Köszönjük, hogy felkereste a nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik. A legjobb élmény érdekében a legújabb böngészőverzió használatát javasoljuk (vagy az Internet Explorer kompatibilitási módjának kikapcsolását). Ezenkívül a folyamatos támogatás biztosítása érdekében ez az oldal nem tartalmaz stílusokat vagy JavaScriptet.
A hidrogén-szulfid (H2S) számos fiziológiai és kóros hatással van az emberi szervezetre. A nátrium-hidroszulfidot (NaHS) széles körben használják farmakológiai eszközként a H2S biológiai kísérletekben betöltött szerepének vizsgálatára. Bár a H2S elvesztése a NaHS-oldatokból csak néhány percet vesz igénybe, egyes állatkísérletekben a NaHS-oldatokat donorvegyületként használták az ivóvízben lévő H2S számára. Ez a tanulmány azt vizsgálta, hogy a patkány/egér palackokban elkészített 30 μM NaHS-koncentrációjú ivóvíz stabil maradhat-e legalább 12–24 órán át, ahogy azt egyes szerzők javasolják. Készítsünk ivóvízben NaHS-oldatot (30 μM), és azonnal öntsük patkány/egér vizes palackokba. A vizes palack hegyéről és belsejéből mintákat gyűjtöttünk 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 és 24 óra elteltével a szulfidtartalom metilénkék módszerrel történő mérésére. Ezenkívül hím és nőstény patkányoknak két héten keresztül NaHS-t (30 μM) injektáltak, és a szérum szulfidkoncentrációját az első héten, valamint a második hét végén minden második nap mérték. A vizes palack hegyéből vett mintában a NaHS-oldat instabil volt; 12, illetve 24 óra elteltével 72%-kal, illetve 75%-kal csökkent. A vizes palackok belsejéből vett mintákban a NaHS csökkenése 2 órán belül nem volt szignifikáns; azonban 12, illetve 24 óra elteltével 47%-kal, illetve 72%-kal csökkent. A NaHS injekció nem befolyásolta a hím és nőstény patkányok szérum szulfidszintjét. Összefoglalva, az ivóvízből készített NaHS-oldatokat nem szabad H2S-donációra használni, mivel az oldat instabil. Ez az adagolási mód az állatokat szabálytalan és a vártnál kisebb mennyiségű NaHS-nek teszi ki.
A hidrogén-szulfidot (H2S) 1700 óta használják toxinként; azonban endogén biojelző molekulaként betöltött lehetséges szerepét Abe és Kimura 1996-ban leírták. Az elmúlt három évtizedben a H2S számos funkcióját tisztázták különböző emberi rendszerekben, ami elvezetett ahhoz a felismeréshez, hogy a H2S donor molekulák klinikai alkalmazásokkal rendelkezhetnek bizonyos betegségek kezelésében vagy menedzselésében; lásd Chirino és munkatársai friss áttekintését.
A nátrium-hidroszulfidot (NaHS) széles körben alkalmazzák farmakológiai eszközként a H2S hatásainak vizsgálatára számos sejtkultúra- és állatkísérletben5,6,7,8. A NaHS azonban nem ideális H2S donor, mivel oldatban gyorsan H2S/HS--vé alakul, könnyen szennyeződik poliszulfidokkal, és könnyen oxidálódik és illékonyodik4,9. Számos biológiai kísérletben a NaHS vízben oldódik, ami passzív illékonyodáshoz és H2S10,11,12 elvesztéséhez, a H2S11 spontán oxidációjához11,12,13 és fotolízishez14 vezet. Az eredeti oldatban a szulfid nagyon gyorsan elpárolog a H2S11 illékonyodása miatt. Nyitott tartályban a H2S felezési ideje (t1/2) körülbelül 5 perc, és koncentrációja percenként körülbelül 13%-kal csökken10. Bár a kénhidrogén elvesztése a NaHS-oldatokból csak néhány percet vesz igénybe, egyes állatkísérletekben 1-21 héten keresztül használtak NaHS-oldatokat kénhidrogén-forrásként az ivóvízben, a NaHS-tartalmú oldatot 12-24 óránként cserélve.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Ez a gyakorlat nem egyeztethető össze a tudományos kutatás elveivel, mivel a gyógyszeradagolásnak más fajoknál, különösen az embereknél történő alkalmazásukon kell alapulnia.27
A biomedicinában végzett preklinikai kutatások célja a betegellátás minőségének vagy a kezelési eredmények javítása. Az állatkísérletek eredményeit azonban a legtöbb esetben még nem ültették át emberekre28,29,30. Ennek az átültetési kudarcnak az egyik oka az állatkísérletek módszertani minőségére fordított figyelem hiánya30. Ezért a tanulmány célja annak vizsgálata volt, hogy a patkány/egér vizes palackokban elkészített 30 μM NaHS-oldatok stabilak maradhatnak-e az ivóvízben 12–24 órán át, ahogyan azt egyes tanulmányok állítják vagy javasolják.
A vizsgálatban szereplő összes kísérletet az Iránban a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozóan közzétett irányelveknek megfelelően végezték31. A vizsgálatban szereplő összes kísérleti jelentés az ARRIVE irányelveit32 is követte. A Shahid Beheshti Orvostudományi Egyetem Endokrin Tudományok Intézetének Etikai Bizottsága jóváhagyta a vizsgálatban szereplő összes kísérleti eljárást.
A cink-acetát-dihidrátot (CAS: 5970-45-6) és a vízmentes vas(III)-kloridot (CAS: 7705-08-0) a Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Franciaország) cégtől szereztük be. A nátrium-hidroszulfid-hidrátot (CAS: 207683-19-0) és az N,N-dimetil-p-feniléndiamint (DMPD) (CAS: 535-47-0) a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) cégtől szereztük be. Az izofluránt a Piramal (Bethlehem, PA, USA) cégtől szereztük be. A sósavat (HCl) a Merck (Darmstadt, Németország) cégtől szereztük be.
Készítsen NaHS-oldatot (30 μM) ivóvízben, és azonnal öntse a patkány/egér vizespalackokba. Ezt a koncentrációt számos, a NaHS-t H2S-forrásként használó publikáció alapján választottuk ki; lásd a Megbeszélés részt. A NaHS egy hidratált molekula, amely változó mennyiségű hidratációs vizet (azaz NaHS•xH2O) tartalmazhat; a gyártó szerint a vizsgálatunkban felhasznált NaHS százalékos aránya 70,7% volt (azaz NaHS•1,3 H2O), és ezt az értéket vettük figyelembe a számításainkban, ahol 56,06 g/mol molekulatömeget használtunk, ami a vízmentes NaHS molekulatömege. A hidratációs víz (más néven kristályvíz) a kristályos szerkezetet alkotó vízmolekulák33. A hidrátok eltérő fizikai és termodinamikai tulajdonságokkal rendelkeznek az anhidrátokhoz képest34.
Mielőtt NaHS-t adnánk az ivóvízhez, mérjük meg az oldószer pH-értékét és hőmérsékletét. Azonnal öntsük a NaHS-oldatot az állatketrecben lévő patkány/egér vizespalackba. A szulfidtartalom mérése érdekében mintákat gyűjtöttünk a vizespalack hegyéből és belsejéből 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 és 24 óra elteltével. A szulfidszint mérését minden mintavétel után azonnal elvégeztük. A cső hegyéből vettünk mintákat, mivel egyes tanulmányok kimutatták, hogy a vízcső kis pórusmérete minimalizálhatja a H2S párolgását15,19. Úgy tűnik, hogy ez a probléma a palackban lévő oldatra is vonatkozik. Ez azonban nem volt így a vizespalack nyakában lévő oldat esetében, amelynek nagyobb volt a párolgási sebessége és autooxidáló volt; valójában az állatok először ezt a vizet itták meg.
A vizsgálatban hím és nőstény Wistar patkányokat használtak. A patkányokat polipropilén ketrecekben tartottuk (ketrecenként 2-3 patkány) standard körülmények között (hőmérséklet 21–26 °C, páratartalom 32–40%), 12 óra fény (reggel 7-től este 7-ig) és 12 óra sötétség (este 7-től reggel 7-ig). A patkányok szabadon hozzáférhettek csapvízhez, és standard eledelt (Khorak Dam Pars Company, Teherán, Irán) kaptak. Kor szerint illesztett (6 hónapos) nőstény (n=10, testtömeg: 190–230 g) és hím (n=10, testtömeg: 320–370 g) Wistar patkányokat véletlenszerűen osztottunk kontroll és NaHS-sel (30 μM) kezelt csoportokba (n=5 csoportonként). A minta méretének meghatározásához a KISS (Keep It Simple, Stupid) megközelítést alkalmaztuk, amely a korábbi tapasztalatokat és a hatalmi elemzést ötvözi35. Először egy pilot vizsgálatot végeztünk 3 patkánnyal, és meghatároztuk az átlagos szérum teljes szulfidszintjét és szórását (8,1 ± 0,81 μM). Ezután, 80%-os teljesítményt figyelembe véve és kétoldalas 5%-os szignifikanciaszintet feltételezve, meghatároztunk egy előzetes mintaelemszámot (n = 5 a korábbi szakirodalom alapján), amely 2,02-es standardizált hatásméretnek felelt meg, a Festing által a kísérleti állatok mintaméretének kiszámításához javasolt előre meghatározott értékkel35. Miután ezt az értéket megszoroztuk a szórással (2,02 × 0,81), a várható kimutatható hatásméret (1,6 μM) 20% volt, ami elfogadható. Ez azt jelenti, hogy n = 5/csoport elegendő a csoportok közötti 20%-os átlagos változás kimutatásához. A patkányokat véletlenszerűen osztottuk kontroll és NaSH-val kezelt csoportokba az Excel szoftver véletlenszerű függvényével36 (1. kiegészítő ábra). A vakítást az eredmény szintjén végeztük, és a biokémiai méréseket végző kutatók nem voltak tisztában a csoportbeosztással.
Mindkét nembeli NaHS csoportot 2 héten keresztül ivóvízben elkészített 30 μM NaHS oldattal kezelték; Friss oldatot biztosítottak 24 óránként, ezalatt a testtömeget mérték. Az első és második hét végén minden második nap izoflurán altatásban lévő patkányok farokvégéről vért vettek. A vérmintákat 3000 g-vel 10 percig centrifugálták, a szérumot elválasztották és –80°C-on tárolták a szérum karbamid, kreatinin (Cr) és teljes szulfid későbbi mérése céljából. A szérum karbamidot enzimatikus ureáz módszerrel, a szérum kreatinint pedig fotometriás Jaffe módszerrel határozták meg kereskedelmi forgalomban kapható készletek (Man Company, Teherán, Irán) és egy automata analizátor (Selectra E, sorozatszám 0-2124, Hollandia) felhasználásával. A karbamid és a Cr intra- és interassay variációs koefficiensei kevesebb mint 2,5% voltak.
A metilénkék (MB) módszert az ivóvíz és a NaHS-t tartalmazó szérum összes szulfidtartalmának mérésére használják; az MB a leggyakrabban használt módszer a szulfid mennyiségének mérésére tömboldatokban és biológiai mintákban11,37. Az MB módszerrel megbecsülhető a teljes szulfidkészlet38, és mérhetők a szervetlen szulfidok H2S, HS⁻ és S₂ formájában a vizes fázisban39. Ebben a módszerben a ként cink-szulfid (ZnS) formájában csapják ki cink-acetát jelenlétében11,38. A cink-acetátos kicsapás a legszélesebb körben használt módszer a szulfidok más kromoforoktól való elválasztására11. A ZnS-t HCl11-gyel oldották újra erősen savas körülmények között. A szulfid 1:2 sztöchiometrikus arányban reagál a DMPD-vel egy vas(III)-klorid által katalizált reakcióban (Fe3+ oxidálószerként működik), így MB festék keletkezik, amelyet spektrofotometriásan 670 nm-en40,41 detektálnak. Az MB módszer kimutatási határa körülbelül 1 μM11.
Ebben a vizsgálatban minden mintából (oldat vagy szérum) 100 μL-t mértünk egy kémcsőbe; majd 200 μL cink-acetátot (1% t/t desztillált vízben), 100 μL DMPD-t (20 mM 7,2 M HCl-ben) és 133 μL FeCl3-at (30 mM 1,2 M HCl-ben) adtunk hozzá. Az elegyet 37°C-on, sötétben inkubáltuk 30 percig. Az oldatot 10 000 g-vel centrifugáltuk 10 percig, és a felülúszó abszorbanciáját 670 nm-en olvastuk le mikrotiterlemez-leolvasóval (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). A szulfidkoncentrációkat NaHS (0–100 μM) ddH2O-ban lévő kalibrációs görbéjével határoztuk meg (2. kiegészítő ábra). A mérésekhez használt összes oldatot frissen készítettük el. A szulfidmérés intra- és interassay variációs koefficiensei 2,8%, illetve 3,4% voltak. A nátrium-tioszulfátot tartalmazó ivóvízből és szérummintákból visszanyert teljes szulfid mennyiségét a dúsított minta módszerrel42 is meghatároztuk. A nátrium-tioszulfátot tartalmazó ivóvíz és szérumminták visszanyerési aránya 91 ± 1,1% (n = 6), illetve 93 ± 2,4% (n = 6) volt.
A statisztikai elemzést a GraphPad Prism 8.0.2-es verziójú Windows szoftverrel (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com) végeztük. Párosított t-próbát alkalmaztunk az ivóvíz hőmérsékletének és pH-értékének összehasonlítására a NaHS hozzáadása előtt és után. A NaHS-t tartalmazó oldatban a H2S veszteségét a kiindulási felvételhez képesti százalékos csökkenésként számítottuk ki, és annak felmérésére, hogy a veszteség statisztikailag szignifikáns-e, egyutas ismételt méréses ANOVA-t, majd Dunnett-féle többszörös összehasonlító tesztet végeztünk. A testtömeg, a szérum karbamid, a szérum kreatinin és a teljes szérum szulfid időbeli változását a kontroll és a NaHS-sel kezelt, különböző nemű patkányok között kétutas vegyes (között-belül) ANOVA-val, majd Bonferroni post hoc teszttel hasonlítottuk össze. A 0,05-nél kisebb kétoldali P-értékeket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.
Az ivóvíz pH-értéke a NaHS hozzáadása előtt 7,60 ± 0,01, a NaHS hozzáadása után pedig 7,71 ± 0,03 volt (n = 13, p = 0,0029). Az ivóvíz hőmérséklete 26,5 ± 0,2 volt, majd a NaHS hozzáadása után 26,2 ± 0,2-re csökkent (n = 13, p = 0,0128). Készítsen 30 μM NaHS-oldatot ivóvízhez, és tárolja vizespalackban. A NaHS-oldat instabil, és koncentrációja idővel csökken. A vizespalack nyakából vett minta esetében az első órán belül jelentős csökkenést (68,0%) figyeltek meg, az oldat NaHS-tartalma pedig 12, illetve 24 óra elteltével 72%-kal, illetve 75%-kal csökkent. A vizespalackokból vett mintákban a NaHS-tartalom csökkenése 2 óráig nem volt szignifikáns, de 12, illetve 24 óra elteltével 47%-kal, illetve 72%-kal csökkent. Ezek az adatok azt mutatják, hogy az ivóvízben elkészített 30 μM-os oldatban a NaHS százalékos aránya 24 óra elteltével a kezdeti érték körülbelül negyedére csökkent, függetlenül a mintavételi helytől (1. ábra).
NaHS-oldat (30 μM) stabilitása ivóvízben patkány/egér palackokban. Az oldat elkészítése után mintákat vettünk a vizespalack hegyéből és belsejéből. Az adatokat átlag ± SD formátumban adjuk meg (n = 6/csoport). * és #, P < 0,05 a 0. időhöz képest. A vizespalack fényképe a hegyet (nyílással) és a palack testét mutatja. A hegy térfogata körülbelül 740 μL.
A frissen elkészített 30 μM-os oldatban a NaHS koncentrációja 30,3 ± 0,4 μM volt (tartomány: 28,7–31,9 μM, n = 12). 24 óra elteltével azonban a NaHS koncentrációja alacsonyabb értékre csökkent (átlag: 3,0 ± 0,6 μM). Amint a 2. ábra mutatja, a patkányok által kezelt NaHS koncentrációja nem volt állandó a vizsgálati időszak alatt.
A nőstény patkányok testtömege idővel jelentősen nőtt (205,2 ± 5,2 g-ról 213,8 ​​± 7,0 g-ra a kontrollcsoportban és 204,0 ± 8,6 g-ról 211,8 ± 7,5 g-ra a NaHS-sel kezelt csoportban); azonban a NaHS-kezelésnek nem volt hatása a testtömegre (3. ábra). A hím patkányok testtömege idővel jelentősen nőtt (338,6 ± 8,3 g-ról 352,4 ± 6,0 g-ra a kontrollcsoportban és 352,4 ± 5,9 g-ról 363,2 ± 4,3 g-ra a NaHS-sel kezelt csoportban); azonban a NaHS-kezelésnek nem volt hatása a testtömegre (3. ábra).
A nőstény és hím patkányok testtömegének változása NaHS (30 μM) beadása után. Az adatokat átlag ± SEM formátumban adjuk meg, és kétutas vegyes (between) varianciaanalízissel hasonlítottuk össze Bonferroni post hoc teszttel. n = 5 nemből mindkét csoportban.
A szérum karbamid- és kreatin-foszfát-koncentrációi a kontroll és a NaSH-val kezelt patkányokban a vizsgálat során összehasonlíthatók voltak. Továbbá a NaSH-kezelés nem befolyásolta a szérum karbamid- és kreatin-foszfát-koncentrációit (1. táblázat).
A szérum teljes szulfidszintjének alapértékei összehasonlíthatók voltak a kontroll és a NaHS-sel kezelt hím (8,1 ± 0,5 μM vs. 9,3 ± 0,2 μM) és nőstény (9,1 ± 1,0 μM vs. 6,1 ± 1,1 μM) patkányok között. A 14 napon át tartó NaHS-adagolás nem befolyásolta a szérum teljes szulfidszintjét sem a hím, sem a nőstény patkányokban (4. ábra).
A szérum teljes szulfidkoncentrációjának változása hím és nőstény patkányokban NaHS (30 μM) beadása után. Az adatokat átlag ± SEM formátumban adjuk meg, és kétutas vegyes (within-within) varianciaanalízissel hasonlítottuk össze Bonferroni post hoc teszttel. Nemenként, n = 5/csoport.
A tanulmány fő következtetése, hogy a NaHS-t tartalmazó ivóvíz instabil: a kezdeti teljes szulfidtartalomnak csak körülbelül egynegyede mutatható ki 24 órával a patkány/egér vizespalackok hegyéből és belsejéből vett minta után. Továbbá, a patkányokat instabil NaHS-koncentrációknak tették ki a NaHS-oldatban lévő H2S elvesztése miatt, és a NaHS ivóvízhez való hozzáadása nem befolyásolta a testsúlyt, a szérum karbamid- és kreatin-krómszintjét, illetve a teljes szérum szulfidszintet.
Ebben a tanulmányban a 30 μM-os, ivóvízben elkészített NaHS-oldatok H2S-veszteségének mértéke körülbelül 3% volt óránként. Egy pufferolt oldatban (100 μM nátrium-szulfid 10 mM PBS-ben, pH 7,4) a szulfidkoncentrációról azt jelentették, hogy 8 óra alatt 7%-kal csökken az idő múlásával11. Korábban azzal védtük meg a NaHS intraperitoneális beadását, hogy az 54 μM-os ivóvízben lévő NaHS-oldat szulfidveszteségének mértéke körülbelül 2,3% óránként (4%/óra az első 12 órában és 1,4%/óra az elkészítést követő utolsó 12 órában)8. Korábbi tanulmányok43 állandó H2S-veszteséget találtak a NaHS-oldatokból, elsősorban az illékonyság és az oxidáció miatt. Még buborékok hozzáadása nélkül is gyorsan elpárolog a törzsoldatban lévő szulfid a H2S illékonysága miatt11. Tanulmányok kimutatták, hogy a hígítási folyamat során, amely körülbelül 30–60 másodpercet vesz igénybe, a H2S körülbelül 5–10%-a vész el párolgás miatt6. A H2S oldatból való elpárolgásának megakadályozása érdekében a kutatók számos intézkedést tettek, beleértve az oldat gyengéd keverését,12 a törzsoldat műanyag fóliával való lefedését6 és az oldat levegővel való érintkezésének minimalizálását, mivel a H2S párolgási sebessége a levegő-folyadék határfelülettől függ.13 A H2S spontán oxidációja főként az átmenetifém-ionok, különösen a vas(III)-ionok miatt következik be, amelyek a vízben szennyeződések.13 A H2S oxidációja poliszulfidok (kovalens kötésekkel összekapcsolt kénatomok) képződéséhez vezet11. Az oxidáció elkerülése érdekében a H2S-t tartalmazó oldatokat oxigénmentesített oldószerekben44,45 készítik el, majd 20-30 percig argonnal vagy nitrogénnel öblítik át az oxigénmentesítés biztosítása érdekében.11,12,37,44,45,46 A dietilén-triamin-pentaecetsav (DTPA) egy fémkelátképző (10–4 M), amely megakadályozza a HS autooxidációját aerob oldatokban. DTPA hiányában a HS⁻ autooxidációs sebessége körülbelül 50%, körülbelül 3 óra alatt 25°C-on37,47. Továbbá, mivel az 1e-szulfid oxidációját ultraibolya fény katalizálja, az oldatot jégen, fénytől védve kell tárolni11.
Amint az az 5. ábrán látható, a NaHS vízben oldva Na+ és HS-6 ionokra disszociál; ezt a disszociációt a reakció pK1 értéke határozza meg, amely hőmérsékletfüggő: pK1 = 3,122 + 1132/T, ahol T 5 és 30 °C között van, és Kelvin fokban (K) mérik, K = °C + 273,1548. A HS- magas pK2 értékkel rendelkezik (pK2 = 19), így 96,49 alatti pH-értéken S2- nem képződik, vagy nagyon kis mennyiségben képződik. Ezzel szemben a HS- bázisként viselkedik, és H+ ionokat vesz fel egy H2O molekulából, a H2O pedig savként viselkedik, és H2S és OH- ionokká alakul.
Oldott H2S gáz képződése NaHS oldatban (30 µM). aq, vizes oldat; g, gáz; l, folyadék. Minden számítás 7,0 pH-értékű víz és 20 °C hőmérsékletű víz esetén készült. A BioRender.com segítségével készült.
Annak ellenére, hogy bizonyítékok vannak arra, hogy a NaHS-oldatok instabilak, számos állatkísérletben alkalmaztak ivóvízben oldott NaHS-oldatokat H2S donor vegyületként15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, a beavatkozás időtartama 1 és 21 hét között változott (2. táblázat). Ezen vizsgálatok során a NaHS-oldatot 12 óránként, 15, 17, 18, 24, 25 óránként vagy 24 óránként, 19, 20, 21, 22, 23 óránként cserélték. Eredményeink azt mutatták, hogy a patkányok instabil gyógyszerkoncentrációknak voltak kitéve a NaHS-oldatból történő H2S-veszteség miatt, és a patkányok ivóvizében a NaHS-tartalom jelentősen ingadozott 12 vagy 24 óra alatt (lásd a 2. ábrát). E tanulmányok közül kettő arról számolt be, hogy a víz H2S-szintje 24 órán át stabil maradt22, vagy hogy 12 óra alatt csak 2-3%-os H2S-veszteséget figyeltek meg15, de nem szolgáltattak alátámasztó adatokat vagy mérési részleteket. Két tanulmány kimutatta, hogy a vizespalackok kis átmérője minimalizálhatja a H2S párolgását15,19. Eredményeink azonban azt mutatták, hogy ez a vizespalack H2S-veszteségét csak 2 órával késleltetheti a 12-24 óra helyett. Mindkét tanulmány megjegyzi, hogy feltételezzük, hogy az ivóvíz NaHS-szintje nem változott, mivel nem figyeltünk meg színváltozást a vízben; ezért a H2S levegő általi oxidációja nem volt szignifikáns19,20. Meglepő módon ez a szubjektív módszer a NaHS stabilitását méri a vízben, ahelyett, hogy a koncentrációjának időbeli változását mérné.
A H2S vesztesége a NaHS oldatban összefügg a pH-értékkel és a hőmérséklettel. Amint azt tanulmányunkban megjegyeztük, a NaHS vízben való oldása lúgos oldat képződéséhez vezet50. Amikor a NaHS-t vízben oldjuk, az oldott H2S gáz képződése a pH-értéktől függ6. Minél alacsonyabb az oldat pH-ja, annál nagyobb a NaHS aránya H2S gázmolekulák formájában, és annál több szulfid veszít a vizes oldatból11. Ezen tanulmányok egyike sem közölte a NaHS oldószereként használt ivóvíz pH-értékét. A WHO ajánlásai szerint, amelyeket a legtöbb ország alkalmaz, az ivóvíz pH-értékének 6,5–8,551 között kell lennie. Ebben a pH-tartományban a H2S spontán oxidációjának sebessége körülbelül tízszeresére nő13. A NaHS vízben való oldása ebben a pH-tartományban 1–22,5 μM oldott H2S gáz koncentrációt eredményez, ami hangsúlyozza a víz pH-értékének monitorozásának fontosságát a NaHS feloldása előtt. Ezenkívül a fenti tanulmányban közölt hőmérsékleti tartomány (18–26 °C) az oldatban oldott H2S gáz koncentrációjának körülbelül 10%-os változását eredményezné, mivel a hőmérsékletváltozások megváltoztatják a pK1 értéket, és a pK1 kis változásai is jelentős hatással lehetnek az oldott H2S gáz koncentrációjára48. Ezenkívül egyes vizsgálatok hosszú időtartama (5 hónap)22, amely alatt nagy hőmérséklet-ingadozás várható, szintén súlyosbítja ezt a problémát.
Egy kivételével21 minden tanulmány 30 μM NaHS-oldatot használt ivóvízben. Az alkalmazott dózis (azaz 30 μM) magyarázatára egyes szerzők rámutattak, hogy a vizes fázisban lévő NaHS pontosan ugyanolyan koncentrációjú H2S gázt termel, és hogy a H2S fiziológiai tartománya 10-100 μM, tehát ez a dózis a fiziológiai tartományon belül van15,16. Mások azzal magyarázták, hogy a 30 μM NaHS képes a plazma H2S-szintjét a fiziológiai tartományon belül, azaz 5–300 μM között tartani19,20. A vízben lévő NaHS koncentrációját 30 μM-nak (pH = 7,0, T = 20 °C) tekintjük, amelyet egyes vizsgálatokban a H2S hatásainak vizsgálatára használtak. Kiszámíthatjuk, hogy az oldott H2S gáz koncentrációja 14,7 μM, ami a kezdeti NaHS-koncentráció körülbelül 50%-a. Ez az érték hasonló más szerzők által azonos körülmények között kiszámított értékhez13,48.
Tanulmányunkban a NaHS adagolása nem változtatta meg a testsúlyt; ez az eredmény összhangban van más, hím egereken22,23 és hím patkányokon18 végzett vizsgálatok eredményeivel; Két tanulmány azonban arról számolt be, hogy a NaSH helyreállította a csökkent testsúlyt nefrektomizált patkányokban24,26, míg más vizsgálatok nem számoltak be a NaSH adagolásának a testsúlyra gyakorolt ​​hatásáról15,16,17,19,20,21,25. Továbbá, tanulmányunkban a NaSH adagolása nem befolyásolta a szérum karbamid- és kreatin-krómszintjét, ami összhangban van egy másik jelentés eredményeivel25.
A tanulmány megállapította, hogy a NaHS 2 hétig tartó ivóvízhez adagolása nem befolyásolta a teljes szérumszulfid-koncentrációt hím és nőstény patkányokban. Ez a megállapítás összhangban van Sen és munkatársai (16) eredményeivel: a 8 hetes, 30 μM NaHS-sel ivóvízben végzett kezelés nem befolyásolta a plazmaszulfid-szintet a kontrollpatkányokban; azonban arról számoltak be, hogy ez a beavatkozás helyreállította a nefrektomizált egerek plazmájának csökkent H2S-szintjét. Li és munkatársai (22) arról is beszámoltak, hogy a 30 μM NaHS-sel ivóvízben 5 hónapig végzett kezelés körülbelül 26%-kal növelte a plazma szabad szulfidszintjét idős egerekben. Más tanulmányok nem számoltak be a keringő szulfid változásáról a NaHS ivóvízhez való hozzáadása után.
Hét tanulmány számolt be Sigma NaHS használatával15,16,19,20,21,22,23, de nem közöltek további részleteket a hidratációs vízről, öt tanulmány pedig nem említette az előállítási módszereikben használt NaHS forrását17,18,24,25,26. A NaHS egy hidratált molekula, és hidratációs víztartalma változhat, ami befolyásolja az adott molaritású oldat elkészítéséhez szükséges NaHS mennyiségét. Például a mi tanulmányunkban a NaHS-tartalom NaHS•1,3 H2O volt. Így a tényleges NaHS-koncentrációk ezekben a vizsgálatokban alacsonyabbak lehetnek a közölt értékeknél.
„Hogyan lehet egy ilyen rövid életű vegyületnek ilyen tartós hatása?” – tették fel ezt a kérdést Pozgay és munkatársai21, amikor a NaHS egerek vastagbélgyulladásra gyakorolt ​​hatását értékelték. Remélik, hogy a jövőbeli tanulmányok képesek lesznek megválaszolni ezt a kérdést, és feltételezni, hogy a NaHS-oldatok a NaHS hatását közvetítő H2S és diszulfidok mellett stabilabb poliszulfidokat is tartalmazhatnak21. Egy másik lehetőség az, hogy az oldatban maradó nagyon alacsony NaHS-koncentrációk is jótékony hatással lehetnek. Valójában Olson és munkatársai bizonyítékot szolgáltattak arra, hogy a H2S mikromoláris szintje a vérben nem fiziológiás, és a nanomoláris tartományban kell lennie, vagy teljesen hiányoznia kell13. A H2S a fehérjeszulfatáción keresztül hathat, amely egy reverzibilis poszttranszlációs módosulás, amely számos fehérje működését, stabilitását és lokalizációját befolyásolja52,53,54. Valójában fiziológiás körülmények között számos májfehérje körülbelül 10-25%-a szulfilezett53. Mindkét tanulmány elismeri a NaHS gyors lebomlását,19,23 de meglepő módon azt állítják, hogy „a NaHS koncentrációját az ivóvízben úgy szabályoztuk, hogy naponta cseréltük.”23 Az egyik tanulmány véletlenül azt állította, hogy „a NaHS egy standard H2S donor, és a klinikai gyakorlatban gyakran használják a H2S helyettesítésére.”18
A fentiek azt mutatják, hogy a NaHS az oldatból illékonyodás, oxidáció és fotolízis útján távozik, ezért javaslatokat teszünk a H2S oldatból való veszteségének csökkentésére. Először is, a H2S párolgása a gáz-folyadék határfelülettől13 és az oldat pH-jától11 függ; ezért a párolgási veszteség minimalizálása érdekében a vizespalack nyakát a korábban leírtak szerint a lehető legkisebbre lehet készíteni15,19, és a víz pH-ját egy elfogadható felső határra (azaz 6,5–8,551) lehet beállítani a párolgási veszteség minimalizálása érdekében11. Másodszor, a H2S spontán oxidációja az oxigén hatása és az ivóvízben lévő átmenetifém-ionok jelenléte miatt következik be13, így az ivóvíz argonnal vagy nitrogénnel történő oxigénmentesítése44,45 és fémkelátképzők37,47 használata csökkentheti a szulfidok oxidációját. Harmadszor, a H2S fotobomlásának megakadályozása érdekében a vizespalackokat alumíniumfóliába lehet csomagolni; Ez a gyakorlat a fényérzékeny anyagokra, például a streptozotocinra is vonatkozik55. Végül, a szervetlen szulfidsók (NaHS, Na2S és CaS) beadhatók szondán keresztül, ahelyett, hogy ivóvízben oldanák őket, ahogy azt korábban beszámolták56,57,58; tanulmányok kimutatták, hogy a patkányoknak szondán keresztül beadott radioaktív nátrium-szulfid jól felszívódik és gyakorlatilag minden szövetbe eloszlik59. A mai napig a legtöbb vizsgálat szervetlen szulfidsókat adott be intraperitoneálisan; azonban ezt az utat ritkán alkalmazzák klinikai környezetben60. Másrészt az orális út a leggyakoribb és legelőnyösebb beadási mód embereknél61. Ezért javasoljuk a H2S donorok rágcsálókban orális szondán keresztüli hatásának értékelését.
Korlátozás, hogy a szulfidot vizes oldatban és szérumban az MB módszerrel mértük. A szulfid mérésére szolgáló módszerek közé tartozik a jódtitrálás, a spektrofotometria, az elektrokémiai módszer (potenciometria, amperometria, coulometriás módszer és amperometriás módszer) és a kromatográfia (gázkromatográfia és nagy teljesítményű folyadékkromatográfia), amelyek közül a leggyakrabban használt módszer az MB spektrofotometriás módszer62. Az MB módszer korlátja a H2S biológiai mintákban történő mérésére, hogy minden kéntartalmú vegyületet mér, és nem a szabad H2S-t63, mivel savas körülmények között végzik, ami a kén kivonását eredményezi a biológiai forrásból64. Az Amerikai Közegészségügyi Szövetség szerint azonban az MB a standard módszer a szulfid vízben történő mérésére65. Ezért ez a korlátozás nem befolyásolja a NaHS-t tartalmazó oldatok instabilitására vonatkozó főbb eredményeinket. Továbbá, tanulmányunkban a szulfidmérés kinyerése NaHS-t tartalmazó víz- és szérummintákban 91%, illetve 93% volt. Ezek az értékek összhangban vannak a korábban közölt tartományokkal (77–92)66, ami elfogadható analitikai pontosságot jelez42. Érdemes megjegyezni, hogy a Nemzeti Egészségügyi Intézetek (NIH) irányelveivel összhangban hím és nőstény patkányokat is használtunk, hogy elkerüljük a kizárólag hím állatokon végzett preklinikai vizsgálatokra való túlzott támaszkodást67, és hogy ahol csak lehetséges, hím és nőstény patkányokat is bevonjunk68. Ezt a szempontot mások is hangsúlyozták69,70,71.
Összefoglalva, a tanulmány eredményei azt mutatják, hogy az ivóvízből készített NaHS-oldatok instabilitásuk miatt nem használhatók H2S előállítására. Ez az alkalmazási mód instabil és a vártnál alacsonyabb NaHS-szintnek tenné ki az állatokat; ezért a megállapítások esetleg nem alkalmazhatók emberekre.
A jelenlegi tanulmány során felhasznált és/vagy elemzett adatkészletek ésszerű kérésre a levelező szerzőtől elérhetők.
Szabó, K. A hidrogén-szulfid (H2S) kutatásának idővonala: a környezeti toxintól a biológiai mediátorig. Biokémia és Farmakológia 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. és Kimura, H. A hidrogén-szulfid lehetséges szerepe endogén neuromodulátorként. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. és Papapetropoulos, A. A hidrogén-szulfid élettani szerepe emlős sejtekben, szövetekben és szervekben. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB, és Kashfi, K. A nitrogén-monoxid és a hidrogén-szulfid sejtes célba juttató rendszereinek ígéretes fejlődése: a személyre szabott orvoslás új korszaka. Biokémia és Farmakológia 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X. és munkatársai. A lassan felszabaduló hidrogén-szulfid donor hosszú távú alkalmazása megelőzheti a miokardiális ischaemiát/reperfúziós sérülést. Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM és Hermann, A. A BK-csatorna foszforilációja szabályozza a hidrogén-szulfid (H2S) érzékenységet. Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM és Hermann, A. A hidrogén-szulfid fokozza a kalcium-aktivált kálium (BK) csatorna aktivitását patkány agyalapi mirigy tumorsejtekben. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S. és munkatársai. A hidrogén-szulfid fokozza a nitrit védőhatását a miokardiális ischaemia-reperfúziós sérüléssel szemben 2-es típusú diabéteszes patkányokban. Nitrogén-oxid 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A. és munkatársai. A H2S donor kémia trendjei és hatása a szív- és érrendszeri betegségekre. Antioxidánsok 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF és Olson, KR (2012). A hidrogén-szulfid passzív veszteségei biológiai kísérletekben. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P. és munkatársai. A hidrogén-szulfid mérésének kémiai vonatkozásai fiziológiás mintákban. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Természetes vizek kénhidrogén-tartalmának spektrofotometriás meghatározása. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Gyakorlati képzés a hidrogén-szulfid kémiájából és biológiájából. „Antioxidánsok.” Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).