Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozottan támogatja a CSS-t. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon egy frissített böngészőt (vagy kapcsolja ki a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Időközben a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
A gerincesekkel ellentétben a rovarokról széles körben úgy tartják, hogy hiányoznak a hímek által termelt nemi szteroid hormonok. Az Anopheles gambiae esetében a 20-hidroxiekdizon (20E) ekdizon szteroid úgy tűnik, hogy a nőstények szintetizálásakor szabályozza a petesejt fejlődését2, és a hímek szexuális úton történő átvitelekor párzási refrakter periódust indukál3. Mivel a petesejt fejlődése és a párzás alapvető szaporodási tulajdonságok, a nőstény Anopheles szúnyogok ezen hormonális jeleinek integrálásának megértése megkönnyítheti az új malária-ellenőrzési programok kidolgozását. Jelen tanulmányunkban feltárjuk, hogy ezeket a szaporodási funkciókat különböző nemi szteroidok szabályozzák az ekdiszteroid-aktiváló/inaktiváló enzimek komplex hálózatán keresztül. Azonosítottunk egy hím-specifikus oxidált ekdizont, a 3-dehidro-20E-t (3D20E), amely a szexuális átvitelt és a defoszforilációval történő aktiválást követően a nőstény szexuális fogékonyságának leállításával védi a származást. Figyelemre méltó, hogy a 3D20E átvitel a Plasmodium fertőzés során a petesejt fejlődését fenntartó reproduktív gének expresszióját is indukálta, biztosítva a fertőzött nőstények egészségét. A nőstényekből származó 20E nem vált ki szexuális választ, de lehetővé teszi a párosodó egyedek számára, hogy tojásokat raknak, miután a 20E-gátló kinázok gátlása megtörtént. Ennek a hímekre specifikus rovarszteroid hormonnak az azonosítása és a nőstény szexuális fogékonyságának, termékenységének és a Plasmodiummal való kölcsönhatásának szabályozásában betöltött szerepe arra utal, hogy ez csökkentheti a maláriát terjesztő szúnyogok reprodukciós sikerét.
A maláriafertőzések és -halálesetek száma ismét emelkedik4 az Anopheles szúnyogok, az emberi malária paraziták egyetlen vektorának széles körű rovarirtó rezisztenciája miatt. Ezen szúnyogok párzási biológiája különösen vonzó célpont az új malária-ellenőrzési beavatkozások számára, mivel a nőstények csak egyszer párzanak5; ennek az egyetlen párzási eseménynek a sterillé tétele nagy potenciállal bírna a szúnyogpopulációk csökkentésére a terepen.
A nők szexuálisan alkalmatlanná válnak, miután férfiaktól nagy mennyiségű szteroid hormont kapnak. Tanulmányok kimutatták, hogy a további párzás nehézségeinek kiváltó oka a 20-hidroxiekdizon (20E), egy szteroid hormon, amely jobban ismert a vedlési ciklus szabályozójaként a lárvaállapotban. A hímek 20E szintézisének és átvitelének képessége kifejezetten az Anopheles fajoknál fejlődött ki, amelyek a Cellia7 alnemzetség részét képezik, amely Afrikában elterjedt, és magában foglalja a malária legveszélyesebb vektorait, köztük az Anopheles gambiae-t. Ez különösen figyelemre méltó, mivel ezeknél a fajoknál a nőstények minden vérvétel után is termelnek 20E-t, és a 20E irányítja az oogenezis ciklusát (lásd a 8. hivatkozást). Azonban keveset tudunk arról, hogy a nőstények hogyan integrálják az ekdizon két különböző forrásából (hímátvitel és vérvétel indukciója) származó jeleket anélkül, hogy veszélyeztetnék saját párzási képességüket. Valójában, ha a nőstények által termelt 20E szexuális intoleranciát vált ki, az meddőséghez vezet a szűzüllő egyedeknél, ami nagyon gyakori viselkedés ezeknél a szúnyogoknál5.
Egy lehetséges magyarázat az, hogy az A. gambiae hímek egy módosított, hím-specifikus ekdizont szállítanak, amely egy jelátviteli kaszkádot aktivál a nőstény reproduktív traktusában, ami párzási instabilitást eredményez. Azonban, bár a gerincesek több szteroid hormonnal rendelkeznek, például ösztrogénnel és androgénnel (áttekintés a 9. hivatkozásban), tudomásunk szerint az androgén-orientált szteroidokat nem azonosították rovarokban.
Célunk az volt, hogy meghatározzuk a szexuálisan érett A. gambiae hím járulékos mirigyében (MAG) található szteroid hormonok repertoárját, lehetséges módosító szteroidok keresése céljából. A korábban alkalmazott kevésbé specifikus módszer helyett nagy teljesítményű folyadékkromatográfia és tandem tömegspektrometria (HPLC-MS/MS) segítségével ekdizont (E) és 20E-t detektáltunk ebben a szövetben, megerősítve a korábbi eredményeket. A mintában azonban az oxidált foszforilált szteroidok domináltak, ami összhangban van a 3-dehidro-20E-22-foszfát (3D20E22P)12 képlettel (1. ábra). Egyéb formák közé tartozik a 3-dehidro-20E (3D20E) és a 20E-22-foszfát (20E22P). A 3D20E22P HPLC-MS/MS jelintenzitása két nagyságrenddel magasabb volt, mint a defoszforilált formája, a 3D20E, és három nagyságrenddel magasabb volt, mint az E és a 20E jelintenzitása (1. ábra). Bár a test más részein és az alsó reproduktív traktusban (LRT; kibővített adatok, 2. ábra) is előfordult. 1a). Ekdiszteroidokat is elemeztünk újonnan párzott (<1 napos) hím és nőstény egyedekben, és csak a MAG-ban mutattunk ki 3D20E-t és 3D20E22P-t; az E, 20E és 20E22P mindkét nemben jelen volt (Bővített adatok, 1b. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az A. gambiae felnőtt hím egyedei magas titerű módosító hormonokat termelnek a MAG-jaikban, amelyeket a nőstények nem szintetizálnak.
4 napos (4 napos) szűz hímek, valamint szűz és pároztatott nőstények (0,5, 3 és 12 hpm) MAG és nőstény LRT mintákat boncoltak. Az ekdizont ezekben a szövetekben HPLC-MS/MS-sel elemezték (átlag ± sem; párosítatlan t-teszt, kétoldalas, téves felfedezési arányra (FDR) korrigálva; NS, nem szignifikáns; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 óra vs. 0,5 óra, P = 0,035; 12 óra vs. 3 óra, P = 0,0015; 12 óra vs. 0,5 óra, P = 0,030. 3D20E22P: 3 óra vs. 0,5 óra, P = 0,25; 12 óra vs. 3 óra, P = 0,0032; 12 óra vs. 0,5 óra, P = 0,015). Az adatok három biológiai replikátumból származnak. Az egyes érdekes ekdizonok csúcsterületét kiszámították, és a szúnyogok számával normalizálták. Az ekdizont a következő színek jelölik: E, zöld; 20E, narancssárga; 20E22P, lila; 3D20E, kék; 3D20E22P, rózsaszín. A betét növeli az y tengely skáláját, hogy az alacsonyabb ekdizonszinteket mutassa.
Annak vizsgálatára, hogy a 3D20E22P és a 3D20E átkerül-e a párzás során, a párzás utáni különböző időpontokban boncoltuk a nőstény alsó tüskéket (LRT). Bár az ekdizont nem találtuk meg a szűzekben, jelentős mennyiségű 3D20E22P-t figyeltünk meg az LRT-ben közvetlenül a párzás után (0,5 órával a párzás után, hpm), amely idővel csökkent, míg a 3D20E szintje jelentősen emelkedett (1. ábra). Kémiailag szintetizált 3D20E-t standardként használva megállapítottuk, hogy ennek a szteroid hormonnak a szintje a párzó LRT-kben legalább 100-szor magasabb volt, mint a 20E-é (1. kibővített adattáblázat). Így a 3D20E22P a fő hím ekdizon, amely a párzás során átkerül a nőstény LRT-be, és defoszforilált formája, a 3D20E, a párzás után röviddel nagy mennyiségben jelenik meg. Ez arra utal, hogy az utóbbi ekdizon fontos szerepet játszik a nőstények párzás utáni biológiájában.
Egy új RNS-szekvenálási (RNS-seq) adatkészlet (2a. ábra) létrehozása után, egy egyedi fejlesztésű bioinformatikai folyamat segítségével, ekdizon-kinázt (EcK), ekdizon-oxidázt (EO) és a 20E-módosított foszfatáz gént kódoló ekdizont kerestünk. Az EPP gén expresszálódik a reproduktív szövetekben. Azonosítottunk egy EPP génjelöltet és két potenciális EcK gént (EcK1 és EcK2), de nem találtunk jó EO génjelöltet. Figyelemre méltó, hogy az egyes EPP gének magas szinten (98,9. percentilis) expresszálódtak a gambiai MAG-okban, de nem a női LRT-kben (2b. ábra), ellentétben a várakozásainkkal, mivel a 3D20E22P defoszforilációja ebben a női szövetben történt. Ezért úgy véljük, hogy a hím EPP átvihető a párzás során. Valójában in vivo stabil izotópjelölést alkalmaztunk a női fehérje elfedésére a párzás után, egy enzimet, amelyet MS azonosított a női pitvarban (2c. ábra és 1. kiegészítő táblázat). Az EPP jelenléte a MAG-ban és A párosodott (de nem szűz) nőstény LRT jelenlétét specifikus antitestekkel is igazolták (2d. ábra).
a, Egyedi fejlesztésű bioinformatikai folyamat az egyes nemek reproduktív szöveteiben az EcK, EO és EPP géneket kódoló gének keresésére. A nyilak melletti számok az egyes lépésekben a hím és női jelöltek számát jelzik. Ez az elemzés egy EPP gént (EPP) és egy EcK gént (EcK1) azonosított, amelyek hímekben expresszálódnak, valamint egy EcK gént (EcK2), amely mindkét nemben expresszálódik, de nem eredményez EO gén jelöltet. b, Hőtérkép, amely összehasonlítja a jelölt gén expresszióját szűz (V) és párosodó (M) Anopheles gambiae és Anopheles albicans szövetekben. Spca, megtermékenyítés; MAG-ok, járulékos mirigyek hímekben; a test más részei, beleértve a melleket, szárnyakat, lábakat, zsírtesteket és belső szerveket mindkét nemnél, valamint a nőstényeknél a petefészkeket. Az EcK2 magas expresszióval rendelkezik mind a gambiai MAG-ban, mind a pitvarokban, míg az EPP csak a MAG-ban található meg.c, A hím ejakulátumcsoport női pitvarokba történő transzlokációjának proteomikai elemzése 3, 12 és 24 hpm-nél, amely a 67 leggyakoribb fehérjét mutatja. A nőstényeket 15N-t tartalmazó étrenden nevelték, hogy minden fehérjét jelöljenek (és maszkírozzanak). A jelöletlen hímeket jelölt nőstényekkel pároztatták, és a nőstény LRT-ket 3, 12 és 24 hpm-nél boncolták proteomikai elemzés céljából (lásd az 1. kiegészítő táblázatot az ejakulációs fehérjék teljes listájáért). A képen az EPP, az Eck1 és az EcK2 kimutatható volt a szűz hímek MAG-jában ezen szövetek proteomikai elemzésével.d, Az EPP-t Western blot segítségével detektálták a párosodott nőstények MAG-jában és LRT-jében, de nem szűz nőstényekben vagy hímekben, illetve a nőstény testének többi részében. A membránokat egyidejűleg... anti-aktinnal (betöltési kontroll) és anti-EPP antitestekkel vizsgálva. Minden férfi szűz. A gélforrás adatait lásd az 1. kiegészítő ábrán. A Western blotokat kétszer végeztük hasonló eredményekkel.
Az EPP ekdiszteroid foszfofoszfatáz aktivitását HPLC-MS/MS inkubáció után igazoltuk a MAG-ból izolált 3D20E22P-vel (kiterjesztett adatok, 2a. ábra). Továbbá, amikor RNS-közvetített interferenciával (RNAi) elnémítottuk az EPP-t, a foszfatáz aktivitás erős csökkenését észleltük ezen hímek reproduktív szöveteiben (3a. ábra), és az EPP-csendesített hímekkel párosított nőstények a defoszforilált 3D20E szignifikánsan alacsonyabb arányát mutatták (3b. ábra) a részleges géncsendesítés ellenére (kiterjesztett adatok, 2b,c. ábra). Ezzel szemben ugyanazon szúnyogokban nem észleltünk szignifikáns változást a 20E22P/20E arányban, ami arra utalhat, hogy az enzim specifikus a 3D20E22P-re (3b. ábra).
a, Csökkent foszfatáz aktivitás MAG-ban, amit EPP csendesítés okozott kétszálú EPP RNS (dsEPP) vagy kétszálú GFP RNS (dsGFP) kontrollok alkalmazásával. Húsz MAG pool-t használtunk minden replikátumban (P = 0,0046, párosított t-teszt, kétoldalas), amelyeket külön pontok jelöltek. b, Az EPP-csendesített hímekkel párosított nőstények szignifikánsan alacsonyabb defoszforilált 3D20E arányt mutattak 3 hpm-nél (P = 0,0043, párosítatlan t-teszt, kétoldalas), míg a 20E szintek nem változtak (P = 0,063, párosítatlan). t-teszt, kétoldalas). Az adatokat átlag ± standard eltérésként adjuk meg három, egyenként 13, 16 és 19 nőstényből álló csoportból.c, Az EPP-csendesített hímekkel pároztatott nőstények szignifikánsan magasabb újrapárosodási arányt mutattak (P = 0,0002, Fisher-féle egzakt teszt, kétoldalas). A nőstényeket először párosodásra kényszerítették, hogy biztosítsák párzási státuszukat; 2 nappal később kapcsolatba kerültek más, transzgénikus spermiumot hordozó hímekkel, hogy a transzgén kvantitatív PCR-rel történő kimutatásával felmérjék az újrapárosodási arányokat.d, Az EPP-csendesített hímekkel pároztatott vérrel táplált nőstényeknél szignifikánsan csökkent a termékenység (P < 0,0001; Mann-Whitney teszt, kétoldalas) és enyhén csökkent a peteszám (P = 0,088, Mann-Whitney teszt, kétoldalas), míg az ívási arány nem változott (P = 0,94, Fisher-féle egzakt teszt, kétoldalas). Minden panelen n a biológiailag független szúnyogminták számát jelöli.NS, nem szignifikáns.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Ezután azt vizsgáltuk, hogy az ekdizon-defoszforiláció fontos-e a nőstények párzási ellenállásának kiváltásában. Figyelemre méltó, hogy az EPP-hiányos hímekkel párosodott nőstények sokkal nagyobb gyakorisággal (44,9%) párosodtak újra, mint a kontroll nőstények (10,4%), amikor további (transzgénikus) hímeknek voltak kitéve (3c. ábra). A termékenység jelentős csökkenését is megfigyeltük (3d. ábra, balra), és az ezen nőstények által lerakott peték számának enyhe csökkenését (3d. ábra, középen), míg a nőstények által lerakott peték százalékos aránya (ami egy másik, a nőstényeknél a párzás által kiváltott válasz) nem változott (3d. ábra, jobbra). Tekintettel az EPP 3D20E22P-re vonatkozó megfigyelt specificitására, ezek az eredmények arra utalnak, hogy a 3D20E aktiválása a párzás során átadott EPP által fontos szerepet játszhat a nőstények további párzásra való fogékonyságának kikapcsolásában, ami korábban a 20E szexuális átvitelének tulajdonított viselkedés. Ezért ez a hímspecifikus hormon is erősen befolyásolja a nőstények termékenységét.
Ezután összehasonlítottuk a 20E és a 3D20E aktivitását szexuálisan érett szűzek injekciós kísérleteiben, kémiailag szintetizált 3D20E (4a–c. ábra) és kereskedelmi forgalomban kapható 20E felhasználásával. Megfigyeltük, hogy a 3D20E mindkét koncentrációban szignifikánsan hatékonyabb volt, mint a 20E a nőstények párzási érzékenységének kikapcsolásában (4d. ábra). Figyelemre méltó, hogy a 3D20E fiziológiás szintjének fele az alsó tüdőben (LRT) (1066 pg az injekció után vs. 2022 pg a párzás után) a refrakter nőstények olyan arányát eredményezte, amely 20-szor magasabb volt, mint a 20E fiziológiás szintje (361 pg az injekció után) 24 órával a legmagasabb, 18 pg párzás utáni koncentrációban történő injekció beadása után; Bővített adatok (1. táblázat). Ez az eredmény összhangban van azzal a feltételezéssel, hogy a 20E szexuális átvitele nem okoz párzási refrakter periódusokat, és tovább utal arra, hogy a 3D20E fő tényező a szülő-gyermek kapcsolat biztosításában. A 3D20E szignifikánsan aktívabb volt, mint a 20E a szűz nőstények peterakási vizsgálataiban (4e. ábra), ami arra utal, hogy a részleges EPP-csendesítés után megfigyelt normál peterakási arány a párzás által kiváltott nőstény faktorok által még termelt reziduális 3D20E aktivitás jelenlétének köszönhető.
(a,b) 20E-ből kémiailag szintetizált 3D20E (a) nagyon magas konverzióval/hatékonysággal (az adatokat három független szintézisreakció átlaga ± standard eltéréseként adtuk meg) (b).c, A tömegspektrum (alsó fele) pontosan megegyezik a párzott nőstény LRT-ben található ekdizonnal (felső fele).d, Összehasonlítva a 20E-vel (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisher-féle egzakt teszt, kétoldalas) és 10%-os etanollal (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisher-féle egzakt teszt, kétoldalas), míg a 20E csak nagyobb dózisoknál (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fisher-féle egzakt teszt, kétoldalas) volt szignifikánsan magasabb a kontrollnál.e, A 3D20E injekció indukálta szignifikánsan magasabb ívási arányt mutatott a szűz nőstényeknél, mint a 10%-os etanolos kontrolloknál (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fisher-féle egzakt teszt, kétoldalas), míg a 20E csak a kontrollokhoz képest magasabb dózisoknál (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fisher-féle egzakt teszt, kétoldalas). A 3D20E szignifikánsan magasabb ívási arányt indukált, mint a 20E nagyobb dózisoknál (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fisher-féle egzakt teszt, kétoldalas). Minden panelen n a biológiailag független szúnyogminták számát jelöli. NS, nem szignifikáns. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Az adatok három... ismétlések.
Korábbi tanulmányainkban megállapítottuk, hogy a szteroid hormonok szexuális átvitele a MISO (Párosodás-Induced Stimulator of Oogenesis 11) expresszióját indukálja, amely egy női reprodukciós gén, amely megvédi az A. gambiae nőstényeket a P. falciparum fertőzéstől. A 13-as gén, a leghalálosabb emberi malária parazita által okozott egészségügyi költségek. Tekintettel a MISO fontosságára az Anopheles szúnyogok reprodukciós alkalmassága szempontjából a malária endémiás területeken, úgy döntöttünk, hogy meghatározzuk, melyik hormon, a 3D20E vagy a 20E, váltja ki ennek a génnek a expresszióját. Azt találtuk, hogy míg a 20E injekció specifikusan vagy erősebben indukált néhány nukleáris hormonreceptort (HR), például a HR3-at és a HR4-et, valamint tipikus downstream szteroid célpontokat, például a Vg14, 15, 16 yolkogén géneket, a MISO-t erősebben a 3D20E indukálta (Bővített adatok, 3. ábra). Így úgy tűnik, hogy ennek az androgén szteroid hormonnak a szexuális átvitele olyan mechanizmusokat indít be, amelyek megvédik a nőstényeket a parazitafertőzés okozta költségektől. Továbbá a 3D20E eltérően hat mindkét izoformára. az E receptor EcR, indukálva az EcR-A-t és elnyomva az EcR-B-t, és erősebben aktiválva más párzást kiváltó géneket, beleértve a HPX15-öt is, amely befolyásolja a nőstények termékenységét. Ez magyarázhatja az EPP-csendesített hímekkel párosított nőstényeknél megfigyelt jelentős meddőséget (kiterjesztett adatok, 3. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy léteznek olyan downstream útvonalak, amelyeket előnyösen aktiválnak két ekdizon hormon, amelyek a nemspecifikus funkció alapját képezhetik.
Ezután teszteltük a bioinformatikai folyamatunkban azonosított két EcK gén működését. Az EcK1 vagy EcK2 elnémítása jelentős mortalitást eredményezett a hímeknél (kiterjesztett adatok, 4a. ábra), ami arra utal, hogy az ekdizon foszforilációja, és így az inaktiváció, fontos a túléléshez. Mivel az EcK2 magasabb szinten expresszálódott, mint az EcK1, és proteomikailag kimutatható volt a MAG-okban (2b., c. ábra és 2. kiegészítő táblázat), ekdiszteroid kináz aktivitását 20E-vel való inkubálással validáltuk, ami a 20E22P foszforilációját eredményezte (kiterjesztett adatok, 2. ábra).4b). Amikor 3D20E-t használtunk szubsztrátként, nem tudtuk kimutatni a foszforilált 3D20E22P terméket (kiterjesztett adatok, 4c. ábra), ami arra utal, hogy a 20E, és nem a 3D20E lehet az EcK2 előnyben részesített célpontja.
RNS-szekvenálásunk szerint az EcK2 magas expressziót mutatott a szűz nőstények alsó deréktáji mirigyében (LRT), ahol a párzás után kikapcsolt (2b. ábra). Megerősítettük ezeket az adatokat, és megállapítottuk, hogy az EcK2 expresszióját nem befolyásolta a vérvétel (kibővített adatok, 5a. ábra). Kezdeti MS kísérleteink kiterjesztésével megállapítottuk, hogy a 20E22P csúcsa szorosan összefüggött a 20E csúcsával (22-26 órával a vérvétel után; kibővített adatok, 5b. ábra). Az EcK2 elnémítása a szűz nőstényekben a 20E és a 20E22P relatív arányának háromszoros növekedését eredményezte a vérvétel után 26 órával (kibővített adatok, 2c. és 5c. ábra), megerősítve, hogy az EcK2 a nőstényekben is foszforilálja a 20E-t. Figyelemre méltó, hogy az EcK2-hiányos szűzek teljes szexuális fogékonyságot mutattak (kibővített adatok, 5d.,e. ábra), ami tovább sugallja, hogy a nőstények 20E-termelése nem indukál párzási refrakter periódusokat. Ezeknél a nőstényeknél azonban jelentősen megnőtt a... peterakási arányok a kontrollcsoporthoz képest, a szűzek több mint 30%-a rakott petét (kiterjesztett adatok, 5f. ábra). Ha a kétszálú Eck2 RNS (dsEcK2) injekciókat vérvétel után végezték, az ívás nem történt meg, ekkor a vérvétel miatti 20E csúcs csökkent. Összességében ezek az eredmények alátámasztják azt a modellt, hogy a vérszívás után termelt 20E ívást idézhet elő, de csak akkor, ha az ívási blokkot (EcK2 és esetleg más tényezők) a párzás kikapcsolja. Sem a 20E, sem a 3D20E injekciók nem gátolták az EcK2 expresszióját a szűzekben (kiterjesztett adatok, 5g. ábra), ami arra utal, hogy más tényezők közvetítik a kináz gátlását. A vérvétel utáni 20E-szintek azonban nem voltak elegendőek a párzási kellemetlenségek kiváltásához, hanem a szexuális úton átvitt 3D20E magas titerei hatékonyan kiváltották azokat.
Eredményeink fontos betekintést nyújtanak az A. gambiae reprodukciós sikerét szabályozó mechanizmusokba. Kialakult egy modell, amelyben a hímek képesek voltak magas titerű 3D20E-t szintetizálni, amely egy hím-specifikus módosított ekdizon, amely a nőstények további párzásra való érzéketlenné tételével biztosítja a származást. Ugyanakkor ezek a malária vektorok egy hatékony rendszert is kifejlesztettek a 3D20E aktiválására a nőstényekben a hím-specifikus EPP szexuális átvitelére válaszul. Tudomásunk szerint ez az első példa arra, hogy egy hím és nőstény által dominált szteroid hormonrendszer egyedi és kritikus funkciót tölt be a rovarokban. A hím-specifikus ekdizon funkciót feltételezték, de nem bizonyították véglegesen. Például egy nagyrészt megcáfolt hipotézis18 az, hogy ezeket a funkciókat a 20E prekurzor E1 láthatja el. Köztudott, hogy a Drosophila-ban a monandria kialakulását kis nemi peptidek19,20 szexuális átvitele váltja ki, amelyek specifikus nemi peptid receptorokon keresztül kölcsönhatásba lépnek a női reproduktív traktust beidegző neuronokkal21,22. További munkára van szükség a ... által szabályozott downstream jelátviteli kaszkádok meghatározásához. 3D20E jelenléte az A. gambiae nőstényekben, valamint annak meghatározása, hogy ezek a kaszkádok konzerválódhatnak-e a szúnyogok és a Drosophila között.
Tekintettel a 3D20E fontos szerepére a nőstények termékenységében és viselkedésében, amelyet a tanulmányunkban azonosítottunk, a 3D20E szintéziséhez és aktiválásához vezető útvonalak új lehetőségeket kínálnak a jövőbeli szúnyogirtási stratégiákhoz, például a versengő steril hímek generálásához a steril rovartechnológiai stratégiákban, amelyeket vadon való szabadon engedésre vagy a 3D20E utánzására szűzjátékokban alkalmaznak. A 3D20E hím-specifikus funkciója akkor alakulhatott ki, amikor az A. gambiae és más Cellia fajok megszerezték a képességet, hogy ondójukat párzódugókká koagulálják, mivel ez lehetővé teszi nagyszámú hormon és hormonaktiváló enzim hatékony átvitelét. A monandria megvalósítását megvalósító 3D20E evolúció viszont mechanizmust biztosít a nőstények számára (a MISO magas expresszióján keresztül), hogy elősegítsék reprodukciós alkalmasságukat a magas malária prevalenciájú területeken, ami közvetve hozzájárul a Plasmodium átviteléhez. Tekintettel arra, hogy a nőstény 20E-ről kimutatták, hogy mélyreható hatással van a P. falciparum túlélésére és növekedésére a nőstény Anopheles szúnyogokban,24 mind a hím, mind a női szteroid hormon útvonalak kulcsfontosságúak a szúnyog-parazita kölcsönhatásokban.
Az A. gambiae G3 törzseket standard rovarkörülmények között nevelték (26-28 °C, 65-80% relatív páratartalom, 12:12 órás világos/sötét fotoperiódus). A lárvákat por állagú hallevelel etették (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets és Tetra Pond Sticks 7:7:2 arányban). A kifejlett szúnyogokat szabadon választható módon 10%-os dextrózoldattal és hetente emberi vérrel (a vizsgálati vér összetevői) etették. A szűz szúnyogokat a bábállapotban a nemek elkülönítésével nyerték, a végek mikroszkópos vizsgálata után. A DsRed transzgént hordozó hímeket korábban már leírták.
A kényszerpárosítási kísérleteket a korábban leírt protokollok szerint végeztük. Természetes párzáshoz a 4 napos szűz nőstényeket két éjszakán át 1:3 arányban tartottuk szexuálisan érett szűz hímekkel. Azokban a kísérletekben, amelyekben a hímeket dsEPP-vel injektáltuk, az együttes ketrecezés egybeesett az injekció beadását követő 3-4. nappal, amikor a foszfatáz aktivitása maximálisan elcsendesedett (Bővített adatok, 2b. ábra).
A szúnyogszöveteket, a maradék tetemeket (a test többi részét) vagy az egész testet 100%-os metanolba boncoltuk, és gyöngyözővel (2 mm-es üveggyöngyök, 2400 fordulat/perc, 90 másodperc) homogenizáltuk. A szövetmennyiségek és a metanoltérfogatok a következők voltak: a test többi része, 50 µl 1000 µl-ben; MAG, 50–100 µl 80 µl; nőstény LRT, 25–50 µl 80 µl. A csapadékot egy második metanolos extrakciónak vetettük alá azonos térfogatú metanollal. A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítottuk. A két extrakcióból származó metanolt egyesítettük és nitrogénáramban szárítottuk, majd a következő térfogatú 80%-os metanolos vízben szuszpendáltuk: a test többi része, 50 µl; MAG-ok és nőstény LRT, 30 µl.
A mintákat tömegspektrométeren (ID-X, Thermo Fisher) elemeztük, amely egy LC műszerhez (Vanquish, Thermo Fisher) volt csatlakoztatva. 5 µl mintát injektáltunk egy 3 µm-es, 100 × 4,6 mm-es oszlopra (Inspire C8, Dikma), 25 °C-on tartva. Az LC mozgófázisai az A (víz, 0,1% hangyasav) és a B (acetonitril, 0,1% hangyasav) voltak. Az LC gradiens a következő volt: 5% B 1 percig, majd 11 perc alatt 100% B-re növeltük. 8 perc 100%-os hőmérsékleten való inkubálás után az oszlopot újra ekvilibráltuk 5% B-n 4 percig. Az áramlási sebesség 0,3 ml perc-1 volt. Az MS forrásban az ionizációt melegített elektrospray ionizációval végeztük pozitív és negatív módban.
A tömegspektrométer 350 és 680 közötti m/z tartományban mér adatokat 60 000 felbontással, teljes MS módban. Az MS/MS adatokat [M + H]+ (minden célpont), [M - H2O + H]+ (minden célpont) és [M - H]- (foszforilált célpontok) esetén gyűjtötték. Az MS/MS adatokat azon célpontok ekdizon tulajdonságainak megerősítésére használták, amelyekhez nem állt rendelkezésre standard. A nem célzott ekdiszteroidok azonosításához az összes, >15%-os relatív gyakoriságú HPLC csúcs MS/MS adatait elemezték. A tiszta standardokból (20E, 3D20E) létrehozott standard görbék segítségével számszerűsítették az abszolút mennyiségeket vagy hígításokat egy adott minta (minden más célpont) esetében, hogy kiszámítsák azok ekvivalenciáját az egy hímben talált mennyiségekkel. A 3D20E esetében a számszerűsítést a következő adduktok összegzésével végezték: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Az adatokat kivonták és... A mennyiséget Tracefinder (4.1-es verzió) segítségével határoztuk meg. Az MS/MS adatokat Xcalibur (4.4-es verzió) segítségével elemeztük. Az E, 20E és 3D20E MS spektrumát a megfelelő standardokkal hasonlítottuk össze. A 3D20E22P-t Girard-reagenssel derivatizáltuk. A 20E22P-t m/z arány alapján elemeztük.
A 3D20E22P-t MAG-ból tisztították. A tisztítást analitikai méretekben, ultra-teljesítményű folyadékkromatográffal (Acquity, Waters) és kvadrupól tömegalapú detektorral (QDa, Acquity, Waters) végezték, ugyanolyan LC-körülmények között, mint a HPLC-MS/MS analízist. A frakciógyűjtést akkor indították el, amikor a 3D20E22P-nek megfelelő m/z értéket a korábban meghatározott retenciós idővel detektálták. Az extrahált vegyületek tisztaságát ezután HPLC-MS/MS-sel ellenőrizték a fent leírtak szerint.
A teljes RNS-t 10-12 reproduktív szövetből vagy a test más részéből (fej nélküli) extraháltuk TRI reagenssel (Thermo Fisher), a gyártó utasításait követve. Az RNS-t TURBO DNázzal (Thermo Fisher) kezeltük. A cDNS-t Moloney egér leukémia vírus reverz transzkriptázzal (M-MLV RT; Thermo Fisher) szintetizáltuk a gyártó utasításait követve. A reverz transzkripciós kvantitatív PCR-hez (RT-qPCR; bővített adattáblázat 2) korábban publikáltak24, vagy Primer-BLAST26 segítségével terveztek, előnyben részesítve a 70-150 bp méretű és exon-exon csatlakozásokon átívelő termékeket, vagy a primerpár primerek különítették el az exonokat. A három-négy biológiai replikátumból származó cDNS-mintákat négyszeresére hígítottuk vízben RT-qPCR-hez. A kvantifikációt 15 µl replikátum reakciókban végeztük, amelyek 1× PowerUp SYBR Green Master Mixet (Thermo Fisher), primereket és 5 µl hígított cDNS-t tartalmaztak. A reakciókat QuantStudio 6 Pro valós idejű PCR rendszeren (Thermo Fisher) futtattuk, és az adatokat összegyűjtöttük, és a Design and Analysis (2.4.3 verzió) segítségével elemezve. Amint azt ebben a tanulmányban bemutattuk, a relatív mennyiségeket a riboszomális RpL19 génhez (AGAP004422) normalizálták, amelynek expressziója nem változott szignifikánsan a vérrel való táplálással27 vagy a párzással3.
Az RNS minőségét Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) készülékkel ellenőriztük. Az Illumina párosított végű könyvtárakat az MIT és a Harvard Broad Institute-jában készítettük el és futtattuk. A szekvenálási leolvasásokat az A. gambiae genomhoz (PEST törzs, 4.12 verzió) illesztettük a HISAT2 (2.0.5 verzió) segítségével, alapértelmezett paraméterekkel. A 30-nál alacsonyabb mapping quality (MAPQ) pontszámmal rendelkező leolvasásokat a Samtools (1.3.1 verzió) segítségével távolítottuk el. A génekhez rendelt leolvasások számát a htseq-count (0.9.1 verzió) segítségével számoltuk, alapértelmezett paraméterekkel. A normalizált leolvasási számokat kiszámítottuk, és a differenciális génexpressziót a DESeq2 csomag (1.28.1 verzió) segítségével elemeztük R-ben (4.0.3 verzió).
Az ekdizont módosító génjelölteket úgy azonosítottuk, hogy először az A. gambiae genomját kerestük meg a PSI-BLAST algoritmussal (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), alapértelmezett értékeket használva a következő lekérdezési fehérjeszekvenciákkal: Bombyx mori (hozzáférési szám: NP_001038956.1), Musca domestica (hozzáférési szám: XP_005182020.1, XP_005175332.1 és XP_011294434.1) és Microplitis demolitor (hozzáférési szám: XP_008552646.1 és XP_008552645.1) EcK a B. mori (hozzáférési szám: NP_001036900), Drosophila melanogaster (hozzáférési szám: NP_651202), Apis mellifera (hozzáférési szám: XP_394838) és Acyrthosiphon pisum (hozzáférési szám: XP_001947166); valamint EPP a B. mori-ból (hozzáférési szám: XP_001947166) NP_001177919.1 és NP_001243996.1) és EO a D. melanogasterből (hozzáférési szám: NP_572986.1) (1. lépés). Ezután szűrjük a találatokat a magas mRNS-expresszió (>100 fragmens/kilobázis exon/millió leképezett leolvasás (FPKM) vagy >85%) alapján a gambiai reproduktív szövetben (nőstény LRT vagy MAG) (2. lépés). A specificitás javítása érdekében olyan enzimjelölteket választottunk, amelyek az A. albimanus reproduktív szövetében is expresszálódnak, amely egy anopheles faj, és nem szintetizál vagy szállít ekdizont párzás során. A jelöltgéneket az A. albimanus reproduktív szövetében tapasztalható alacsony expresszió (<100 FPKM vagy <85. percentilis) alapján szűrtük (3. lépés). Végső szűrőként (4. lépés) a jelöltgéneknek a következők közül legalább egynek meg kell felelniük: (1) a párzás után szignifikánsan felregulálódnak (P < 0,05) a differenciálisan expresszált gének elemzése szerint, és (2) nem reproduktív szövetekben (< 85% vagy <100 FPKM).
A korábban leírt módszereket 28,29,30 módosítottuk a teljes szervezet izotópos jelölése érdekében. Röviden, a vad típusú Saccharomyces cerevisiae II. típusú (YSC2, Sigma) törzset élesztő nitrogénbázisban (BD Difco, DF0335) teszteltük, amely (tömeg/térfogat) 2% glükózt (G7528, Sigma), 1,7% aminosavmentes és ammónium-szulfátot tartalmazott. A nitrogén egyedüli forrása az élesztő centrifugálással történő kinyerése volt, és a szúnyoglárvákat ad libitum etettük a bábozódásig. Halliszttel (0,5 mg/300 lárvának) kiegészítése a negyedik lárvaállapotú mortalitás megelőzése érdekében. A párzási kísérletekben csak nőstényeket használtunk, a jelöletlen hímekkel pedig a párzás során átvitt hím proteom elemzését végeztük.
4-6 napos, 15N-jelölt szűz nőstényeket kényszerítettek párosodásra korban illesztett, jelöletlen szűz hímekkel. A sikeres párzást epifluoreszcens mikroszkóppal végzett párzási dugók kimutatásával igazolták. 3, 12 és 24 óra percenként 45-55 pároztatott nőstény pitvarát 50 µl ammónium-hidrogén-karbonát pufferbe (pH 7,8) boncolták, és mozsártörővel homogenizálták. A homogenizátumot centrifugálták, és a felülúszót 50 µl 0,1%-os RapiGest (186001860, Waters) 50 mM ammónium-hidrogén-karbonáttal készült oldatával keverték össze. Az egyes minták felülúszóját és pelletjét szárazjégen gyorsfagyasztották, és egy éjszakán át a Washingtoni Egyetem MacCoss laboratóriumába szállították, ahol befejezték az LC-MS/MS minta előkészítését. A pelletet 50 µl 0,1%-os RapiGest 50 mM ammónium-hidrogén-karbonáttal készült oldatában szuszpendálták, és vízfürdőben ultrahanggal kezelték. A pellet és a felülúszó fehérjekoncentrációját a BCA segítségével mérték. A vizsgálatban a mintákat 5 mM ditiotreitollal (DTT; Sigma) redukáltuk, 15 mM jód-acetamiddal (Sigma) alkileztük, és 37 °C-on (1:0 50) inkubáltuk 1 órán át tripszinizáció: tripszin:szubsztrát arány mellett. A RapiGest-et 200 mM HCl hozzáadásával lizáltuk, majd 45 percig 37 °C-on inkubáltuk, és a törmelék eltávolítása érdekében 14 000 fordulat/perc sebességgel 10 percig 4 °C-on centrifugáltuk. A mintákat kettős módú szilárd fázisú extrakcióval mostuk (Oasis MCX patronok, Waters), majd 0,1%-os hangyasavban szuszpendáltuk 0,33 µg µl-1 végső fehérjekoncentráció eléréséig. A jelöletlen MAG proteómákat hasonlóképpen elemeztük szűz hímekből. Minden mintából két analitikai replikátumot elemeztünk. Ezután mindegyikből 1 µg-ot elemeztünk egy 25 cm-es, olvasztott szilícium-dioxid 75 μm-es oszlopon 4 cm-es olvasztott szilícium-dioxid oszloppal. Jupiter C12 fordított fázisú gyantával (Phenomenex) töltött Kasil1 (PQ) szilikagél frittcsapda és 180 perces folyadékkromatográfia. Mintaemésztések – Az MS/MS méréseket Q-Exactive HF tömegspektrométeren (Thermo Fisher) futtattuk nanoACQUITY UPLC rendszerrel (Waters). Az egyes futtatásokhoz generált adatgyűjtési adatokat mzML formátumba konvertáltuk Proteowizard (3.0.20287 verzió) és Comet31 (3.2 verzió) szoftverekkel a FASTA adatbázissal összehasonlítva, amely az Anopheles gambiae (VectorBase 54-es verzió), az Anopheles coluzzi fehérjeszekvenciáit tartalmazza. Keresést végeztünk a Mali-NIH (VectorBase 54-es verzió), a Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, 2021. március), az A. gambiae RNS-szekvenálásán és ismert emberi szennyezők háromkeretű transzlációján. A peptidtérképhez illesztett FDR-eket Percolator32 (3.05 verzió) segítségével határoztuk meg 0,01-es küszöbértékkel, és a peptideket fehérjeparszimónia segítségével állítottuk össze fehérjeazonosításokká Limelight33 (2.2.0 verzió) szoftverben. Relatív fehérjebőség az egyes fehérjékre minden egyes futtatásban kiszámított normalizált spektrális abundancia faktor (NSAF) segítségével becsülték meg, a korábban leírtak szerint. Az egyes fehérjékhez viszonyított NSAF-et két különböző biológiai replikátumból származó minták átlagolásával számították ki. Az 15N jelölés sikeresen elfedte a női proteómot, bár kis mennyiségű jelöletlen fehérje volt kimutatható a jelölt szűzekből. A hím fehérje redukciójának (1-5 spektrumok) kimutatását a női nyers mintákban csak technikai futtatásokban észleltük, ahol a nyers mintákat a hím/párosodó minták után futtattuk, a HPLC „átvitel” eredményeként. A jelölt szűzekből alkalmanként „szennyeződésként” talált fehérjéket az 1. kiegészítő táblázat sorolja fel.
Két antigén peptid, a QTTDRVAPAPDQQQ (a PA izotípuson belül) és a MESDGTTPSGDSEQ (a PA és PB izotípuson belül) Genscriptben. A két peptidet egyesítették, majd KLH hordozófehérjéhez konjugálták, és új-zélandi nyulakba injektálták. A nyulakat a negyedik injekció után leölték, és affinitástisztítással teljes IgG-t izoláltak. A leginkább EPP-specifikus nyúlból származó IgG-t használták a további Western blot analízishez.
Western blotokhoz MAG-ot (n = 10, ahol n a biológiailag független szúnyogminták számát jelöli) és nőstény LRT-t (n = 30) adtunk hozzá 4 napos szűz hímektől és szűz vagy kényszerpároztatott nőstényektől (<10 a párzás után), fehérjeextrakciós puffert (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% nátrium-dezoxikolát; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× proteáz inhibitor koktél (Roche)). A mintákat a boncolást követően azonnal homogenizáltuk egy gyöngyözővel (2 mm-es üveggyöngyök, 2400 fordulat/perc, 90 másodperc). Az oldhatatlan törmeléket 20 000 g-vel, 4 °C-on centrifugálással távolítottuk el. A fehérjéket Bradford-vizsgálattal (Bio-Rad) számszerűsítettük. Ezután 20 µg MAG-fehérjét, 40 µg LRT-fehérjét és 20 µg maradék fehérjét denaturáltunk és 10%-os Bis-Tris-szel választottunk el. NuPAGE MOPS pufferben. A fehérjéket polivinilidén-fluorid membránokra vittük át az iBlot2 transzfer rendszerrel (Thermo Fisher). A membránokat kétszer mostuk 1× PBS-T-ben (0,1% Tween-20 PBS-ben), majd Odyssey blokkoló pufferben (Li-Cor) blokkoltuk 1 órán át 22°C-on. A membránokat egy éjszakán át 4°C-on rázattuk egyedi nyúl anti-EPP poliklonális primer antitesttel (1:700 blokkoló pufferben) és patkány anti-aktin monoklonális primer antitesttel, MAC237-tel (Abeam; 1:4000). A membránokat PBS-T-vel mostuk, majd másodlagos antitestekkel (szamár anti-nyúl 800CW és kecske anti-patkány 680LT (Li-Cor), mindkettő 1:20 000) inkubáltuk 0,01% SDS-t és 0,2% Tween-20-at tartalmazó blokkoló pufferben 1 órán át 22°C-on. A membránokat PBS-T-vel mostuk, és Odyssey CLx készülékkel képalkottuk. szkenner. A képeket az Image Studio (5.2-es verzió) programban gyűjtötték és dolgozták fel. Az EPP-RA izoformának (82 kDa) megfelelő specifikus sávot nem észlelték.
Az EPP (AGAP002463-RB izoformaként, hisztidin-foszfatáz domént tartalmaz, NCBI konzervált domén keresés 34) és az EcK2 (AGAP002181) kódoló régióit pET-21a(+) plazmidba (Novagen Millipore Sigma) klónoztuk; a primereket a 2. bővített adattáblázat tartalmazza. Nyolc GS4 linkert (tandemben) inszertáltunk a pET-21a(+)-EcK2 konstrukció C-terminális 6xHis tagje elé. A rekombináns fehérjéket a NEBExpress sejtmentes E. coli fehérjeszintézis reakcióval (New England BioLabs) állítottuk elő. A rekombináns fehérjéket NEBExpress Ni spin oszlopokkal (New England BioLabs) tisztítottuk. A dihidrofolát-reduktáz (DHFR) kontrollfehérjét a NEBExpress sejtmentes E. coli fehérjeszintézis készlet DNS-templátjával állítottuk elő. A fehérjéket 50%-os glicerinben PBS-ben tároltuk -20 °C-on legfeljebb 3 hónapig.
Az EPP és a szövetkivonatok foszfatáz aktivitását 4-nitrofenil-foszfáttal (pNPP; Sigma-Aldrich) mértük. A reakciópuffer 25 mM Trist, 50 mM ecetsavat, 25 mM Bisz-Trist, 150 mM NaCl-t, 0,1 mM EDTA-t és 1 mM DTT-t tartalmazott. A szövetet a reakciópufferben homogenizáltuk, és a sejttörmeléket centrifugálással eltávolítottuk. A reakciót enzim vagy szövetkivonat hozzáadásával indítottuk a 2,5 mg ml-1 pNPP-t tartalmazó reakciópufferhez. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten, sötétben inkubáltuk, és a pNPP-ből átalakult pNP mennyiségét a 405 nm-en különböző időpontokban mért abszorbancia mérésével határoztuk meg.
Az in vitro EcK aktivitás vizsgálatához a fehérjét 0,2 mg 20E-vel vagy 3D20E-vel inkubáltuk 200 µl pufferben (pH 7,5), amely 10 mM HEPES-NaOH-t, 0,1% BSA-t, 2 mM ATP-t és 10 mM MgCl2-t tartalmazott, 2 órán át 27 °C-on. A reakciót 800 µl metanol hozzáadásával állítottuk le, majd -20 °C-ra hűtöttük 1 órán át, végül 20 000 g-vel centrifugáltuk 10 percig 4 °C-on. A felülúszót ezután HPLC-MS/MS-sel elemeztük. A kontrollcsoportban használt fehérjék hőinaktiválásához a fehérjéket 50%-os glicerinben, PBS-ben inkubáltuk 20 percig 95 °C-on.
Az in vitro EPP aktivitás vizsgálatához a fehérjét 3D20E22P-vel (ami megegyezik a 18 MAG párban található mennyiséggel, HPLC-MS/MS-sel tisztítva) inkubáltuk 100 µl pufferben (pH 7,5), amely 25 mM Trist, 50 mM ecetsavat, 25 mM Bisz-Trist, 150 mM NaCl-t, 0,1 mM EDTA-t és 1 mM DTT-t tartalmazott, 3 órán át 27 °C-on. A reakciót 400 µl metanol hozzáadásával állítottuk le, és -20 °C-on hűtöttük 1 órán át, majd 20 000 g-vel 10 percig 4 °C-on centrifugáltuk. A felülúszót HPLC-MS/MS-sel elemeztük.
Az EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) és EcK2 (556 bp) PCR fragmenseit vegyes ivarú, fej nélküli szúnyogtetemekből előállított cDNS-ből amplifikáltuk. Az eGFP kontroll PCR fragmensét (495 bp) a korábban leírt pCR2.1-eGFP-ből amplifikáltuk; A PCR primerek a 2. bővített adattáblázatban találhatók. A PCR fragmenst a pL4440 plazmid invertált T7 promóterei közé inszertáltuk. A plazmid konstrukciókat NEB 5-α kompetens E. coliból (New England Biolabs) nyertük ki, és felhasználás előtt DNS-szekvenálással ellenőriztük (az inszert szekvenciáját lásd az 1. kiegészítő adattáblázatban). A T7 promóterhez illesztett primereket (2. bővített adattáblázat) használtuk a pL4440 alapú plazmidból származó inszert amplifikálására. A PCR termék méretét agaróz gélelektroforézissel igazoltuk. A dsRNS-t PCR templátokról írtuk át a Megascript T7 transzkripciós készlet (Thermo Fisher) segítségével, és a gyártó utasításai szerint tisztítottuk a korábban leírt módosításokkal.
A dsRNS injekcióhoz 1380 ng dsRNS-t (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) injektáltunk 10 ng nl-1 koncentrációban felnőtt hím vagy nőstény (Nanoject III, Drummond) mellkasába 1 napon belül a tenyészet bezáródása után. A génkiütési szinteket legalább három biológiai replikátumban határoztuk meg RNS-extrakcióval, cDNS-szintézissel és RT-qPCR-rel. Az ekdizon injekcióhoz 4 napos szűz vagy 6 napos szűz vérrel táplált nőstényekbe 0,13, 0,21 vagy 0,63 µg 20E-t vagy 3D20E-t (Nanoject III, Drummond) injektáltunk 1,3, 2,1 koncentrációban (a kísérleti tervtől függően), vagy 6,3 ng nl-1-et. 100 nl 10% (v/v) etanolt injektáltunk vízben; 100 nl 3D20E22P 10%-os etanolban (ami a MAG-párban található mennyiség 75%-ának felel meg). A szúnyogokat véletlenszerűen osztottuk be az injekciós csoportba.
Az ívási vizsgálatokhoz a 3 napos nőstényeket szabadon fogyasztották emberi vérrel. A részben táplált vagy nem táplált szúnyogokat távolítsák el. A kezeléstől függően a nőstényeket legalább 48 órával a vérliszt után négy éjszakára külön ívócsészékbe helyezték. Az ikrákat sztereoszkóp (Stemi 508, Zeiss) alatt számolták; a párzott nőstények esetében a lárvává kikelt ikrákat tekintették termékenynek.
A párzási kísérletekhez a nőstényeknek a kezeléstől függően legalább 2 napot hagytak a párzási rezisztencia kialakulására, majd vad típusú, korban párosított hímeket helyeztek be ugyanabba a ketrecbe. Két éjszakával később a megtermékenyített nőstény vezikulákat boncolták, és a genomiális DNS-t fagyasztás-felolvasztás és ultrahangos kezelés útján szabadították fel 10 mM Tris-HCl-t, 1 mM EDTA-t és 25 mM NaCl-t (pH 8,2) tartalmazó pufferben. A mintákat Proteinase K-val (0,86 µg µl-1) inkubálták 15 percig 55 °C-on, majd 10 percig 95 °C-on. A nyers genomiális DNS-készítményeket 10-szeresére hígították, és Y-kromoszóma-szekvenciákat qPCR-rel detektáltak; a primereket a 2. bővített adattáblázat tartalmazza. Az Y-kromoszóma-szekvencia hiánya a párzás hiányát jelzi.
Az újrapárosítási vizsgálatokhoz az erőltetett pároztatású nőstényeket megvizsgálták párzási dugók jelenlétére a párzási státusz megerősítése érdekében, és 2 napig hagyták őket, hogy ellenállóak legyenek a hímek hiányában történő párosodással szemben, a korábban leírtak szerint36. A DsRed transzgénikus spermiumot hordozó hímeket ezután nőstény ketrecekbe helyezték. Két éjszakával később a megtermékenyítő vezikulákat kimetszették a nőstényekből, és a genomiális DNS-t a fent leírtak szerint előállították, majd a DsRed transzgén qPCR detektálásának vetették alá; a primerek a 2. bővített adattáblázatban találhatók. A DsRed transzgén hiánya azt jelezte, hogy nem történt újrapárosítás.
A 3D20E-t a korábban leírtak szerint szintetizáltuk. Röviden, 10 mg 20E-t (Sigma-Aldrich) oldottunk fel 10 ml vízben, majd 30 mg platinafeketét (por formájában, Sigma-Aldrich) adtunk hozzá. Folyamatosan gyengéd O2-áramot buborékoltattunk a reakcióelegybe, amelyet szobahőmérsékleten kevertünk. 6 óra elteltével 30 ml metanolt adtunk hozzá a reakció leállításához. Az elegyet centrifugáltuk a katalizátorrészecskék eltávolítása érdekében. A felülúszót vákuumban, szobahőmérsékleten szárazra pároltuk. A szárított reakcióterméket 10%-os etanolban és metanolban oldottuk fel HPLC-MS/MS analízishez injekció céljából. Az átalakulási arány (20E-ről 3D20E-re) körülbelül 97% volt (4b. ábra), és a szintetizált 3D20E MS-spektruma megegyezett a pároztatott nőstények spektrumával (4c. ábra).
A jelmagyarázat az elvégzett statisztikai tesztek részleteit tartalmazza. A Fisher-féle egzakt tesztet, a Mantel-Cox tesztet és a Student-féle t-tesztet a GraphPad (9.0 verzió) programmal végeztük. A Cochran-Mantel-Haenszel teszteket egyéni R szkripttel végeztük (elérhető a https://github.com/duopeng/mantelhaen.test címen). Az adateloszlás normalitásvizsgálatát Shapiro-Wilk teszttel végeztük, 0,05-ös szignifikanciaküszöb mellett. Amikor az adatok nem mentek át a normalitáspróbán, Mann-Whitney tesztet végeztünk. A túlélési adatokat Mantel-Cox teszttel elemeztük. Az RNS-szekvenálás génszintű differenciális expressziós elemzését a DESeq2 csomaggal (1.28.1 verzió) végeztük. A grafikonon a vízszintes sáv a mediánt jelöli. A P = 0,05 szignifikanciaértéket használtuk küszöbértékként minden teszthez.
A tanulmány felépítésével kapcsolatos további információkért lásd a cikkhez kapcsolódó Nature Research Report absztraktot.
Az MS proteomikai adatokat a ProteomeXchange Consortiumba (//proteomecentral.proteomexchange.org) helyezték el a PRIDE Partner Repository-n (//www.ebi.ac.uk/pride/) keresztül, a PXD032157 adatkészlet-azonosítóval.
Az RNS-szekvenálási adatkészlet a Gene Expression Comprehensive Library-ben (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) található a GSE198665 sorszám alatt.
A jelenlegi tanulmány során keletkezett és/vagy elemzett további adatkészletek ésszerű kérésre beszerezhetők a megfelelő szerzőktől. Ez a cikk a forrásadatokat tartalmazza.
De Loof, A. Ekdiszteroidok: Elhanyagolt rovar nemi szteroidok? Férfi: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroxiekdizon és a petefészek fejlődése Anopheles stephensben. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).