A szekréciós útvonalon belüli fehérjeválogatás elengedhetetlen a sejtek kompartmentalizációjának és homeosztázisának fenntartásához. A héj által közvetített válogatás mellett a lipidek szerepe a kinesin válogatásban a szekréciós transzport folyamatában egy régóta fennálló alapkérdés, amelyre még nem született válasz. Ebben a tanulmányban 3D-s, egyidejű, többszínű, nagy felbontású, valós idejű képalkotást végzünk, hogy in vivo bizonyítsuk, hogy az újonnan szintetizált, glikozil-foszfatidilinozitollal immobilizált, nagyon hosszú ceramid lipid részekkel rendelkező fehérjék klaszterekbe rendeződnek és specializált endoplazmatikus hálózat kilépési helyekre osztályozódnak, amelyek eltérnek a transzmembrán fehérjék által használtaktól. Ezenkívül bemutatjuk, hogy a ceramid lánchossza az endoplazmatikus retikulum membránjában kritikus fontosságú ehhez a válogatás-szelektivitáshoz. Tanulmányunk az első közvetlen in vivo bizonyítékot szolgáltatja a fehérjerakományok lipidlánchossz alapján történő szelektív exporthelyekre való osztályozására a szekréciós útvonalban.
Az eukarióta sejtekben az endoplazmatikus retikulumban (ER) szintetizált fehérjék a szekréciós útvonalon keresztül történő transzport során szétválogatódnak, hogy a megfelelő sejtes célállomásra juthassanak (1). A bevonat által közvetített szétválogatás mellett sokáig feltételezték, hogy bizonyos lipidek szelektív kilépési pontokként is szolgálhatnak azáltal, hogy specifikus membrándoménekbe csoportosulnak, amelyek fehérjéket specifikusak (2-5). Azonban még mindig hiányoznak a közvetlen in vivo bizonyítékok, amelyek alátámasztanák ezt a lehetséges lipidalapú mechanizmust. Ennek az alapvető problémának a megoldása érdekében élesztőben vizsgáltuk, hogy a glikozil-foszfatidilinozitol (GPI) lehorgonyzott fehérjék (GPI-AP-k) hogyan exportálódnak eltérő módon az ER-ből. A GPI-AP-k különféle lipidhez kapcsolódó sejtfelszíni fehérjék (6, 7). A GPI-AP egy szekretált fehérje, amely a plazmamembrán külső szórólapjaihoz kapcsolódik a glikolipid rész (GPI-horgony) révén. A GPI-horgonyokat konzervatív transzláció utáni módosításokként fogadják el az ER lumenében (8). A kapcsolódás után a GPI-AP a Golgi-készüléken (5, 9) keresztül átjut az ER-ből a plazmamembránba. A GPI-horgonyok jelenléte miatt a GPI-AP a szekréciós útvonal mentén elkülönülve transzportálódik a transzmembrán szekretált fehérjéktől (beleértve más plazmamembrán-fehérjéket is) (5, 9, 10). Élesztősejtekben a GPI-AP-k az endoplazmatikus retikulumban elkülönülnek a többi szekretált fehérjétől, majd egyedi vezikulákba csomagolódnak, amelyeket a II. köpenyfehérje-komplex (COPII) vesz körül (6, 7). Az ER-exportfolyamatban ennek az osztályozási folyamatnak a meghatározó tényezői nem tisztázottak, de feltételezhető, hogy ehhez a mechanizmushoz lipidekre lehet szükség, különösen a GPI-horgony lipid részének szerkezeti átalakulására (5, 8). Élesztőben a GPI lipid-átalakítása közvetlenül a GPI kapcsolódása után kezdődik, és sok esetben a ceramid kötődését okozza a 26 szénatomos hosszú szénláncú telített zsírsavhoz (C26:0) (11, 12). A C26-os ceramid az élesztősejtek által eddig termelt fő ceramid. Az ER-ben szintetizálódik, és nagy része COPII-vezikulákon keresztül exportálódik a Golgi-készülékbe (13). A GPI-AP ER-exportja kifejezetten folyamatos ceramid-szintézist igényel (14, 15), és viszont a ceramid inozitol-foszfát-ceramiddá (IPC) történő átalakulása a Golgi-készülékben a GPI-horgony szintézisétől függ (16). Mesterséges membránokkal végzett biofizikai vizsgálatok kimutatták, hogy a nagyon hosszú acilláncú ceramidok képesek összeolvadni, és egyedi fizikai tulajdonságokkal rendelkező rendezett doméneket képezni (17, 18). Ezek az adatok arra a hipotézisre vezetnek, hogy a C26-ceramid és a C26-ceramiddal rendelkező GPI-AP fizikai tulajdonságaikat felhasználva rendezett régiókká vagy régiókká egyesülnek a viszonylag rendezetlen ER-membrán lipidkörnyezetében. A membrán főként rövid és telítetlen glicerolipidekből (C16:1 és C18:1) áll (19, 20). Ezek a régiók szelektíven specifikus ER-kilépési helyekre (ERES) fognak fókuszálódni, ahol a ceramid és a ceramid alapú GPI-AP ugyanabban a dedikált COPII vezikulában együtt szállítható a Golgi-készülékbe (5).
Ebben a tanulmányban közvetlenül teszteltük ezt a lipidalapú mechanizmust szuperfelbontású konfokális valós idejű képalkotó mikroszkópia (SCLIM) segítségével, amely egy élvonalbeli mikroszkópos technika, amely képes egyidejűleg megfigyelni a fluoreszcensen jelölt fehérjéket. A háromszínű és háromdimenziós (3D) képek rendkívül nagy felbontásúak és sebességűek élő sejtekben (21, 22).
Először az SCLIM technológiát alkalmaztuk annak további meghatározására, hogy a S. cerevisiae ER-jéből távozó transzmembrán szekretált fehérjékből hogyan szűrhető a C26 ceramid csoporttal rendelkező normál GPI-AP. Az ER osztályozásának ellenőrzésére egy olyan genetikai rendszert használtunk, amely közvetlenül képes vizualizálni az ERES-be in vivo belépő újonnan szintetizált rakományt (7, 23). Rakományként a zöld fluoreszcens fehérjével (GFP) jelölt, C26 ceramid alapú GPI-AP Gas1-et és a közeli infravörös fluoreszcens fehérjével (iRFP) jelölt Mid2 transzmembrán szekretált fehérjét választottuk, amelyek mindkettő a plazmamembránt célozza meg (24–26). A sec31-1 hőmérséklet-érzékeny mutánsban ez a két rakomány egy galaktóz által indukálható promóter és egy konstitutív ERES marker alatt expresszálódik. Szélsőséges hőmérsékleten (37°C), mivel a sec31-1 mutáció befolyásolja a COPII bevonatkomponens Sec31 funkcióját a COPII csírázásának és az ER exportjának gátlásában, az újonnan szintetizált rakomány felhalmozódik az ER-ben (23). Alacsony hőmérsékletre (24°C) való hűtés után a sec31-1 mutáns sejtek visszanyerték a szekréciós területet, és a felhalmozódott új szintetikus szállítmány elkezdődött exportálni az ER-ből. A CLIM vizualizáció azt mutatta, hogy az újonnan szintetizált Gas1-GFP és Mid2-iRFP nagy része továbbra is felhalmozódott a sec31-1 mutáns sejtek ER-jében 37°C-on történő inkubálás, majd 24°C-on 5 percig történő felszabadulás után (1. ábra). Mivel a Mid2-iRFP az egész ER membránon eloszlik, és a Gas1-GFP a diszkontinuus ER membránterületen koncentrálódik és gyűlik össze, eloszlásuk teljesen eltérő (1. ábra, A-C és S1. film). Ezenkívül, amint az 1D. ábrán látható, a Gas1-GFP klaszter nem tartalmaz Mid2-iRFP-t. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a GPI-AP és a transzmembrán fehérjék korán különböző ER membránrégiókra különültek el. A Gas1-GFP klaszter egy specifikus ERES mellett helyezkedik el, amelyet az mCherry COPII köpenyfehérjéje, a Sec13 jelöl (1. ábra, E és F, valamint S1 film) (23).
A sec31-1 sejtek galaktóz által indukált szekréciókat, egy hosszú acilláncú (C26) ceramid GPI-AP Gas1-GFP-t (GPI-AP, zöld) és a transzmembrán Mid2-iRFP fehérjét (TMP, kék) expresszálnak, és ezt a konstruktív ERES-jelölést Sec13-mCherry (ERES, bíborvörös) sejteken 37°C-on 30 percig inkubáltuk, 24°C-ra állítottuk, majd 5 perccel később SCLIM-mel képalkottuk. (A-tól C-ig) egy sík (A) reprezentatív egyesített vagy egyetlen 2D-s képét, 10 z-szelet 2D-s vetületi képét (B) vagy a rakomány és az ERES markerek 3D-s sejtfélteke képét mutatja (C). Lépték 1 μm (A és B). A léptékegység 0,551 μm (C). A Gas1-GFP-t különálló ER-régiókban vagy klaszterekben detektáltuk, míg a Mid2-iRFP-t az ER-membránban detektáltuk és elosztottuk (C). (D) A grafikon a Gas1-GFP és a Mid2-iRFP relatív fluoreszcencia-intenzitását mutatja a Gas1-GFP klaszterben a fehér nyíl vonal mentén (balra). AU, tetszőleges egység. (E és F) a jószágokat és az ERES jelölést kombináló 3D képet jelölik. A Gas1-GFP klasztereket az adott ERES közelében detektálták. A skálaegység 0,551 μm. (F) A fehér tömör nyíl az ERES-hez kapcsolódó Gas1-GFP klasztert jelöli. A középső és jobb oldali panelek a kiválasztott Gas1-GFP klaszter egyesített, nagyított 3D képét és elforgatott nézetét mutatják.
A Gas1-GFP klaszter és egy specifikus ERES közötti szoros térbeli kapcsolat azt jelzi, hogy a Gas1-GFP szelektív ERES-be léphet be, ami eltér a Mid2-iRFP által az ER elhagyására alkalmazott szelektivitástól. Ennek a lehetőségnek a vizsgálatára csak egy vagy két árucikk ERES arányát számszerűsítettük (2. ábra, A-tól C-ig). Azt tapasztaltuk, hogy a legtöbb ERES (70%) csak egyféle rakományt tartalmaz. A 2C. ábra alsó képe két tipikus példát mutat az ERES-re, amelyek csak Gas1-GFP-t (1. ábra) vagy csak Mid2-iRFP-t (2. ábra) tartalmaznak. Ezzel szemben az ERES körülbelül 20%-a két olyan rakományt tartalmaz, amelyek ugyanazon a területen átfedésben vannak. Azt találtuk, hogy egyes ERES-ek (10%) kétféle rakományt tartalmaztak, de ezek egyértelműen eltérő területeken izolálódtak. Ezért ez a statisztikai elemzés azt mutatja, hogy az ER exportálása után a GPI-AP Gas1-GFP és a transzmembrán rakomány Mid2-iRFP különböző ERES-ekre oszlik (2D. ábra). Ez a válogatási hatékonyság nagyon összhangban van a korábbi biokémiai elemzéssel (6) és morfológiai meghatározással (7). Megfigyelhetjük a karanténba helyezett szállítmány ERES-be belépő viselkedését is (2E. ábra és S2. videó). A 2E. ábra azt mutatja, hogy a Gas1-GFP-nek (3. panel) vagy a Mid2-iRFP-nek (4. panel) csak kis része jut be az ERES-be az egyik oldalról, és egy különálló területre korlátozódik. A 2E. ábra 5. panelje azt mutatja, hogy a Gas1-GFP és a Mid2-iRFP néha ugyanabban az ERES-ben található, de különböző oldalakról lépnek be, és különálló régiókban koncentrálódnak, amelyek különböző COPII vezikulákat képviselhetnek. Azt is megerősítettük, hogy a C26 ceramid alapú GPI-AP Gas1 megfigyelt elválasztása és szelektív ERES-ként való besorolása specifikus, mivel egy másik transzmembrán szekréciós szállítmány, a GFP-vel jelölt plazmamembrán fehérje, az Axl2 (27) hasonló viselkedést mutat, mint a Mid2-iRFP. (S1. kép és S3. videó). Az újonnan szintetizált Axl2-GFP a Mid2-iRFP-hez hasonlóan oszlik el az ER membránon keresztül (S1., A és B ábra), és a legtöbb ERES-ben kolokalizálódik a Mid2-iRFP-vel (S1., B-D ábra). Az 1. ábra 1. és 2. paneljei. Az S1C ábra két tipikus ERES-példát mutat be, ahol két transzmembrán rakomány átfedésben van. Ezekben az esetekben mindkét áru együtt lép be az ERES-be (S1E ábra, 3. panel és S3 videó).
A galaktóz által indukált szekréciókat, a Gas1-GFP-t (GPI-AP, zöld) és Mid2-iRFP-t (TMP, kék) expresszáló sec31-1 sejteket, valamint a konstitutív ERES jelölést tartalmazó Sec13-mCherry-t (ERES, bíborvörös) 37 °C-ra helyeztük. 30 perces °C-on történő inkubálás után 24 °C-ra állítottuk be a szekréciós blokk felszabadítása érdekében, majd 20 perc elteltével SCLIM-mel képalkotást végeztünk. (A-tól C-ig) A rakomány és az ERES-szel jelölt 10 z-metszet reprezentatív 2D-s vetületi képei (A; méretarány, 1 μm) vagy 3D-s sejtfélteke-képei (B és C; méretarány, 0,456 μm). A (B) alsó panelje és a (C) panel feldolgozott képeket mutat, amelyek csak az ERES-ben jelen lévő árukat (bíborvörös) [Gas1-GFP (szürke) és Mid2-iRFP (világoskék)] mutatják. (C) Nyílt nyíl: Az ERES csak egy darab rakományt szállít (1-től 4-ig). Szürke nyíl: Az ERES szegregált rakományt tartalmaz (5). Fehér teli nyíl: Az ERES együtt elhelyezkedő rakományt tartalmaz. Lent: A kiválasztott egyetlen ERES csak Gas1-GFP-t (1) vagy Mid2-iRFP-t (2) tartalmaz. Léptéksáv, 100 nm. (D) A (C)-ben leírt mikrofotográfia mennyiségi meghatározása. Az ERES átlagos százalékos aránya, amely csak egy rakományt (Gas1-GFP vagy Mid2-iRFP), szegregált rakományt és átfedő rakományt tartalmaz. Három független kísérletben n=432 54 cellában. Hibasáv = SD. Kétoldalú párosítatlan t-próba. *** P = 0,0002. (E) A (C)-vel jelölt karanténba helyezett rakomány kiválasztott ERES-ének 3D-s képe. A Gas1-GFP (zöld) (3) vagy a Mid2-iRFP (kék) (4) az egyik oldalról lép be az ERES-be (bíborvörös), és az ERES-en belül egy kis területre korlátozódik. Néha mindkét típusú rakomány ugyanabba az ERES-be (5) jut be ugyanarról az oldalról, és az ERES-en belül egy elszigetelt területre korlátozódik. Méretsáv, 100 nm.
Ezután azt a hipotézist teszteltük, hogy az ER membránban jelen lévő hosszú acilláncú ceramid (C26) a Gas1 specifikus klaszterezését és szelektív ERES-be történő szortírozását hajtja végre. Ehhez egy módosított GhLag1 élesztőtörzset használtunk, amelyben a két endogén ceramid szintázt, a Lag1-et és a Lac1-et GhLag1 (a pamut Lag1 homológja) helyettesítette, így egy olyan élesztőtörzset kaptunk, amelynek sejtmembránjában a ceramid törzs rövidebb, mint a vad típusé (3A. ábra) (28). A tömegspektrometriás (MS) analízis kimutatta, hogy a vad típusú törzsekben a teljes ceramid 95%-a nagyon hosszú (C26) láncú ceramid, míg a GhLag1-ben a ceramid 85%-a nagyon hosszú (C18 és C16). A ceramidnak csak 2%-a nagyon hosszú (C26) láncú ceramid. Bár a GhLag1 membránban eddig a C18 és C16 ceramidok a fő ceramidok, az MS-analízis azt is megerősítette, hogy a GhLag1 törzsben expresszált Gas1-GFP GPI-horgonya C26 ceramidot tartalmaz, amely összehasonlítható a vad típusú lipidekkel. A minőség ugyanaz (3A. ábra) (26). Ez tehát azt jelenti, hogy a Cwh43 ceramid-átalakító enzim nagymértékben szelektív a C26 ceramidra, amint az a 26. ábrán látható, és előnyben részesíti a GhLag1 törzsben található kis mennyiségű C26 ceramid GPI-horgonyát. S2 (29). Mindazonáltal a GhLag1 sejtmembránja alapvetően csak C18-C16 ceramidot tartalmaz, míg a Gas1-GFP továbbra is tartalmaz C26 ceramidot. Ez a tény ideális eszközzé teszi ezt a törzset a membrán-ceramid acillánc-hosszának problémájának konkrét megoldására az ER-ben. Az osztályozás és a rendezés hipotetikus szerepe. Ezután először a C26 Gas1-GFP azon képességét vizsgáltuk, hogy klaszterekben akkumulálódik-e a sec31-1 hőmérséklet-érzékeny mutáns alléljával rendelkező GhLag1-ben hagyományos fluoreszcens mikroszkópiával, ahol csak a hosszú (C18-C16) lánc található az ER membrán ceramidjában (3. ábra). Megfigyeltük, hogy a sec31-1-ben a Gas1-GFP nagy része klaszterekben koncentrálódott, míg a hosszú (C18-C16) hosszú ceramid ER membránnal rendelkező sec31-1 GhLag1 Gas1-GFP-jében a Gas1-GFP nagy része nem klasztereződött, és az egész ER membránban eloszlott. Pontosabban, mivel a C26 ceramid alapú klaszterezés szorosan kapcsolódik a specifikus ERES-hez (1. ábra), ezt követően megvizsgáltuk, hogy ez a folyamat magában foglalhatja-e az ER exportfehérje mechanizmusának működését is. A GPI-AP egy speciális COPII rendszert használ az ER exporthoz, amelyet a Ted1 GPI horgony glikán részének szerkezeti átalakítása aktívan szabályoz (30, 31). A rekombináns GPI-glikánt ezután a transzmembrán cargo receptor p24 komplex ismeri fel, amely viszont szelektíven toborozza az Lst1-et, amely a fő COPII cargo kötő alegység, a Sec24 specifikus izoformája, így egy GPI-AP-gazdag COPII vezikulákat képezve (31-33). Ezért létrehoztunk egy kettős mutánst, amely ezen egyedi fehérjék (a p24 komplex komponense, a Ted1 GPI-glikán átalakító enzim és a specifikus COPII alegység, az Lst1) delécióját kombinálta a sec31-1 mutáns törzzsel, és megvizsgáltuk, hogy lehetséges-e Gas1-klaszter GFP-t létrehozni (3. ábra). Megfigyeltük, hogy a sec31-1emp24Δ és a sec31-1ted1Δ törzsekben a Gas1-GFP főként klaszterezetlenül található, és az ER membránban oszlik el, ahogyan azt korábban a sec31-1 GhLag1-ben is megfigyeltük, míg a sec31-1lst1Δ-ben a Gas1-GFP a sec31-1-hez hasonlóan működik. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a C26 ceramid jelenléte mellett az ER membránban a Gas1-GFP klasztereződéséhez a p24 komplexhez is kötődni kell, és nem igényel specifikus Lst1 toborzást. Ezután azt vizsgáltuk, hogy a ceramid lánchossza az ER membránban szabályozhatja-e a Gas1-GFP p24-hez való kötődését. Azt tapasztaltuk azonban, hogy a C18-C16 ceramid jelenléte a membránban nem befolyásolja a p24 komplex által rekonstruált GPI-glikánokat (S3. és S4., A és B ábra), illetve a GPI-AP-hez való kötődést és a GPI-AP exportálását. COPII Lst1 altípus toborzásának képessége (S4C ábra). Ezért a C26 ceramid-függő klaszterezéshez nem szükséges fehérje kölcsönhatás különböző ER exportfehérje-mechanizmusokkal, hanem egy alternatív, a lipidhossz által vezérelt rendezési mechanizmust támogat. Ezután elemeztük, hogy az ER membránban lévő ceramid acil-lánchossz fontos-e a Gas1-GFP szelektív ERES-ként való hatékony besorolásához. Mivel a rövid szénláncú ceramidot tartalmazó GhLag1 törzsben a Gas1 elhagyja az ER-t és belép a plazmamembránba (S5. ábra), úgy véljük, hogy ha a szortírozást a ceramid acil-lánc hossza vezérli, akkor a GhLag1 törzsben a Gas1 átirányítható és keresztezhető. Az ERES termékek ugyanazzal a membránnal rendelkeznek.
(A) A GhLag1 sejtmembránja főként rövidebb C18-C16 ceramidokat tartalmaz, míg a Gas1-GFP GPI horgonya továbbra is ugyanolyan C26 IPC-vel rendelkezik, mint a vad típusú sejtek. Fent: a ceramid acillánc hosszának elemzése vad típusú (Wt) és GhLag1p törzsek sejtmembránjában tömegspektrometriával (MS). Az adatok a teljes ceramid százalékos arányát jelentik. Három független kísérlet átlaga. Hibasáv = SD. Kétoldali párosítatlan t-próba. **** P <0,0001. Alsó panel: A Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI horgonyban jelen lévő IPC acillánc hosszának MS-analízise a vad típusú és GhLag1p törzsekben. Az adatok a teljes IPC jel százalékos arányát jelentik. Öt független kísérlet átlaga. Hibasáv = SD. Kétoldali párosítatlan t-próba. ns, nem fontos. P = 0,9134. (B) Galaktóz által indukált Gas1-GFP-t expresszáló sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ és sec31-1lst1Δ sejtek fluoreszcens mikroszkópos felvételei. A felvételeket 37°C-on 30 percig inkubáltuk, majd 24°C után rutin fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatra vittük át. Fehér nyíl: ER Gas1-GFP klaszter. Nyitott nyíl: A klaszterezetlen Gas1-GFP az egész ER membránon oszlik el, az ER-re jellemző nukleáris gyűrűfestődést mutatva. Skála, 5 μm. (C) A (B)-ben leírt mikroszkópos felvétel mennyiségi meghatározása. A pontozott Gas1-GFP szerkezettel rendelkező sejtek átlagos százalékos aránya. Három független kísérletben n≥300 sejt. Hibasáv = SD. Kétoldali párosítatlan t-próba. **** P <0,0001.
A probléma közvetlen megoldása érdekében SCLIM vizualizációt végeztünk a Gas1-GFP és a Mid2-iRFP esetében a GhLag1-ben a sec31-1 hőmérséklet-érzékeny mutáns alléllal (4. ábra és S4. videó). Miután az ER-t 37°C-on tartottuk, majd 24°C-on felszabadítottuk, az újonnan szintetizált Gas1-GFP nagy része nem csoportosult és nem oszlott el az ER membránjában, ahogyan azt a hagyományos mikroszkópok megfigyelték (4. ábra, A és B). Ezenkívül az ERES nagy százaléka (67%) kétféle rakományt tartalmaz együtt (4D. ábra). A 4C. ábra 1. és 2. panelje az ERES két tipikus példáját mutatja átfedő Gas1-GFP és Mid2-GFP esetén. Ezenkívül mindkét jószág ugyanabba az ERES-be került (4E. ábra, 3. panel és S4. videó). Eredményeink tehát azt mutatják, hogy az ER membránban lévő ceramid-acil-lánc hossza fontos meghatározója az ER fehérje aggregációjának és osztályozásának.
Galaktóz által indukált szekréciót expresszáló Sec31-1 GhLag1 sejtek, Gas1-GFP (GPI-AP, zöld) és Mid2-iRFP (TMP, kék), valamint konstitutív ERES-sel jelölt Sec13-mCherry (ERES, bíborvörös) 37°C-on inkubáljuk. Folytassuk 30 percig, majd hűtsük le 24°C-ra a szekrétum felszabadításához, és 20 perc elteltével képalkotást végezzünk SCLIM-mel. (A-tól C-ig) A rakomány és az ERES által jelölt 10 z-szelet reprezentatív 2D-s vetületi képei (A; léptéksáv, 1 μm) vagy 3D-s sejtfélteke képei (B és C; léptékegység, 0,45 μm). A (B) alsó panelje és a (C) panel feldolgozott képeket jelenít meg, amelyek csak az ERES-ben jelen lévő árukat (bíborvörös) [Gas1-GFP (szürke) és Mid2-iRFP (világoskék)] mutatják. (C) Fehérrel kitöltött nyíl: ERES, áruk átfedésben. Nyílt nyíl: Az ERES csak egy elemet tartalmaz. Alsó panel: A kiválasztott ERES átfedő árukat (1 és 2) tartalmaz, amelyeket (C)-vel jelöltünk. Léptéksáv, 100 nm. (D) A (C)-ben leírt mikrofotográfia mennyiségi meghatározása. A sec31-1 és sec31-1 GhLag1 egységekben csak egy rakomány (Gas1-GFP vagy Mid2-iRFP) szerepel, és az ERES átlagos százalékos aránya az izolált és az átfedő rakomány esetében. Három független kísérletben n = 432 54 sejtben (sec31-1) és n = 430 47 sejtben (sec31-1 GhLag1). Hibasáv = SD. Kétoldali párosítatlan t-próba. *** P = 0,0002 (sec31-1) és ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) A kiválasztott ERES 3D-s képe az átfedő rakományokkal (3), amelyeket (C)-vel jelöltünk. A Gas1-GFP (zöld) és a Mid2-iRFP (kék) ugyanazon oldalról közelítik meg az ERES-t (bíborvörös), és ugyanazon az ERES korlátozott területen maradnak. Léptéksáv, 100 nm.
Ez a tanulmány közvetlen in vivo bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a lipidalapú fehérjerakományok szelektív exporthelyekre osztályozódnak a szekréciós útvonalon, és feltárja az acillánc hosszának fontosságát az osztályozás szelektivitása szempontjából. Egy hatékony és élvonalbeli mikroszkópos technika, az SCLIM segítségével bemutattuk az újonnan szintetizált Gas1-GFP-t (egy fő plazmamembrán GPI-AP-t, amely egy nagyon hosszú acilláncú (C26) ceramid lipid résszel rendelkezik) élesztőben. A különálló ER-ekben (ER) csoportosuló régiók specifikus ERES-hez kapcsolódnak, míg a transzmembrán szekretált fehérjék az ER membránban oszlanak el (1. ábra). Ezenkívül ez a két típusú áru szelektíven belép a különböző ERES-ekbe (2. ábra). A sejtes ceramid acilláncának hossza a membránban C26-ról C18-C16-ra csökken, a Gas1-GFP klaszter a különálló ER régióba bomlik, és a Gas1-GFP átirányul, hogy a transzmembrán fehérjével együtt ugyanazon az ERES-en keresztül távozzon az ER-ből (3. és 4. ábra).
Bár a GPI-AP egy specializált fehérjemechanizmust használ az ER-ből való kilépéshez, azt találtuk, hogy a C26 ceramid-függő elválasztás nem a differenciális fehérje-kölcsönhatásokon alapul, amelyek az ERES specializációjához vezethetnének (S4. és S5. ábra). Ehelyett eredményeink egy alternatív osztályozási mechanizmust támogatnak, amelyet a lipidalapú fehérjecsoportosulás és más rakományok későbbi kizárása vezérel. Megfigyeléseink azt mutatják, hogy egy adott ERES-hez kapcsolódó Gas1-GFP régióból vagy klaszterből hiányzik a transzmembrán szekretált Mid2-iRFP fehérje, ami azt jelzi, hogy a C26 ceramid-függő GPI-AP klaszter elősegíti a bejutásukat a megfelelő ERES-be, és ugyanakkor kizárja a transzmembrán szekretált fehérjéket ebbe az adott ERES-be (1. és 2. ábra). Ezzel szemben a C18-C16 ceramidok jelenléte az ER membránban nem okozza a GPI-AP régiók vagy klaszterek kialakulását, így nem zárják ki vagy helyettesítik a transzmembrán szekretált fehérjéket ugyanabban az ERES-ben (3. és 4. ábra). Ezért azt feltételezzük, hogy a C26 ceramid elősegíti az elválasztást és az osztályozást azáltal, hogy elősegíti a specifikus ERES-hez kapcsolódó fehérjék klasztereződését.
Hogyan érhető el ez a C26 ceramid-függő klasztereződés egy adott ER-területen? A membrán ceramidjának laterális szétválására való hajlama miatt a GPI-AP és a C26 ceramid kis és azonnal rendezett lipideket képezhet az ER membrán szabálytalanabb lipidkörnyezetében, amely rövidebb és telítetlen glicerolipideket tartalmaz. Minőségi klaszterek (17, 18). Ezek a kis ideiglenes klaszterek a p24 komplexhez való kötődés után tovább fúzióval nagyobb, stabilabb klaszterekké alakulhatnak (34). Ezzel összhangban kimutattuk, hogy a C26 Gas1-GFP-nek kölcsönhatásba kell lépnie a p24 komplexszel ahhoz, hogy nagyobb látható klasztereket képezzen (3. ábra). A p24 komplex egy heterozigóta oligomer, amely négy különböző p24 transzmembrán fehérjéből áll az élesztőben (35), amely többértékű kötődést biztosít, ami a kis GPI-AP klaszterek keresztkötéséhez vezethet, ezáltal nagyobb stabil klasztert generálva (34). A GPI-AP-k fehérje-ektodoménjei közötti kölcsönhatás szintén hozzájárulhat aggregációjukhoz, amint azt az emlősök polarizált hámsejtjeiben végzett Golgi-transzportjuk során is kimutatták (36). Amikor azonban a C18-C16 ceramid jelen van az ER membránban, amikor a p24 komplex a Gas1-GFP-hez kötődik, nagy, különálló klaszterek nem képződnek. Az alapul szolgáló mechanizmus a hosszú acilláncú ceramid specifikus fizikai és kémiai tulajdonságaitól függhet. A mesterséges membránok biofizikai vizsgálatai azt mutatják, hogy bár mind a hosszú (C24), mind a rövid (C18-C16) acilláncú ceramidok fázisszétválást okozhatnak, csak a hosszú acilláncú ceramidok (C24) képesek elősegíteni a magas görbületet és a film hajlítását a film átalakítása érdekében. Kölcsönös hivatkozás révén (17, 37, 38). Kimutatták, hogy a TMED2, az Emp24 humán homológjának transzmembrán hélixe szelektíven kölcsönhatásba lép a C18 ceramid alapú szfingomielinnel a citoplazmatikus lebenykékben (39). Molekuladinamikai (MD) szimulációk segítségével azt találtuk, hogy mind a C18, mind a C26 ceramidok felhalmozódnak az Emp24 transzmembrán hélix citoplazmatikus lebenykéi körül, és hasonló preferenciákkal rendelkeznek (S6. ábra). Érdemes megjegyezni, hogy ez arra utal, hogy az Emp24 transzmembrán hélixe a lipidek aszimmetrikus eloszlásához vezethet a membránban. Ez egy újabb eredmény, emlőssejteken alapulva. Hasonló MD-szimulációk éterlipidek jelenlétét is mutatják (40). Ezért feltételezzük, hogy az ER26 két lebenykéjében a C26 ceramid lokálisan feldúsul. Amikor a luminális lebenykékben a GPI-AP közvetlenül kötődik a többértékű p24-hez, és a C26 ceramid felhalmozódik a p24 körül a citoplazmatikus lebenykékben, az elősegítheti a kísérő fehérjeaggregációt és a membrán görbületét az ujjakon keresztül (41), ami a GPI-AP ERES-hez közeli különálló régiókra való szétválását okozza, ami szintén az ER-membrán erősen görbült régióinak kedvez (42). Korábbi jelentések alátámasztották a javasolt mechanizmust (43, 44). Az oligolektinek, kórokozók vagy antitestek többértékű kötődése a ceramid alapú glikoszfingolipidekhez (GSL) a plazmamembránon nagymértékű GSL-aggregációt vált ki, fokozza a fázisszétválást, és membrándeformációt és internalizációt okoz (44). Iwabuchi stb. (43) Megállapították, hogy hosszú (C24), de nem rövid (C16) acilláncok jelenlétében a GSL laktozilceramidhoz kötött többértékű ligand nagy klaszterek kialakulását és membráninvaginációt indukált, és a citoplazmában a Lyn által közvetített jelátvitel a levélkéken a kapcsolt neutrofilekben az acilláncok által összekapcsolódva zajlik.
Emlősök polarizált hámsejtjeiben az anti-Golgi hálózat (TGN) apikális plazmamembrán szintjén való koncentrációja szabályozza a GPI-AP szétválasztását és szortírozását (10, 45). Ezt az aggregációt a GPI-AP oligomerizációja hajtja (36), de függhet az élesztőben található ceramid lánc hosszától is. Bár az emlősök GPI-AP-je éter lipid alapú horgonyzóval rendelkezik, és kémiai szerkezete nagyon eltér a nagyon hosszú acilláncú ceramidtól, egy újabb tanulmány megállapította, hogy mindkét lipid evolúciósan hasonló fizikai és kémiai tulajdonságokkal és funkcióval rendelkezik (40). Ezért az emlőssejtek éterlipid része hasonló lehet az élesztő C26 ceramidjához, és szerepe az, hogy a membránban lévő hosszú szénláncú ceramiddal kapcsolódva elősegítse a GPI-AP aggregációját és szortírozását. Bár ezt a lehetőséget még közvetlenül kell vizsgálni, a korábbi eredmények alátámasztják, hogy a hosszú acilláncú ceramid Golgi-testbe történő transzportját nem citoplazmatikus transzferfehérjék végzik, hanem az élesztőhöz hasonlóan a GPI horgonyok szintézisétől függ. Ezért úgy tűnik, hogy az evolúciós konzervatív mechanizmus képes szelektíven együtt szállítani a nagyon hosszú acilláncú ceramidot és a GPI-AP-t (13, 16, 20, 46, 47) ugyanabban a transzportvezikulában.
Élesztő és emlős polarizált hámsejt-rendszerekben a GPI-AP aggregációja és elválasztása más plazmamembránfehérjéktől mind a sejtfelszín elérése előtt megtörténik. Paladino és munkatársai (48) kimutatták, hogy az emlős polarizált hámsejtek TGN-jén a GPI-AP klasztereződés nemcsak a GPI-AP-k apikális plazmamembránba történő szelektív besorolásához szükséges, hanem szabályozza a GPI-AP-k klasztereződési szerveződését és biológiai aktivitását is. Sejtfelszín. Élesztőben ez a tanulmány kimutatta, hogy az ER-en található C26 ceramid-függő GPI-AP klaszter szabályozhatja a GPI-AP klasztereződést és funkcionális aktivitását a plazmamembránon (24, 49). Ezzel a modellel összhangban a GhLag1 sejtek allergiásak a GPI-gátlókra vagy a sejtfal integritását befolyásoló gyógyszerekre (28), és az élesztősejtek párosodásakor kivetített csúcsi ceramid funkcionális Gas1-GFP klasztereinek (49) szükségessége a hLag1 sejtek G​​​ lehetséges fiziológiai következményeire utal. GPI-AP hiba. A jövőbeli kutatásaink tárgya azonban az lesz, hogy a sejtfelszín funkcionális szerveződését az ER-ből programozták-e a lipidhosszon alapuló válogatási módszerrel.
A munkában felhasznált Saccharomyces cerevisiae törzseket az S1. táblázat sorolja fel. Az élő sejtek képalkotásához használt SCLIM MMY1583 és MMY1635 törzseket a W303 hátterében állították elő. Ezeket a fluoreszcens fehérjejelöléssel ellátott Sec13-mCherry-t expresszáló törzseket polimeráz láncreakción (PCR) alapuló módszerrel állították elő, pFA6a plazmidot használva templátként (23). A GAL1 promoter szabályozása alatt fluoreszcens fehérjével jelölt Mid2-iRFP-t expresszáló törzset a következőképpen állították elő. A pKTiRFP-KAN vektorból (E. O'Shea ajándéka, Addgene plazmid száma: 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; kutatási erőforrás-azonosító (RRID): Addgene_64687) származó iRFP-KanMx szekvencia PCR amplifikációja, és az endogén Mid2 C-terminálisába való beillesztés. Miután a Mid2-iRFP genom szekvenciát amplifikáltuk és a GAL1 promóterbe klónoztuk, azt a pRS306 integrációs plazmid Not I-Sac I helyére integráltuk. A kapott pRGS7 plazmidot Pst I enzimmel linearizáltuk, hogy integrálódjon az URA3 lókuszba.
A Gas1-GFP fúziós gén a GAL1 promoter szabályozása alatt expresszálódik a centromér (CEN) plazmidban, amelyet a következőképpen állítottak össze. A Gas1-GFP szekvenciát PCR-rel amplifikálták a pRS416-GAS1-GFP plazmidból (24) (L. Popolo ajándéka), és a pBEVY-GL LEU2 CEN plazmid (C ajándéka) Xma I–Xho I helyére klónozták. Miller; Addgene plazmid száma: 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). A kapott plazmidot pRGS6-nak nevezték el. Az Axl2-GFP fúziós gén szintén a pBEVY-GL LEU2 vektor GAL1 promoter szabályozása alatt expresszálódik, és a felépítése a következő. Az Axl2-GFP szekvenciát PCR-rel amplifikáltuk a pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plazmidból (23), majd a pBEVY-GL LEU2 vektor BamHI-PstI helyére klónoztuk. A kapott plazmidot pRGS12-nek neveztük el. A vizsgálatban használt oligonukleotidok szekvenciáját az S2. táblázat tartalmazza.
A törzset szénforrásként 0,2% adeninnel és 2% glükózzal [YP-dextróz (YPD)], 2% raffinózzal [YP-raffinóz] gazdag élesztőkivonat-protein p (YP) táptalajjal (1% élesztőkivonat és 2% protein ept. (YPR)] vagy 2% galaktózzal [YP-galaktóz (YPG)] egészítették ki, vagy szintetikus minimál táptalajban (0,15% élesztő-nitrogénbázis és 0,5% ammónium-szulfát) pótolták a táplálkozáshoz szükséges megfelelő aminosavakat és bázisokat, és szénforrásként 2% glükózt (szintetikus glükóz minimál táptalaj) vagy 2% galaktózt (szintetikus galaktóz minimál táptalaj) tartalmaztak.
Valós idejű képalkotáshoz a GAL1 promóter alatt a konstrukciót expresszáló hőmérséklet-érzékeny sec31-1 mutáns sejteket YPR táptalajon tenyésztettük 24°C-on egy éjszakán át a log fázis közepéig. Miután YPG-ben 1 órán át indukciót végeztünk 24°C-on, a sejteket 30 percig SG-ben inkubáltuk 37°C-on, majd 24°C-ra vittük át, hogy kiszabaduljanak a szekréciós blokkból. A sejteket konkanavalin A-val fixáltuk üveg tárgylemezen, és SCLIM-mel képalkottuk. Az SCLIM egy Olympus IX-71 inverz fluoreszcens mikroszkóp és egy UPlanSApo 100×1,4 numerikus apertúrájú olajlencse (Olympus), egy nagy sebességű és nagy jel-zaj viszonyok között működő forgótárcsás konfokális szkenner (Yokogawa Electric), egy egyedi spektrométer és egy egyedi hűtés kombinációja. A rendszer képerősítője (Hamamatsu Photonics) egy 266,7-szeres végső nagyítású nagyítólencse-rendszert és egy elektronokat sokszorozó töltéscsatolt eszközkamerát (Hamamatsu Photonics) tud biztosítani (21). A képalkotást egyedi szoftverrel (Yokogawa Electric) végeztük. 3D képek készítéséhez egy egyedi készítésű piezoelektromos aktuátort használtunk az objektívlencse függőleges rezgetésére, és az optikai részeket 100 nm távolságra egy halomba gyűjtöttük. A Z-halmot 3D voxel adatokká alakítottuk, és a forgókorongos konfokális mikroszkóphoz használt elméleti pontszórási függvényt használtuk a dekonvolúciós feldolgozáshoz a Volocity szoftverrel (PerkinElmer). A Volocity szoftver segítségével automatikusan küszöbértéket állítottunk be a kolokációs elemzéshez, és az ERES-t, beleértve a rakományt is, mértük. A vonalas pásztázási elemzést a MetaMorph szoftverrel (Molecular Devices) végeztük.
A statisztikai szignifikancia meghatározásához használja a GraphPad Prism szoftvert. A kétoldalú Student-féle t-próbánál és a hagyományos egyutas varianciaanalízis (ANOVA) tesztnél a csoportok közötti különbségeket a P <0,05 (*) értékre gyakorolt ​​szignifikáns hatásnak tekintjük.
A Gas1-GFP fluoreszcens mikroszkópiájához a log fázisú sejteket egy éjszakán át YPD-ben tenyésztettük, majd centrifugálással összegyűjtöttük, kétszer mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal, és legalább 15 percig jégen inkubáltuk, majd a korábban leírtak szerint mikroszkóp alatt vizsgáltuk (Check) (24). Az akvizícióhoz Leica DMi8 mikroszkópot (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) használtunk, amely objektívvel, L5 (GFP) szűrővel, Hamamatsu kamerával és Application Suite X (LAS X) szoftverrel volt felszerelve.
A mintákat SDS mintapufferben denaturáltuk 65°C-on 10 percig, majd SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (PAGE) választottuk szét. Az immunoblot analízishez sávonként 10 μl mintát vittünk fel. Elsődleges antitest: Nyúl poliklonális anti-Gas1 1:3000 hígításban, nyúl poliklonális anti-Emp24 1:500 hígításban és nyúl poliklonális anti-GFP (H. Riezman ajándéka) 1:3000 hígításban. Az egér monoklonális anti-Pgk1 antitestet 1:5000 hígításban használtuk (J. de la Cruz ajándéka). Másodlagos antitest: Torma-peroxidázzal (HRP) konjugált kecske anti-nyúl immunglobulin G (IgG) 1:3000 hígításban (Pierce). HRP-konjugált kecske anti-egér IgG 1:3000 hígításban (Pierce). Az immunválasz zónát a SuperSignal West Pico reagens (Thermo Fisher Scientific) kemilumineszcencia módszerével figyeltük meg.
A (31)-ben leírtak szerint természetes immunprecipitációs kísérletet végeztünk a dúsított ER-frakción. Röviden, az élesztősejteket TNE-pufferrel [50 mM trisz-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilszulfonil-fluorid és proteáz inhibitor keverék] mostuk 600 nm-en (OD600) 100-as optikai sűrűségnél kétszer. Üveggyöngyökkel feltörtük, majd a sejttörmeléket és az üveggyöngyöket centrifugálással eltávolítottuk. A felülúszót ezután 17 000 g-vel 15 percig 4°C-on centrifugáltuk. A pelletet TNE-ben reszuszpendáltuk, és digitálisz szaponint adtunk hozzá 1% végső koncentrációban. A szuszpenziót 1 órán át forgatás közben 4°C-on inkubáltuk, majd az oldhatatlan komponenseket 13 000 g-vel 4°C-on 60 percig centrifugáltuk. A Gas1-GFP immunprecipitációhoz először előinkubáljuk a mintát üres agaróz gyöngyökkel (ChromoTek) 4°C-on 1 órán át, majd inkubáljuk GFP-Trap_A-val (ChromoTek) 4°C-on 3 órán át. Az immunprecipitált gyöngyöket ötször mostuk 0,2% digoxigenint tartalmazó TNE-vel, SDS mintapufferrel eluáltuk, SDS-PAGE-on elválasztottuk, és immunoblottal elemeztük.
A (31)-ben leírtak szerint a dúsított ER-frakción keresztkötés-meghatározást végeztünk. Röviden, a dúsított ER-frakciót 0,5 mM ditiobisz(szukcinimidil-propionát)-tal (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 perc) inkubáltuk. A keresztkötési reakciót glicin hozzáadásával állítottuk le (50 mM végső koncentráció, 5 perc, 20°C).
Amint azt korábban leírtuk (50), elvégeztük a ceramid MS-analízisét vad típusú és GhLag1 törzsekben. Röviden, a sejteket exponenciális fázisig (3-4 OD600 egység/ml) növesztettük YPD-ben 30°C-on, majd 25×107 sejtet gyűjtöttünk be. Anyagcseréjüket triklór-ecetsavval állítottuk le. Extrakciós oldószert [etanol, víz, éter, piridin és 4,2 N ammónium-hidroxid (15:15:5:1:0,018 v/v)] és 1,2 nmol belső standard C17 ceramidot (860517, Avanti poláris lipid) használtunk. Monometil-amin reagenst [metanol, víz, n-butanol és metil-amin oldat (4:3:1:5 v/v)] használtunk a kivonat enyhén lúgos hidrolíziséhez, majd vízzel telített n-butanollal sómentesítettük. Végül a kivonatot pozitív módú oldószerben [kloroform/metanol/víz (2:7:1) + 5 mM ammónium-acetát] reszuszpendáltuk, és a tömegspektrométerbe injektáltuk. A szfingolipid molekulák azonosítása és mennyiségi meghatározása céljából több reakciót monitorozó (MRM) vizsgálatot végeztünk. A TSQ Vantage tercier kvadrupól tömegspektrométer (Thermo Fisher Scientific) egy robot nanoáramlásos ionforrással, a Nanomate HD-vel (Advion Biosciences, Ithaca, NY) van felszerelve a lipidanalízishez. Az ütközési energiát minden ceramid kategóriára optimalizáltuk. Az MS adatokat pozitív módban kaptuk. Minden biológiai replikátum esetében a lipidjel három független mérés mediánja.
A (31)-ben leírtak szerint a Gas1-GFP-t expresszáló sejteket (800×107) természetes immunprecipitációnak vetettük alá. A tisztított Gas1-GFP-t SDS-PAGE-vel választottuk szét, és polivinilidén-fluorid (PVDF) membránra vittük át. A fehérjét PVDF amidfekete festésével tettük láthatóvá. A Gas1-GFP sávot kivágtuk a PVDF-ből, és ötször mostuk metanollal, egyszer pedig folyadékkromatográfiás-MS (LC-MS) minőségű vízzel. A membráncsíkot 500 μl 0,3 M NaOAc-val (pH 4,0), pufferrel és 500 μl frissen oldott 1 M nátrium-nitrit keverékkel 37°C-on 3 órán át inkubáltuk, majd a lipidfrakció felszabadult a Gas1-GFP-ből és lizáltuk. Az inozin-foszfát-ceramid felszabadulása glükózamin és inozitol között (51). Ezt követően a membráncsíkot négyszer mostuk LC-MS minőségű vízzel, szobahőmérsékleten szárítottuk, és nitrogénatmoszférában, -80°C-on tároltuk az elemzésig. Kontrollként minden kísérlethez egy PVDF membrán vakmintát használtunk. A Gas1-GFP-ből kivont lipidet ezután MS-sel elemeztük a leírtak szerint (50). Röviden, a GPI-lipidet tartalmazó PVDF csíkokat 75 μl negatív formázó oldószerben [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM ammónium-acetát] reszuszpendáltuk, és elektrospray ionizációs (ESI) - MRM/MS szfingolipid fajok analízisének (TSQ Vantage) vetettük alá. Ebben az esetben az MS adatokat negatív ion módban kaptuk.
Amint azt korábban említettük, a GPI-horgony lipid részét elválasztottuk a [3H]-inozitol-jelölt GPI-AP-től (16). A lipideket vékonyréteg-kromatográfiával választottuk el oldószerrendszer (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) alkalmazásával, és FLA-7000 (Fujifilm) segítségével vizualizáltuk.
A Gas1-GFP-t (600×107) expresszáló sejteket kétszer mostuk TNE pufferrel TNE pufferrel, üveggyöngyökkel feltörtük, majd centrifugáltuk a sejttörmelék és az üveggyöngyök eltávolítása érdekében. A felülúszót ezután 17 000 g-vel centrifugáltuk 1 órán át 4°C-on. A pelletet TNE-ben mostuk, és 1 U PI-PLC-vel (Invitrogen) inkubáltuk 0,2% digitálisz szaponint tartalmazó TNE-ben 1 órán át 37°C-on. Az enzimes kezelés után a membránt 17 000 g-vel 4°C-on 1 órán át centrifugálással eltávolítottuk. A Gas1-GFP immunprecipitációjához a felülúszót GFP-Trap_A-val (ChromoTek) inkubáltuk 4°C-on egy éjszakán át. Az SDS-PAGE-val elválasztott tisztított Gas1-GFP-t Coomassie brilliant blue-val festettük. A Gas1-GFP festősávot levágtuk az akveduktot körülvevő szürke sávról, majd jód-acetamiddal alkileztük és ditiotreitollal redukciót végeztünk, és tripszinnel gélen belüli emésztést végeztünk. A triptikus peptideket és a GPI-glikánokkal rendelkező peptideket extraháltuk és szárítottuk. A szárított peptidet 20 μl vízben oldottuk. Egy részletet (8 μl) injektáltunk a folyadékkromatográfiás kolonnába (LC). A peptidek elválasztásához oktadecil-szilán (ODS) oszlopot (Develosil 300ODS-HG-5; belső átmérő 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japán) használtunk specifikus gradiens körülmények között. A mozgó fázis az A oldószer (0,08% hangyasav) és a B oldószer (0,15% hangyasav 80%-os acetonitrilben). Egy Accela HPLC rendszert (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) használtunk az oszlop eluálására az A oldószerrel 55 percen belül, 50 μl/perc áramlási sebességgel 5 percig, majd a B oldószer koncentrációját 40%-ra emeltük (Egyesült Államok). Az eluátumot folyamatosan vezettük az ESI ionforrásba, és a tripszin peptideket és a GPI-glikánokat tartalmazó peptideket LTQ Orbitrap XL-lel (hibrid lineáris ioncsapda-orbitrap tömegspektrométer; Thermo Fisher Scientific) elemeztük. Az MS beállításban a kapilláris forrás feszültségét 4,5 kV-ra állítottuk be, a transzfer kapilláris hőmérsékletét pedig 300 °C-on tartottuk. A kapilláris feszültségét és a csőlencse feszültségét 15 V-ra, illetve 50 V-ra állítottuk be. Az MS adatokat pozitív ion módban (60 000 felbontás; 10 ppm tömegpontosság) kaptuk 300/m/z tömeg/töltés arány (m/z) 3000 tömegtartományban. Az MS/MS adatokat az LTQ Orbitrap XL ioncsapdáján keresztül kapjuk [az első 3 számjegy, amelytől az adatok függenek, az ütközés által indukált disszociáció (CID)].
Az MD szimulációkat GROMACS (52) szoftverrel és MARTINI 2 erőtérrel (53-55) végeztük. A CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) segítségével ezután egy dioleoil-foszfatidilkolint (DOPC) és Cer C18-at vagy DOPC-t és Cer C26-ot tartalmazó kettősréteget hoztunk létre. A Cer C26 topológiáját és koordinátáit a DXCE-ből származtattuk a szfingozin farok extra gyöngyeinek eltávolításával. Az alábbiakban leírt eljárással kiegyensúlyoztuk a kettős réteget és futtattuk, majd a rendszer utolsó koordinátáit felhasználva Emp24-et tartalmazó rendszert hoztunk létre. Az élesztő Emp24 transzmembrán doménjét (173-193. aminosavak) α-hélixként állítottuk elő a vizuális MD (VMD) eszköz molekulaszerkezetének (58) segítségével. Ezután az átfedő lipidek eltávolítása után a fehérjét durván granuláltuk, és a CHARMM GUI segítségével beillesztettük a kettősrétegbe. A végső rendszer 1202 DOPC-t és 302 Cer C26-ot vagy 1197 DOPC-t és 295 Cer C18-at, valamint Emp24-et tartalmaz. A rendszert 0,150 M koncentrációra ionizáltuk. Két kétrétegű összetételhez négy független replikátumot készítettünk.
A lipid kettősréteget a CHARMM GUI eljárással egyensúlyozzák ki, amely 405 000 lépés minimalizálását és kiegyensúlyozását foglalja magában, ahol a pozíciókorlátokat fokozatosan csökkentik és megszüntetik, az időlépést pedig 0,005 ps-ról 0,02 ps-ra növelik. Az kiegyensúlyozás után 6 µs-ot állít elő 0,02 ps időlépéssel. Az Emp24 beillesztése után ugyanazt a CHARMM GUI eljárást alkalmazzák a rendszer minimalizálására és kiegyensúlyozására, majd 8 másodpercig futtatják éles üzemmódban.
Minden rendszer esetében a kiegyensúlyozási folyamat során a nyomást Berendsen barosztát (59), a gyártási folyamat során pedig Parrinello-Rahman barosztát (60) szabályozza. Minden esetben az átlagos nyomás 1 bar, és egy félig izotróp nyomáscsatolási sémát alkalmaznak. A kiegyensúlyozási és gyártási folyamatban egy sebesség-újrakalibrálással rendelkező termosztátot (61) használnak a fehérje-, lipid- és oldószerrészecskék hőmérsékletének összekapcsolására. A teljes művelet során a célhőmérséklet 310 K. A nem kötődő kölcsönhatást egy párosítási lista generálásával számítják ki a Verlet-séma és a 0,005 puffertoleranciájú változat segítségével. A Coulomb-tagot a reakciótér és 1,1 nm-es határérték felhasználásával számítják ki. A Vander-Waals-tag 1,1 nm-es határérték-sémát használ, a Verlet-határérték-sémát pedig a potenciális sodródás (62) esetén.
VMD segítségével a DOPC foszfátgyöngyök vagy a ceramid AM1 gyöngyök és a fehérje közötti határhullámhossz 0,7 nm, és kiszámítjuk a fehérjével kölcsönhatásba lépő lipidek számát. A következő képlet szerint számítsuk ki a kimerülési-dúsulási (DE) faktort a (63) szerint: DE faktor = (a fehérjében lévő összes lipid mennyisége 0,7) a fehérjében 0,7 (a Cer mennyisége az összes lipidben)
A közölt értéket átlagként kapjuk meg, a hibasávok pedig az SE négy független másolatát jelölik. A DE-faktor statisztikai szignifikanciáját t-próbával számítjuk ki [(átlagDE-faktor-1)/SE]. A P-értéket az egyoldalú eloszlásból számítjuk ki.
A GROMACS eszközt használtuk az Emp24-et tartalmazó rendszer 2D laterális sűrűségtérképének kiszámítására a görbe utolsó 250 ns-án belül. A ceramid dúsulási/kimerülési térképének előállításához a Cer sűrűségtérképét elosztottuk a Cer és a DOPC térképének összegével, majd elosztottuk a Cer koncentrációjával a testben. Ugyanezt a színtérkép-skálát használtuk.
A cikkhez kapcsolódó kiegészítő anyagokért kérjük, látogassa meg a http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 weboldalt.
Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, amely a Creative Commons Nevezd meg! – Ne add el! Licenc feltételei szerint kerül terjesztésre, amely lehetővé teszi a felhasználást, terjesztést és sokszorosítást bármilyen médiumban, feltéve, hogy a végső felhasználás nem kereskedelmi célú, és a feltétel az, hogy az eredeti mű helyes. Hivatkozás.
Megjegyzés: Csak azért kérjük az e-mail címed megadását, hogy az oldalra ajánlott személy tudja, hogy szeretnéd, ha látná az e-mailt, és hogy az nem spam. Nem fogunk rögzíteni semmilyen e-mail címet.
Ez a kérdés arra szolgál, hogy teszteljük, látogató-e, és megakadályozzuk az automatikus spamküldést.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez (S.Sergio Lopez), Miho Wapez (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
A 3D-s nagy felbontású valós idejű képalkotás feltárja a ceramid lánchosszának fontosságát a fehérjeválogatásban a szelektív kimeneti helyeken.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez (S.Sergio Lopez), Miho Wapez (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
A 3D-s nagy felbontású valós idejű képalkotás feltárja a ceramid lánchosszának fontosságát a fehérjeválogatásban a szelektív kimeneti helyeken.
©2020 American Association for the Advanced of Science. minden jog fenntartva. Az AAAS a HINARI, az AGORA, az OARE, a CHORUS, a CLOCKSS, a CrossRef és a COUNTER partnere. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.