati összefüggést a bélmikrobiom és a neurológiai betegségek vagy tünetek között (Yap et al., 2021), bár úgy gondolják, hogy számos baktériumfaj játszik szerepet ezen betegségek némelyikében. Például az Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio és más nemzetségek nagyobb mennyiségben vannak jelen az autizmussal élő betegek mikrobiotájában (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Figyelemre méltó, hogy ezen nemzetségek egyes fajairól ismert, hogy a PPA-termeléssel összefüggő génekkel rendelkeznek (Reichardt et al., 2014; Yun és Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur és Dürre, 2023). A PPA antimikrobiális tulajdonságai miatt a mennyiségének növelése előnyös lehet a PPA-termelő baktériumok növekedése szempontjából (Jacobson et al., 2018). Így a PFA-ban gazdag környezet változásokhoz vezethet a bélmikrobiotában, beleértve a gyomor-bélrendszeri kórokozókat is, amelyek potenciális tényezők lehetnek a gyomor-bélrendszeri tünetek kialakulásához.
A mikrobiom-kutatás egyik központi kérdése, hogy a mikrobiális összetételbeli különbségek vajon okai vagy tünetei az alapbetegségeknek. Az étrend, a bélmikrobiom és a neurológiai betegségek közötti összetett kapcsolat tisztázása felé az első lépés az étrend mikrobiális összetételre gyakorolt hatásának felmérése. Ennek érdekében hosszú leolvasású metagenomikai szekvenálást alkalmaztunk a PPA-gazdag vagy PPA-szegény étrenddel etetett egerek utódainak bélmikrobiomjának összehasonlítására. Az utódokat ugyanazzal a táplálékkal etettük, mint az anyjukat. Azt feltételeztük, hogy a PPA-gazdag étrend változásokat eredményez a bélmikrobiális összetételben és a mikrobiális funkcionális útvonalakban, különösen azokban, amelyek a PPA-anyagcserével és/vagy a PPA-termeléssel kapcsolatosak.
Ez a tanulmány FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J transzgénikus egereket (Jackson Laboratories) használt, amelyek a glia-specifikus GFAP promóter szabályozása alatt túltermelik a zöld fluoreszcens fehérjét (GFP), a Közép-Floridai Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának (UCF-IACUC) irányelveit követve (állatfelhasználási engedély száma: PROTO202000002). Az elválasztás után az egereket egyenként ketrecekben helyezték el, nemenként 1-5 egérrel. Az egereket szabadon etették tisztított kontroll étrenddel (módosított, nyílt címkézésű standard étrend, 16 kcal% zsírtartalommal) vagy nátrium-propionáttal kiegészített étrenddel (módosított, nyílt címkézésű standard étrend, 16 kcal% zsírtartalommal, 5000 ppm nátrium-propionáttal). A felhasznált nátrium-propionát mennyisége 5000 mg PFA/kg teljes tápláléktömegnek felelt meg. Ez a PPA legmagasabb koncentrációja, amelyet élelmiszer-tartósítószerként engedélyeztek. A vizsgálat előkészítéseként a szülő egereket mindkét étrenddel etették 4 hétig a párzás előtt, majd az anya vemhesség alatt végig. Az utód egereket [22 egér, 9 kontroll (6 hím, 3 nőstény) és 13 PPA (4 hím, 9 nőstény)] elválasztották, majd 5 hónapig ugyanazon a étrenden folytatták, mint az anyákat. Az utód egereket 5 hónapos korban leölték, bélürüléküket összegyűjtötték és kezdetben 1,5 ml-es mikrocentrifuga csövekben tárolták -20°C-on, majd -80°C-os fagyasztóba helyezték, amíg a gazda DNS-e ki nem merült, és a mikrobiális nukleinsavakat ki nem vonták.
A gazdaszervezet DNS-ét módosított protokoll szerint távolítottuk el (Charalampous et al., 2019). Röviden, a széklet tartalmát 500 µl InhibitEX-be (Qiagen, Cat#/ID: 19593) vittük át, és fagyasztva tároltuk. Extrakciónként maximum 1-2 székletpelletet dolgoztunk fel. A széklet tartalmát ezután mechanikusan homogenizáltuk egy műanyag mozsártörővel a csőben, hogy szuszpenziót kapjunk. Centrifugáltuk a mintákat 10 000 RCF-en 5 percig, vagy amíg a minták pelletizálódnak, majd szívjuk le a felülúszót, és szuszpendáljuk újra a pelletet 250 µl 1× PBS-ben. Adjunk 250 µl 4,4%-os szaponinoldatot (TCI, termékszám S0019) a mintához detergensként az eukarióta sejtmembránok fellazítására. A mintákat óvatosan kevertük, amíg sima nem lett, majd szobahőmérsékleten inkubáltuk 10 percig. Ezután az eukarióta sejtek roncsolása érdekében 350 μl nukleázmentes vizet adtunk a mintához, 30 másodpercig inkubáltuk, majd 12 μl 5 M NaCl-t adtunk hozzá. A mintákat ezután 6000 RCF-en 5 percig centrifugáltuk. A felülúszót leszívtuk, és a pelletet 100 μl 1X PBS-ben reszuszpendáltuk. A gazdaszervezet DNS-ének eltávolításához adtunk hozzá 100 μl HL-SAN puffert (12,8568 g NaCl, 4 ml 1 MgCl2, 36 ml nukleázmentes víz) és 10 μl HL-SAN enzimet (ArticZymes P/N 70910-202). A mintákat pipettázással alaposan összekevertük, majd 37 °C-on 30 percig 800 fordulat/perc sebességgel inkubáltuk egy Eppendorf™ ThermoMixer C készülékben. Az inkubálás után 6000 RCF-fel 3 percig centrifugáltuk, majd kétszer mostuk 800 µl és 1000 µl 1X PBS-sel. Végül a pelletet 100 µl 1X PBS-ben reszuszpendáltuk.
A teljes bakteriális DNS-t a New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L) segítségével izoláltuk. A készlethez mellékelt standard működési eljárás kissé módosított. A végső elúcióhoz a művelet előtt inkubáljuk és tartsuk 60°C-on nukleázmentes vizet. Adjunk 10 µl Proteinase K-t és 3 µl RNase A-t minden mintához. Ezután adjunk hozzá 100 µl sejtlízis puffert, és óvatosan keverjük össze. A mintákat ezután Eppendorf™ ThermoMixer C-ben inkubáltuk 56°C-on és 1400 fordulat/perc sebességgel legalább 1 órán át, de legfeljebb 3 órán át. Az inkubált mintákat 12 000 RCF-fel centrifugáltuk 3 percig, és az egyes minták felülúszóját egy külön 1,5 ml-es mikrocentrifuga csőbe vittük át, amely 400 µl kötőoldatot tartalmazott. A csöveket ezután 5-10 másodpercig, 1 másodperces időközönként vortexeltük. Minden egyes minta teljes folyadéktartalmát (körülbelül 600–700 µL) vigye át egy átfolyó gyűjtőcsőbe helyezett szűrőbetétbe. A csöveket 3 percig 1000 RCF-fel centrifugálta a kezdeti DNS-kötés lehetővé tétele érdekében, majd 1 percig 12 000 RCF-fel centrifugálta a maradék folyadék eltávolítása érdekében. A mintaoszlopot egy új gyűjtőcsőbe tette át, majd kétszer mosta. Az első mosáshoz adjon 500 µL mosópuffert minden csőbe. Fordítsa meg a csövet 3-5 alkalommal, majd centrifugálja 12 000 RCF-fel 1 percig. Öntse ki a folyadékot a gyűjtőcsőből, és helyezze vissza a szűrőbetétet ugyanabba a gyűjtőcsőbe. A második mosáshoz adjon 500 µL mosópuffert a szűrőhöz megfordítás nélkül. A mintákat 1 percig 12 000 RCF-fel centrifugálta. Helyezze át a szűrőt egy 1,5 ml-es LoBind® csőbe, és adjon hozzá 100 µL előmelegített nukleázmentes vizet. A szűrőket szobahőmérsékleten 1 percig inkubáltuk, majd 12 000 RCF-fel 1 percig centrifugáltuk. Az eluált DNS-t -80°C-on tároltuk.
A DNS-koncentrációt Qubit™ 4.0 fluorométerrel határoztuk meg. A DNS-t Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (katalógusszám: Q33231) segítségével készítettük el a gyártó utasításai szerint. A DNS-fragmensek hossz-eloszlását Aglient™ 4150 vagy 4200 TapeStation segítségével mértük. A DNS-t Agilent™ Genomic DNA Reagents (katalógusszám: 5067-5366) és Genomic DNA ScreenTape (katalógusszám: 5067-5365) segítségével készítettük el. A könyvtár előkészítését Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) segítségével végeztük a gyártó utasításai szerint. A DNS-t ONT GridION™ Mk1 szekvenátorral és Min106D áramlási cellával (R 9.4.1) szekvenáltuk. A szekvenálási beállítások a következők voltak: nagy pontosságú bázisazonosítás, minimális q érték 9, vonalkód beállítás és vonalkód vágás. A mintákat 72 órán át szekvenálták, majd a bázisazonosító adatokat további feldolgozásra és elemzésre nyújtották be.
A bioinformatikai feldolgozást korábban leírt módszerekkel végeztük (Greenman et al., 2024). A szekvenálásból származó FASTQ fájlokat mintánként könyvtárakba osztottuk. A bioinformatikai elemzés előtt az adatokat a következő folyamattal dolgoztuk fel: először a minták FASTQ fájljait egyetlen FASTQ fájlba egyesítettük. Ezután az 1000 bp-nál rövidebb leolvasásokat a Filtlong v. 0.2.1 programmal szűrtük, az egyetlen módosított paraméter a –min_length 1000 volt (Wick, 2024). A további szűrés előtt az leolvasási minőséget a NanoPlot v. 1.41.3 programmal ellenőriztük a következő paraméterekkel: –fastq –plots dot –N50 -o
A taxonómiai osztályozáshoz a leolvasott és az összeállított kontigokat a Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019) segítségével osztályoztuk. Jelentéseket és kimeneti fájlokat generáljunk a leolvasott és az összeállítások számára. A –use-names opciót használjuk a leolvasott és az összeállítások elemzéséhez. A –gzip-compressed és a –paired opciók vannak megadva az olvasott szegmensekhez. A taxonok relatív abundanciáját a metagenomokban a Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017) segítségével becsültük meg. Először létrehoztunk egy 1000 bázist tartalmazó kmer adatbázist a bracken-build segítségével a következő paraméterekkel: -d
A génannotációt és a relatív abundancia becslését Maranga és munkatársai által leírt protokoll módosított változatával végeztük (Maranga és munkatársai, 2023). Először az 500 bp-nál rövidebb kontigokat eltávolítottuk az összes összeállításból a SeqKit v. 2.5.1 (Shen és munkatársai, 2016) segítségével. A kiválasztott összeállításokat ezután egy pan-metagenomba egyesítettük. A nyitott leolvasási kereteket (ORF) a Prodigal v. 1.0.1 (a Prodigal v. 2.6.3 párhuzamos verziója) segítségével azonosítottuk a következő paraméterekkel: -d
A géneket először a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ortológ (KO) azonosítók szerint csoportosítottuk, melyeket az eggNOG rendelt hozzá a génútvonalak gyakoriságának összehasonlításához. A knockout nélküli vagy a többszörös knockout géneket az elemzés előtt eltávolítottuk. Ezután kiszámítottuk az egyes KO-k átlagos gyakoriságát mintánként, és statisztikai elemzést végeztünk. A PPA-metabolizmus géneket olyan génként definiáltuk, amelyhez a KEGG_Pathway oszlopban a ko00640 sort rendeltük, jelezve a propionát-anyagcserében betöltött szerepét a KEGG szerint. A PPA-termeléssel összefüggésben azonosított géneket az 1. kiegészítő táblázat sorolja fel (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Permutációs teszteket végeztünk az egyes mintatípusokban szignifikánsan nagyobb mennyiségben előforduló PPA-metabolizmus és -termelés génjeinek azonosítására. Minden elemzett génhez ezer permutációt végeztünk. A statisztikai szignifikancia meghatározásához 0,05 p-értéket használtunk határértékként. A klaszteren belüli egyes génekhez funkcionális annotációkat rendeltünk a klaszteren belüli reprezentatív gének annotációi alapján. A PPA-anyagcserével és/vagy PPA-termeléssel kapcsolatos taxonok azonosíthatók voltak a Kraken2 kimeneti fájljaiban található kontigazonosítók és az eggNOG segítségével a funkcionális annotáció során megtartott ugyanazon kontigazonosítók összehasonlításával. A szignifikanciavizsgálatot a korábban leírt Mann-Whitney U teszttel végeztük. A többszörös tesztelés korrekcióját a Benjamini-Hochberg eljárással végeztük. A statisztikai szignifikancia meghatározásához ≤ 0,05 p-értéket használtunk határértékként.
Az egerek bélmikrobiomjának diverzitását a Simpson diverzitási index segítségével értékelték. Nem figyeltek meg szignifikáns különbséget a kontroll és a PPA minták között a nemzetség és a fajok diverzitását tekintve (p-érték a nemzetségre: 0,18, p-érték a fajokra: 0,16) (1. ábra). A mikrobiális összetételt ezután főkomponens-analízissel (PCA) hasonlították össze. A 2. ábra a minták törzseik szerinti csoportosítását mutatja, ami azt jelzi, hogy különbségek voltak a mikrobiomok fajösszetételében a PPA és a kontroll minták között. Ez a csoportosítás kevésbé volt kifejezett a nemzetség szintjén, ami arra utal, hogy a PPA bizonyos baktériumokat érint (1. kiegészítő ábra).
1. ábra. A nemzetségek (A) és fajok (B) alfa-diverzitásának és az egér bélmikrobiomjának fajösszetételének ábrázolása. A dobozdiagramok a nemzetségek (A) és fajok (B) Simpson-diverzitási indexeit mutatják PPA és kontroll mintákban. A szignifikanciát Mann-Whitney U teszttel határoztuk meg, és többszörös korrekciót végeztünk Benjamini-Hochberg eljárással. ns, p-érték nem volt szignifikáns (p>0,05).
2. ábra. Az egér bélmikrobiom összetételének főkomponens-elemzésének eredményei faji szinten. A főkomponens-elemzési grafikon a minták első két főkomponens szerinti eloszlását mutatja. A színek a minta típusát jelzik: a PPA-nak kitett egerek lilák, a kontroll egerek pedig sárgák. Az 1. és 2. főkomponenst az x és y tengelyen ábrázoltuk, és magyarázott varianciaarányként fejeztük ki.
Az RLE transzformált számlálási adatok felhasználásával a kontroll és a PPA egerekben a Bacteroidetes/Bacillus arány mediánjának szignifikáns csökkenését figyelték meg (kontroll: 9,66, PPA: 3,02; p-érték = 0,0011). Ez a különbség a PPA egerekben a kontrollokhoz képest nagyobb Bacteroidetes mennyiségnek köszönhető, bár a különbség nem volt szignifikáns (kontroll átlagos CLR: 5,51, PPA átlagos CLR: 6,62; p-érték = 0,054), míg a Bacteroidetes mennyisége hasonló volt (kontroll átlagos CLR: 7,76, PPA átlagos CLR: 7,60; p-érték = 0,18).
A bélmikrobiom taxonómiai tagjainak abundancia elemzése kimutatta, hogy 1 törzs és 77 faj szignifikánsan különbözött a PPA és a kontroll minták között (2. kiegészítő táblázat). A PPA mintákban 59 faj abundancia szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll mintákban, míg a kontroll mintákban mindössze 16 faj abundancia volt magasabb, mint a PPA mintákban (3. ábra).
3. ábra. A taxonok eltérő abundancia-értéke PPA és kontroll egerek bélmikrobiomjában. A vulkándiagramok a nemzetségek (A) vagy fajok (B) abundancia-különbségeit mutatják a PPA és a kontroll minták között. A szürke pontok azt jelzik, hogy nincs szignifikáns különbség a taxonok abundancia-értékében. A színes pontok a abundancia szignifikáns különbségeit jelzik (p-érték ≤ 0,05). A mintatípusok között a legnagyobb abundancia-különbséget mutató 20 taxont piros, illetve világoskék színnel jelöltük (kontroll és PPA minták). A sárga és lila pontok legalább 2,7-szer nagyobb mennyiségben voltak jelen a kontroll vagy a PPA mintákban, mint a kontrollokban. A fekete pontok a szignifikánsan eltérő abundancia-értékeket mutató taxonokat jelölik, az átlagos CLR-különbség -1 és 1 között volt. A P-értékeket Mann-Whitney U-teszttel számítottuk ki, és Benjamini-Hochberg eljárással korrigáltuk a többszörös tesztelésre. A vastag betűvel szedett átlagos CLR-különbségek a abundancia szignifikáns különbségeit jelzik.
A bélmikrobiális összetétel elemzése után elvégeztük a mikrobiom funkcionális annotációját. Az alacsony minőségű gének kiszűrése után összesen 378 355 egyedi gént azonosítottunk az összes mintában. Ezen gének transzformált abunciáját használtuk fel a főkomponens-analízishez (PCA), és az eredmények a mintatípusok magas fokú klaszterezését mutatták funkcionális profiljaik alapján (4. ábra).
4. ábra. PCA eredmények az egér bélmikrobiomjának funkcionális profiljának felhasználásával. A PCA diagram a minták eloszlását mutatja az első két főkomponensük között. A színek a minta típusát jelzik: a PPA-nak kitett egerek lilák, a kontrollegerek pedig sárgák. Az 1. és 2. főkomponenst az x és y tengelyen ábrázoltuk, és magyarázott variancia arányként fejeztük ki.
Ezután megvizsgáltuk a KEGG-kiütések gyakoriságát különböző mintatípusokban. Összesen 3648 egyedi kiütést azonosítottunk, amelyek közül 196 szignifikánsan több volt a kontrollmintákban, és 106 a PPA mintákban (5. ábra). Összesen 145 gént detektáltunk a kontrollmintákban és 61 gént a PPA mintákban, szignifikánsan eltérő gyakorisággal. A lipid- és aminocukor-anyagcseréhez kapcsolódó útvonalak szignifikánsan gazdagabbak voltak a PPA mintákban (3. kiegészítő táblázat). A nitrogén-anyagcseréhez és a kén-relérendszerekhez kapcsolódó útvonalak szignifikánsan gazdagabbak voltak a kontrollmintákban (3. kiegészítő táblázat). Az aminocukor/nukleotid-anyagcseréhez (ko:K21279) és az inozitol-foszfát-anyagcseréhez (ko:K07291) kapcsolódó gének gyakorisága szignifikánsan magasabb volt a PPA mintákban (5. ábra). A kontrollminták szignifikánsan több gént tartalmaztak a benzoát-anyagcseréhez (ko:K22270), a nitrogén-anyagcseréhez (ko:K00368) és a glikolízishez/glükoneogenezishez (ko:K00131) kapcsolódóan (5. ábra).
5. ábra. A KO-k eltérő abundancia-értéke PPA és kontroll egerek bélmikrobiomjában. A vulkándiagram a funkcionális csoportok (KO-k) abundancia-beli különbségeit ábrázolja. A szürke pontok azokat a KO-kat jelölik, amelyek abundancia-értéke nem különbözött szignifikánsan a mintatípusok között (p-érték > 0,05). A színes pontok a abundancia szignifikáns különbségeit jelzik (p-érték ≤ 0,05). A mintatípusok közötti abundancia-értékekben legnagyobb eltérést mutató 20 KO-t piros és világoskék színnel jelöltük, amelyek rendre a kontroll és a PPA mintáknak felelnek meg. A sárga és lila pontok azokat a KO-kat jelölik, amelyek legalább 2,7-szer nagyobb mennyiségben voltak jelen a kontroll és a PPA mintákban. A fekete pontok azokat a KO-kat jelölik, amelyek szignifikánsan eltérő abundancia-értékekkel rendelkeznek, az átlagos CLR-különbség -1 és 1 között van. A P-értékeket Mann-Whitney U-teszttel számítottuk ki, és a Benjamini-Hochberg eljárással korrigáltuk a többszörös összehasonlításokhoz. A NaN azt jelzi, hogy a KO nem tartozik a KEGG egyik útvonalához sem. A vastagon szedett átlagos CLR-különbség-értékek a abundancia szignifikáns különbségeit jelzik. A felsorolt KO-k útvonalaival kapcsolatos részletes információkért lásd a 3. kiegészítő táblázatot.
Az annotált gének közül 1601 gén előfordulása szignifikánsan eltérő volt a mintatípusok között (p ≤ 0,05), és mindegyik gén legalább 2,7-szer nagyobb volt. Ezen gének közül 4 gén a kontrollmintákban, 1597 gén pedig a PPA mintákban volt nagyobb mennyiségben jelen. Mivel a PPA antimikrobiális tulajdonságokkal rendelkezik, megvizsgáltuk a PPA-anyagcsere és -termelés gének előfordulását a mintatípusok között. Az 1332 PPA-anyagcserével kapcsolatos gén közül 27 gén szignifikánsan nagyobb volt a kontrollmintákban, 12 gén pedig a PPA mintákban. A 223 PPA-termeléssel kapcsolatos gén közül 1 gén volt szignifikánsan nagyobb a PPA mintákban. A 6A. ábra tovább mutatja a PPA-anyagcserében részt vevő gének nagyobb előfordulását, a kontrollmintákban szignifikánsan nagyobb előfordulással és nagy hatásméretekkel, míg a 6B. ábra kiemeli azokat az egyes géneket, amelyek szignifikánsan nagyobb előfordulással rendelkeztek a PPA mintákban.
6. ábra. A PPA-val kapcsolatos gének eltérő abundancia-értéke az egér bélmikrobiomjában. A vulkándiagramok a PPA-anyagcserével (A) és a PPA-termeléssel (B) kapcsolatos gének abundancia-különbségeit ábrázolják. A szürke pontok azokat a géneket jelölik, amelyek abundancia-értéke nem különbözött szignifikánsan a mintatípusok között (p-érték > 0,05). A színes pontok a abundancia szignifikáns különbségeit jelzik (p-érték ≤ 0,05). A 20 legnagyobb abundancia-különbséget mutató gént piros, illetve világoskék színnel jelöltük (kontroll és PPA minták). A sárga és lila pontok abundancia-értéke legalább 2,7-szer nagyobb volt a kontroll és a PPA mintákban, mint a kontroll mintákban. A fekete pontok a szignifikánsan eltérő abundancia-értékű géneket jelölik, az átlagos CLR-különbség -1 és 1 között van. A P-értékeket a Mann-Whitney U-teszttel számítottuk ki, és a Benjamini-Hochberg eljárással korrigáltuk a többszörös összehasonlításokra. A gének a nem redundáns génkatalógusban szereplő reprezentatív géneknek felelnek meg. A génnevek a KEGG szimbólumból állnak, amely egy KO gént jelöl. A félkövérrel szedett átlagos CLR-különbségek szignifikánsan eltérő abundancia-értékeket jeleznek. A kötőjel (-) azt jelzi, hogy a génhez nem tartozik szimbólum a KEGG adatbázisban.
A PPA-anyagcserével és/vagy -termeléssel kapcsolatos géneket tartalmazó taxonokat a kontigok taxonómiai azonosságának a gén kontig azonosítójával való összevetésével azonosítottuk. Nemzetség szinten 130 nemzetségben találtunk PPA-anyagcserével, és 61 nemzetségben PPA-termeléssel kapcsolatos géneket (4. kiegészítő táblázat). Azonban egyetlen nemzetség sem mutatott szignifikáns különbséget az abundancia tekintetében (p > 0,05).
Fajszinten 144 baktériumfajnál találtak a PPA-anyagcserével, és 68 baktériumfajnál a PPA-termeléssel kapcsolatos géneket (5. kiegészítő táblázat). A PPA-metabolizálók közül nyolc baktérium mutatott jelentős növekedést a mintatípusok között, és mindegyikük szignifikáns változást mutatott a hatásban (6. kiegészítő táblázat). Az összes azonosított PPA-metabolizáló, amelynél szignifikáns különbség volt a mennyiségben, nagyobb mennyiségben volt jelen a PPA mintákban. A fajszintű osztályozás olyan nemzetségek képviselőit tárta fel, amelyek nem különböztek szignifikánsan a mintatípusok között, beleértve számos Bacteroides és Ruminococcus fajt, valamint a Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus és Alcaligenes polymorpha fajokat. A PPA-termelő baktériumok közül négy baktérium mutatott szignifikáns különbséget a mennyiségben a mintatípusok között. A jelentős különbséget mutató fajok közé tartozott a Bacteroides novorossi, a Duncania dubois, a Myxobacterium enteritidis és a Ruminococcus bovis.
Ebben a tanulmányban a PPA-expozíció hatását vizsgáltuk az egerek bélmikrobiotájára. A PPA különböző válaszreakciókat válthat ki a baktériumokban, mivel bizonyos fajok termelik, más fajok táplálékforrásként használják, vagy antimikrobiális hatással rendelkezik. Ezért a bélrendszerhez táplálékkiegészítőként történő hozzáadása eltérő hatásokkal járhat a toleranciától, az érzékenységtől és a tápanyagforrásként való hasznosítás képességétől függően. Az érzékeny baktériumfajok kiküszöbölhetők, és helyüket olyanok vehetik át, amelyek jobban ellenállnak a PPA-nak, vagy képesek táplálékforrásként hasznosítani azt, ami a bélmikrobiota összetételének változásához vezet. Eredményeink jelentős különbségeket mutattak a mikrobiális összetételben, de az általános mikrobiális sokféleségre nem voltak hatással. A legnagyobb hatásokat fajszinten figyeltük meg, több mint 70 taxon esetében volt szignifikáns különbség a PPA és a kontrollminták mennyiségében (2. kiegészítő táblázat). A PPA-nak kitett minták összetételének további értékelése a mikrobiális fajok nagyobb heterogenitását mutatta ki a nem kitett mintákhoz képest, ami arra utal, hogy a PPA fokozhatja a baktériumok növekedési jellemzőit, és korlátozhatja a PPA-gazdag környezetben túlélő baktériumpopulációkat. Így a PPA szelektíven indukálhat változásokat, ahelyett, hogy széles körű zavart okozna a bélmikrobiota sokféleségében.
Az olyan élelmiszer-tartósítószerek, mint a PPA, korábban már bizonyították, hogy megváltoztatják a bélmikrobiom-összetevők mennyiségét anélkül, hogy befolyásolnák az általános diverzitást (Nagpal et al., 2021). Itt figyeltük meg a legszembetűnőbb különbségeket a Bacteroidetes törzsön belüli Bacteroidetes fajok között (korábban Bacteroidetes néven ismertek), amelyek jelentősen feldúsultak a PPA-nak kitett egerekben. A Bacteroides fajok fokozott mennyisége a fokozott nyálkahártya-lebomlással jár, ami növelheti a fertőzés kockázatát és elősegítheti a gyulladást (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Egy tanulmány megállapította, hogy a Bacteroides fragilis-szel kezelt újszülött hím egerek az autizmus spektrumzavarra (ASD) emlékeztető szociális viselkedést mutattak (Carmel et al., 2023), más tanulmányok pedig kimutatták, hogy a Bacteroides fajok megváltoztathatják az immunaktivitást és autoimmun gyulladásos kardiomiopátiához vezethetnek (Gil-Cruz et al., 2019). A Ruminococcus, Prevotella és Parabacteroides nemzetségekbe tartozó fajok száma szintén jelentősen megnőtt a PPA-nak kitett egerekben (Coretti et al., 2018). Bizonyos Ruminococcus fajok gyulladáskeltő citokinek termelésén keresztül olyan betegségekkel hozhatók összefüggésbe, mint a Crohn-betegség (Henke et al., 2019), míg a Prevotella fajok, mint például a Prevotella humani, olyan anyagcsere-betegségekkel hozhatók összefüggésbe, mint a magas vérnyomás és az inzulinérzékenység (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Végül azt találtuk, hogy a Bacteroidetes (korábban Firmicutes néven ismert) és a Bacteroidetes aránya szignifikánsan alacsonyabb volt a PPA-nak kitett egerekben, mint a kontroll egerekben, a Bacteroidetes fajok nagyobb összabundanciája miatt. Ez az arány korábban a bélhomeosztázis fontos mutatójának bizonyult, és az arány zavarai összefüggésbe hozhatók különféle betegségekkel (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), beleértve a gyulladásos bélbetegségeket is (Stojanov et al., 2020). Összességében a Bacteroidetes törzs fajait érinti leginkább a megemelkedett PPA-szint az étrendben. Ez a PPA-val szembeni nagyobb toleranciának vagy a PPA energiaforrásként való felhasználásának képességének tudható be, ami legalább egy faj, a Hoylesella enocea esetében igaznak bizonyult (Hitch et al., 2022). Alternatív megoldásként az anyai PPA-expozíció fokozhatja a magzati fejlődést azáltal, hogy az egér utódok bélrendszerét fogékonyabbá teszi a Bacteroidetes kolonizációra; azonban a vizsgálatunk felépítése nem tette lehetővé ezt az értékelést.
A metagenomikai tartalom értékelése jelentős különbségeket tárt fel a PPA-anyagcserével és -termeléssel kapcsolatos gének mennyiségében, a PPA-nak kitett egereknél a PPA-termelésért felelős gének nagyobb mennyisége volt megfigyelhető, míg a PPA-nak nem kitett egereknél a PAA-anyagcseréért felelős gének nagyobb mennyisége volt megfigyelhető (6. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a PPA mikrobiális összetételre gyakorolt hatása nem kizárólag a használatának tudható be, ellenkező esetben a PPA-anyagcserével kapcsolatos gének mennyiségének nagyobb mennyiségben kellett volna jelen lennie a PPA-nak kitett egerek bélmikrobiomjában. Az egyik magyarázat az, hogy a PPA elsősorban antimikrobiális hatásain keresztül közvetíti a baktériumok mennyiségét, nem pedig a baktériumok tápanyagként való felhasználása révén. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a PPA dózisfüggő módon gátolja a Salmonella Typhimurium növekedését (Jacobson et al., 2018). A magasabb PPA-koncentrációknak való kitettség olyan baktériumokat szelekciózhat ki, amelyek rezisztensek az antimikrobiális tulajdonságaival szemben, és nem feltétlenül képesek metabolizálni vagy termelni azt. Például számos Parabacteroides faj szignifikánsan magasabb gyakoriságot mutatott a PPA mintákban, de nem észleltek a PPA anyagcseréjével vagy termelésével kapcsolatos géneket (2., 4. és 5. kiegészítő táblázat). Továbbá a PPA termelése, mint fermentációs melléktermék, széles körben elterjedt a különböző baktériumok között (Gonzalez-Garcia et al., 2017). A nagyobb bakteriális diverzitás lehet az oka a PPA anyagcseréjével kapcsolatos gének nagyobb gyakoriságának a kontroll mintákban (Averina et al., 2020). Továbbá az 1332 génből csak 27-ről (2,14%) jósoltak kizárólag a PPA anyagcseréjével kapcsolatos gént. Számos, a PPA anyagcseréjével kapcsolatos gén más anyagcsere-útvonalakban is részt vesz. Ez tovább bizonyítja, hogy a PPA anyagcseréjében részt vevő gének gyakorisága magasabb volt a kontroll mintákban; ezek a gének olyan útvonalakban működhetnek, amelyek nem eredményezik a PPA hasznosulását vagy képződését melléktermékként. Ebben az esetben csak egy, a PPA képződésével kapcsolatos gén mutatott szignifikáns különbségeket a mintatípusok között. A PPA-anyagcserével kapcsolatos génekkel ellentétben a PPA-termelés markergénjeit azért választották ki, mert közvetlenül részt vesznek a PPA-termelés bakteriális útvonalában. A PPA-nak kitett egerekben minden fajnál szignifikánsan megnövekedett PPA-termelési kapacitást és mennyiséget találtak. Ez alátámasztja azt az előrejelzést, hogy a PPA-k a PPA-termelőket szelektálják, és ezért a PPA-termelési kapacitás növekedését jósolják. A génmennyiség azonban nem feltétlenül korrelál a génexpresszióval; így, bár a PPA-anyagcserével kapcsolatos gének mennyisége magasabb a kontrollmintákban, az expressziós ráta eltérő lehet (Shi et al., 2014). A PPA-termelő gének prevalenciája és a PPA-termelés közötti kapcsolat megerősítéséhez szükség van a PPA-termelésben részt vevő gének expressziójának vizsgálatára.
A PPA és a kontroll metagenomok funkcionális annotációja néhány különbséget tárt fel. A géntartalom PCA-elemzése különálló klasztereket tárt fel a PPA és a kontroll minták között (5. ábra). A mintákon belüli klaszterezés azt mutatta, hogy a kontroll géntartalom változatosabb volt, míg a PPA minták egymáshoz csoportosultak. A géntartalom szerinti klaszterezés összehasonlítható volt a fajösszetétel szerinti klaszterezéssel. Így az útvonalak gyakoriságában mutatkozó különbségek összhangban vannak az egyes fajok és törzsek gyakoriságának változásaival a bennük. A PPA mintákban két, szignifikánsan nagyobb gyakoriságú útvonal kapcsolódott az aminocukor/nukleotid cukor anyagcseréhez (ko:K21279) és a több lipid anyagcsere útvonalhoz (ko:K00647, ko:K03801; 3. kiegészítő táblázat). A ko:K21279-hez kapcsolódó génekről ismert, hogy a Bacteroides nemzetséggel kapcsolatosak, amely az egyik olyan nemzetség, amely a PPA mintákban szignifikánsan nagyobb számú fajt tartalmaz. Ez az enzim a kapszuláris poliszacharidok expressziójával képes elkerülni az immunválaszt (Wang et al., 2008). Ez magyarázhatja a PPA-nak kitett egerekben megfigyelt Bacteroidetes növekedését. Ez kiegészíti a PPA mikrobiomban megfigyelt fokozott zsírsavszintézist. A baktériumok a FASIIko:K00647 (fabB) útvonalat használják zsírsavak előállítására, amelyek befolyásolhatják a gazdaszervezet anyagcsere-útjait (Yao és Rock, 2015; Johnson et al., 2020), és a lipid-anyagcsere változásai szerepet játszhatnak az idegrendszeri fejlődésben (Yu et al., 2020). Egy másik útvonal, amely fokozott mennyiséget mutatott a PPA mintákban, a szteroid hormon bioszintézis volt (ko:K12343). Egyre több bizonyíték van arra, hogy fordított összefüggés van a bélmikrobiota hormonszintet befolyásoló képessége és a hormonok általi befolyásolhatóság között, így a megemelkedett szteroidszintnek további egészségügyi következményei lehetnek (Tetel et al., 2018).
Ez a tanulmány nem mentes a korlátoktól és a megfontolásoktól. Fontos különbség, hogy nem végeztünk fiziológiai vizsgálatokat az állatokon. Ezért nem lehet közvetlenül következtetni arra, hogy a mikrobiom változásai összefüggésben állnak-e bármilyen betegséggel. További szempont, hogy a vizsgálatban részt vevő egerek ugyanazzal a táplálékkal kapták, mint az anyjukat. Jövőbeli vizsgálatok meghatározhatják, hogy a PPA-gazdag étrendről PPA-mentes étrendre való áttérés javítja-e a mikrobiomra gyakorolt hatását. Tanulmányunk egyik korlátja, sok máshoz hasonlóan, a korlátozott minta mérete. Bár érvényes következtetéseket lehet levonni, a nagyobb minta mérete nagyobb statisztikai erőt biztosítana az eredmények elemzésekor. Óvatosak vagyunk a bélmikrobiom változásai és bármely betegség közötti összefüggésre vonatkozó következtetések levonásával kapcsolatban is (Yap et al., 2021). Az olyan zavaró tényezők, mint az életkor, a nem és az étrend, jelentősen befolyásolhatják a mikroorganizmusok összetételét. Ezek a tényezők magyarázhatják a szakirodalomban megfigyelt ellentmondásokat a bélmikrobiom és az összetett betegségek közötti összefüggéssel kapcsolatban (Johnson et al., 2019; Lagod és Naser, 2023). Például a Bacteroidetes nemzetség tagjainak előfordulása hol megnövekedett, hol csökkent az autizmus spektrumzavarral (ASD) élő állatokban és emberekben (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Hasonlóképpen, gyulladásos bélbetegségben szenvedő betegek bélösszetételének vizsgálata során ugyanazon taxonoknál mind növekedést, mind csökkenést találtak (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). A nemi elfogultság hatásának korlátozása érdekében igyekeztünk biztosítani a nemek egyenlő képviseletét, hogy a különbségeket valószínűleg az étrend okozza. A funkcionális annotáció egyik kihívása a redundáns génszekvenciák eltávolítása. Génklaszterezési módszerünk 95%-os szekvenciaazonosságot és 85%-os hosszhasonlóságot, valamint 90%-os illesztési lefedettséget igényel a téves klaszterezés kiküszöbölése érdekében. Néhány esetben azonban azonos annotációkkal ellátott COG-okat figyeltünk meg (pl. MUT) (6. ábra). További vizsgálatokra van szükség annak megállapítására, hogy ezek az ortológok elkülönülnek-e, specifikus nemzetségekhez kapcsolódnak-e, vagy ez a géncsoportosítási megközelítés korlátozása. A funkcionális annotáció egy másik korlátja a potenciális téves osztályozás; a bakteriális mmdA gén egy ismert enzim, amely részt vesz a propionát szintézisében, de a KEGG nem hozza összefüggésbe a propionát anyagcsereúttal. Ezzel szemben az scpB és mmcD ortológok rokonok. A kijelölt knockout nélküli gének nagy száma miatt a génbőség felmérésekor nem lehet azonosítani a PPA-val kapcsolatos géneket. A jövőbeli vizsgálatok profitálhatnak a metatranszkriptom elemzésből, amely mélyebb megértést nyújthat a bélmikrobiota funkcionális jellemzőiről, és összekapcsolhatja a génexpressziót a lehetséges downstream hatásokkal. A specifikus neurofejlődési rendellenességeket vagy gyulladásos bélbetegségeket magában foglaló vizsgálatokhoz az állatok fiziológiai és viselkedési vizsgálatára van szükség ahhoz, hogy a mikrobiom összetételében bekövetkező változásokat ezekkel a rendellenességekkel összefüggésbe lehessen hozni. A bélmikrobiom csíramentes egerekbe történő átültetésével végzett további vizsgálatok szintén hasznosak lennének annak meghatározására, hogy a mikrobiom a betegség mozgatórugója vagy jellemzője-e.
Összefoglalva, kimutattuk, hogy az étrendi PPA tényezőként befolyásolja a bélmikrobiota összetételét. A PPA egy FDA által jóváhagyott tartósítószer, amely széles körben megtalálható különféle élelmiszerekben, és hosszú távú expozíció esetén a normál bélflóra megzavarásához vezethet. Számos baktérium mennyiségében változásokat találtunk, ami arra utal, hogy a PPA befolyásolhatja a bélmikrobiota összetételét. A mikrobiota változásai bizonyos anyagcsere-útvonalak szintjének megváltozásához vezethetnek, ami olyan fiziológiai változásokhoz vezethet, amelyek relevánsak a gazdaszervezet egészsége szempontjából. További vizsgálatokra van szükség annak megállapítására, hogy az étrendi PPA mikrobiális összetételre gyakorolt hatása diszbiózishoz vagy más betegségekhez vezethet-e. Ez a tanulmány megalapozza a PPA bélösszetételre gyakorolt hatásának emberi egészségre gyakorolt hatását vizsgáló jövőbeli tanulmányokat.
A tanulmányban bemutatott adatkészletek online repozitóriumokban érhetők el. A repozitórium neve és hozzáférési száma: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Ezt az állatkísérletet a Közép-Floridai Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága (UCF-IACUC) hagyta jóvá (állatfelhasználási engedély száma: PROTO202000002). Ez a vizsgálat megfelel a helyi törvényeknek, szabályozásoknak és intézményi követelményeknek.
NG: Konceptualizáció, Adatkezelés, Formális elemzés, Vizsgálat, Módszertan, Szoftver, Vizualizáció, Írás (eredeti vázlat), Írás (áttekintés és szerkesztés). LA: Konceptualizáció, Adatkezelés, Módszertan, Erőforrások, Írás (áttekintés és szerkesztés). SH: Formális elemzés, Szoftver, Írás (áttekintés és szerkesztés). SA: Vizsgálat, Írás (áttekintés és szerkesztés). Főbíró: Vizsgálat, Írás (áttekintés és szerkesztés). SN: Konceptualizáció, Projektadminisztráció, Erőforrások, Felügyelet, Írás (áttekintés és szerkesztés). TA: Konceptualizáció, Projektadminisztráció, Felügyelet, Írás (áttekintés és szerkesztés).
A szerzők kijelentették, hogy semmilyen anyagi támogatást nem kaptak a cikk kutatásáért, megírásáért és/vagy publikálásáért.
A szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális összeférhetetlenségnek tekinthetők. Nem alkalmazható.
A cikkben kifejtett vélemények kizárólag a szerzők véleményét tükrözik, és nem feltétlenül tükrözik intézményeik, kiadóik, szerkesztőik vagy bírálóik nézeteit. A cikkben értékelt termékekre, illetve a gyártók által tett állításokra a kiadó nem vállal garanciát és nem is támogatja azokat.
A cikkhez tartozó kiegészítő anyagok online is elérhetők: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). A propionsav gliózist és neuroinflammációt indukál a PTEN/AKT útvonal szabályozásával autizmus spektrumzavarokban. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Összetételi adatok statisztikai elemzése. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). A Firmicutes/Bacteroidetes arány, mint az emlőrák kockázati tényezője. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Szekvenciaszámlálási adatok differenciális expressziós analízise. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI és munkatársai (2013). Székletmikrobiota és metabolomja autizmussal és másképp nem meghatározott átható fejlődési zavarral élő gyermekeknél. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Az autizmus spektrumzavarral élő kisgyermekek bélmikrobiotájának bakteriális neurometabolikus jellemzői. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). A mikrobiom mint emberi szerv. Klinikai Mikrobiológia és Infekció 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Új ismeretek a propionsavat termelő baktériumok, az Anaerotignum propionicum és az Anaerotignum neopropionicum (korábban Clostridium propionicum és Clostridium neopropionicum) élettanáról. Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Az anya táplálkozása és a magzat fejlődése. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., és Hochberg, J. (1995). A téves pozitív arány szabályozása: Gyakorlatias és hatékony megközelítés a többszörös teszteléshez. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Közzététel ideje: 2025. április 18.