Korábban beszámoltunk arról, hogy a bélből származó triptofán metabolit, az indol-3-propionsav (IPA) szérumszintje alacsonyabb májfibrózisban szenvedő betegeknél. Ebben a tanulmányban az elhízott májak transzkriptómáját és DNS-metilómját vizsgáltuk a szérum IPA-szintjéhez viszonyítva, valamint az IPA szerepét a máj stellate sejtjeinek (HSC-k) fenotípusos inaktivációjának kiváltásában in vitro.
A vizsgálatban 116, 2-es típusú cukorbetegségben (T2DM) nem szenvedő elhízott beteg vett részt (életkor: 46,8 ± 9,3 év; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²), akik bariátriai műtéten estek át a Kuopio Bariátriai Sebészeti Központban (KOBS). A keringő IPA-szinteket folyadékkromatográfia-tömegspektrometriával (LC-MS) mérték, a máj transzkriptom analízisét teljes RNS-szekvenálással, a DNS-metilációs analízist pedig Infinium HumanMethylation450 BeadChip segítségével végezték. Az in vitro kísérletekhez humán máj stellate sejteket (LX-2) használtak.
A szérum IPA-szintek korreláltak a máj apoptotikus, mitofágikus és hosszú élet útvonalakban részt vevő gének expressziójával. Az AKT szerin/treonin kináz 1 (AKT1) gén volt a leggyakoribb és domináns kölcsönható gén a máj transzkriptumában és a DNS metilációs profiljaiban. Az IPA-kezelés apoptózist indukált, csökkent mitokondriális légzést, és megváltoztatta a sejtek morfológiáját és mitokondriális dinamikáját azáltal, hogy modulálta az LX-2 sejtek fibrózisát, apoptózisát és túlélését szabályozó gének expresszióját.
Összefoglalva, ezek az adatok alátámasztják, hogy az IPA potenciális terápiás hatásokkal rendelkezik, és apoptózist indukálhat, valamint a HSC fenotípust inaktív állapotba tolhatja, ezáltal bővítve a májfibrózis gátlásának lehetőségét a HSC aktivációjának és a mitokondriális anyagcserének zavarásával.
Az elhízás és a metabolikus szindróma prevalenciája összefüggésbe hozható a metabolikusan összefüggő zsírmájbetegség (MASLD) növekvő előfordulásával; a betegség az általános népesség 25-30%-át érinti [1]. A MASLD etiológiájának fő következménye a májfibrózis, egy dinamikus folyamat, amelyet a rostos extracelluláris mátrix (ECM) folyamatos felhalmozódása jellemez [2]. A májfibrózisban részt vevő fő sejtek a máj csillagsejtjei (HSC-k), amelyek négy ismert fenotípust mutatnak: nyugalmi, aktivált, inaktivált és öregedő [3, 4]. A HSC-k aktiválódhatnak és nyugalmi formából proliferatív fibroblaszt-szerű sejtekké transzdifferenciálódhatnak, amelyek nagy energiaigényt igényelnek, az α-simaizom aktin (α-SMA) és az I. típusú kollagén (Col-I) fokozott expressziójával [5, 6]. A májfibrózis visszafordítása során az aktivált HSC-k apoptózis vagy inaktiváció útján eliminálódnak. Ezek a folyamatok magukban foglalják a fibrogén gének szabályozásának csökkenését és a túlélést elősegítő gének (például az NF-κB és a PI3K/Akt jelátviteli útvonalak) modulációját [7, 8], valamint a mitokondriális dinamika és funkció változásait [9].
A bélben termelődő triptofán metabolit, az indol-3-propionsav (IPA) szérumszintje csökkentnek bizonyult az emberi anyagcsere-betegségekben, beleértve a MASLD-t is [10–13]. Az IPA összefüggésben áll az élelmi rostbevitellel, antioxidáns és gyulladáscsökkentő hatásairól ismert, és in vivo és in vitro egyaránt csökkenti az étrend által kiváltott alkoholmentes steatohepatitis (NASH) fenotípust [11–14]. Néhány bizonyíték korábbi tanulmányunkból származik, amely kimutatta, hogy a szérum IPA-szintje alacsonyabb volt a májfibrózisban szenvedő betegeknél, mint a májfibrózis nélküli elhízott betegeknél a Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS) vizsgálatban. Továbbá kimutattuk, hogy az IPA-kezelés csökkentheti a sejtadhézió, a sejtmigráció és a hematopoietikus őssejt-aktiváció klasszikus markereiként szolgáló gének expresszióját egy humán máj csillagsejt (LX-2) modellben, és potenciális májprotektív metabolit [15]. Azonban továbbra sem világos, hogy az IPA hogyan indukálja a májfibrózis regresszióját a HSC apoptózis és a mitokondriális bioenergetika aktiválásával.
Jelen tanulmányban bemutatjuk, hogy a szérum IPA szintje összefüggésben áll az apoptózisban, mitofágiában és hosszú élettartamban gazdag gének expressziójával elhízott, de nem 2-es típusú cukorbetegségben (KOBS) szenvedő egyének májában. Továbbá azt találtuk, hogy az IPA az inaktivációs útvonalon keresztül indukálhatja az aktivált hematopoietikus őssejtek (HSC-k) kiürülését és lebontását. Ezek az eredmények az IPA új szerepét mutatják, így potenciális terápiás célponttá válhat a májfibrózis regressziójának elősegítésére.
Egy korábbi, a KOBS kohorszban végzett vizsgálat kimutatta, hogy a májfibrózisban szenvedő betegeknél alacsonyabb volt a keringő IPA-szint a májfibrózis nélküli betegekhez képest [15]. A 2-es típusú cukorbetegség lehetséges zavaró hatásának kizárása érdekében 116 elhízott, 2-es típusú cukorbetegség nélküli beteget (átlagéletkor ± SD: 46,8 ± 9,3 év; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (1. táblázat) vontunk be a folyamatban lévő KOBS vizsgálatból a vizsgálati populációba [16]. Minden résztvevő írásbeli tájékoztatáson alapuló beleegyezését adta, és a vizsgálati protokollt az Észak-Savo Megyei Kórház Etikai Bizottsága jóváhagyta a Helsinki Nyilatkozatnak (54/2005, 104/2008 és 27/2010) megfelelően.
A májbiopsziás mintákat bariátriai műtét során vették, és tapasztalt patológusok szövettani vizsgálatot végeztek a korábban leírt kritériumok [17, 18] szerint. Az értékelési kritériumokat az S1. kiegészítő táblázat foglalja össze, és korábban már ismertették [19].
Az éhgyomri szérummintákat célzatlan folyadékkromatográfia-tömegspektrometriával (LC-MS) elemeztük metabolomikai analízis céljából (n = 116). A mintákat UHPLC-qTOF-MS rendszerrel (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Németország) elemeztük a korábban leírtak szerint19. Az izopropil-alkohol (IPA) azonosítása a retenciós idő és az MS/MS spektrum tiszta standardokkal való összehasonlítása alapján történt. Az IPA jelintenzitását (csúcsterület) minden további elemzésben figyelembe vettük [20].
A teljes máj RNS-szekvenálást Illumina HiSeq 2500 készülékkel végeztük, az adatokat a korábban leírtak szerint elődolgoztuk [19, 21, 22]. A mitokondriális funkciót/biogenezist befolyásoló transzkriptumok célzott differenciális expressziós analízisét a MitoMiner 4.0 adatbázisból kiválasztott 1957 gén felhasználásával végeztük [23]. A máj DNS-metilációs analízisét Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) segítségével végeztük, a korábban leírtakkal megegyező módszertant alkalmazva [24, 25].
Az emberi máj stellate sejteket (LX-2) Prof. Stefano Romeo bocsátotta rendelkezésünkre, melyeket DMEM/F12 táptalajban (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) tenyésztettünk és tartottunk fenn. Az IPA munkadózisának kiválasztásához az LX-2 sejteket különböző IPA-koncentrációkkal (10 μM, 100 μM és 1 mM; Sigma, 220027) kezeltük DMEM/F12 táptalajban 24 órán át. Továbbá, az IPA HSC-k inaktiválására való képességének vizsgálatához az LX-2 sejteket 5 ng/ml TGF-β1-gyel (R&D systems, 240-B-002/CF) és 1 mM IPA-val együtt kezeltük szérummentes táptalajban 24 órán át. A megfelelő vivőanyag-kontrollok esetében TGF-β1 kezeléshez 4 nM HCL-t, amely 0,1% BSA-t, IPA kezeléshez pedig 0,05% DMSO-t használtunk, és mindkettőt együtt alkalmaztuk a kombinált kezeléshez.
Az apoptózist FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit és 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, katalógusszám: 640922) segítségével, a gyártó utasításai szerint értékeltük. Röviden, az LX-2 sejteket (1 × 105 sejt/lyuk) egy éjszakán át tenyésztettük 12-lyukú lemezeken, majd több dózisú IPA-val vagy IPA-val és TGF-β1-gyel kezeltük. Másnap a lebegő és adherens sejteket összegyűjtöttük, tripszinizáltuk, PBS-sel mostuk, Annexin V kötőpufferben reszuszpendáltuk, majd FITC-Annexin V-vel és 7-AAD-vel inkubáltuk 15 percig.
Az élő sejtek mitokondriumait oxidatív aktivitás vizsgálatára Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) festékkel festettük. Az MTR vizsgálatokhoz az LX-2 sejteket azonos sűrűségben inkubáltuk IPA-val és TGF-β1-gyel. 24 óra elteltével az élő sejteket tripszinizáltuk, PBS-sel mostuk, majd 100 μM MTR-rel inkubáltuk szérummentes táptalajban 37 °C-on 20 percig, a korábban leírtak szerint [26]. Az élő sejtek morfológiai elemzéséhez a sejtek méretét és a citoplazmatikus komplexitást előreszórási (FSC), illetve oldalszórási (SSC) paraméterekkel elemeztük.
Minden adatot (30 000 esemény) NovoCyte Quanteon (Agilent) készülékkel gyűjtöttünk, és NovoExpress® 1.4.1 vagy FlowJo V.10 szoftverrel elemeztük.
Az oxigénfogyasztási sebességet (OCR) és az extracelluláris savasodási sebességet (ECAR) valós időben mérték egy Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) segítségével, amely Seahorse XF Cell Mito Stress készülékkel volt felszerelve, a gyártó utasításai szerint. Röviden, 2 × 104 LX-2 sejtet/lyuk mennyiségben helyeztek el XF96 sejtkultúra lemezeken. Egy éjszakán át tartó inkubáció után a sejteket izopropanollal (IPA) és TGF-β1-gyel kezelték (1. kiegészítő módszer). Az adatelemzést a Seahorse XF Wave szoftverrel végezték, amely tartalmazza a Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator-t. Ebből kiszámították a Bioenergetikai Egészség Indexet (BHI) [27].
A teljes RNS-t cDNS-sé írták át. A konkrét módszereket lásd a [15] hivatkozásban. Konstitutív génkontrollként humán 60S riboszomális savas protein P0 (RPLP0) és ciklofilin A1 (PPIA) mRNS-szinteket használtak. A QuantStudio 6 pro Real-Time PCR rendszert (Thermo Fisher, Landsmeer, Hollandia) használták a TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) vagy a Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) kíséretében, és a relatív génexpressziós szintet összehasonlító Ct-érték ciklikus paraméterek (ΔΔCt) és a ∆∆Ct módszer segítségével számították ki. A primerek részletei az S2. és S3. kiegészítő táblázatokban találhatók.
A nukleáris DNS-t (ncDNS) és a mitokondriális DNS-t (mtDNS) a DNeasy vér- és szövetminta-készlettel (Qiagen) extraháltuk a korábban leírtak szerint [28]. Az mtDNS relatív mennyiségét az egyes mtDNS cél régiók és a három nukleáris DNS régió geometriai átlagának arányának (mtDNS/ncDNS) kiszámításával számítottuk ki, a 2. kiegészítő módszerben részletezettek szerint. Az mtDNS és ncDNS primerek részleteit az S4. kiegészítő táblázat tartalmazza.
Az élő sejteket Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) festékkel festettük az intercelluláris és intracelluláris mitokondriális hálózatok vizualizálására. Az LX-2 sejteket (1 × 104 sejt/lyuk) üveglemezeken tenyésztettük megfelelő üvegaljú tenyésztőlemezeken (Ibidi GmbH, Martinsried, Németország). 24 óra elteltével az élő LX-2 sejteket 100 μM MTR-rel inkubáltuk 20 percig 37 °C-on, majd a sejtmagokat DAPI-val (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) festettük a korábban leírtak szerint [29]. A mitokondriális hálózatokat Zeiss Axio Observer inverz mikroszkóppal (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Németország) vizualizáltuk, amely Zeiss LSM 800 konfokális modullal volt felszerelve 37 °C-on, párásított atmoszférában, 5% CO2-tartalommal, 63×NA 1,3 objektívvel. Minden mintatípushoz tíz Z-sorozatú képet készítettünk. Minden Z-sorozat 30 metszetet tartalmaz, amelyek mindegyike 9,86 μm vastagságú. Minden mintához tíz különböző látómező képét készítették a ZEN 2009 szoftverrel (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Németország), a mitokondriális morfológiai elemzést pedig ImageJ szoftverrel (v1.54d) [30, 31] végezték a 3. kiegészítő módszerben részletezett paraméterek szerint.
A sejteket 2%-os glutaraldehiddel fixáltuk 0,1 M foszfátpufferben, majd 1%-os ozmium-tetroxid oldattal (Sigma Aldrich, MO, USA) fixáltuk, fokozatosan acetonnal dehidratáltuk (Merck, Darmstadt, Németország), és végül epoxigyantába ágyaztuk. Ultravékony metszeteket készítettünk, amelyeket 1%-os uranil-acetáttal (Merck, Darmstadt, Németország) és 1%-os ólom-citráttal (Merck, Darmstadt, Németország) festettünk. Az ultrastrukturális képeket JEM 2100F EXII transzmissziós elektronmikroszkóppal (JEOL Ltd, Tokió, Japán) készítettük 80 kV gyorsítófeszültségen.
Az IPA-val 24 órán át kezelt LX-2 sejtek morfológiáját fáziskontraszt mikroszkóppal elemeztük 50-szeres nagyításban, Zeiss inverz fénymikroszkóp (Zeiss Axio Vert.A1 és AxioCam MRm, Jena, Németország) segítségével.
A klinikai adatokat átlag ± szórás vagy medián (interkvartilis tartomány: IQR) formájában fejeztük ki. A három vizsgálati csoport közötti különbségek összehasonlítására egyutas varianciaanalízist (folytonos változók) vagy χ² tesztet (kategorikus változók) alkalmaztunk. A téves pozitív arányt (FDR) használtuk a többszörös tesztelés korrigálására, és a 0,05-nél kisebb FDR-értékű géneket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Spearman-korrelációs analízist alkalmaztunk a CpG DNS-metiláció és az IPA jelintenzitás közötti összefüggés kimutatására, nominális p-értékeket (p < 0,05) közöltünk.
Az útvonalanalízist egy webalapú génkészlet-elemző eszközzel (WebGestalt) végeztük 268 transzkriptum (nominális p < 0,01), 119 mitokondriumhoz kapcsolódó transzkriptum (nominális p < 0,05) és 3093 májtranszkriptumból 4350 CpG esetében, amelyek a keringő szérum IPA-szintjével voltak összefüggésben. Az átfedő gének megtalálásához a szabadon elérhető Venny DB (2.1.0 verzió) eszközt, a fehérje-fehérje interakciók vizualizálásához pedig a StringDB (11.5 verzió) eszközt használtuk.
Az LX-2 kísérletben a minták normalitásvizsgálatát D'Agostino-Pearson teszttel végeztük. Az adatokat legalább három biológiai replikátumból gyűjtöttük, és egyutas ANOVA-nak vetettük alá Bonferroni post hoc teszttel. A 0,05-nél kisebb p-értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Az adatokat átlag ± SD formátumban adjuk meg, és a kísérletek számát minden ábrán feltüntettük. Minden elemzést és grafikont a GraphPad Prism 8 statisztikai szoftverrel végeztünk Windows rendszeren (GraphPad Software Inc., 8.4.3 verzió, San Diego, USA).
Először a szérum IPA-szintek összefüggését vizsgáltuk a máj-, az egész test- és a mitokondriális transzkriptumokkal. A teljes transzkriptumprofilban a szérum IPA-szintekkel legerősebben összefüggő gén a MAPKAPK3 volt (FDR = 0,0077; mitogén-aktivált protein-kináz-aktivált protein-kináz 3); a mitokondriumokkal kapcsolatos transzkriptumprofilban a legerősebben összefüggő gén az AKT1 volt (FDR = 0,7621; AKT szerin/treonin kináz 1) (1. kiegészítő fájl és 2. kiegészítő fájl).
Ezután elemeztük a globális transzkriptumokat (n = 268; p < 0,01) és a mitokondriumhoz kapcsolódó transzkriptumokat (n = 119; p < 0,05), és végül az apoptózist azonosítottuk a legjelentősebb kanonikus útvonalként (p = 0,0089). A szérum IPA-szinttel összefüggő mitokondriális transzkriptumok esetében az apoptózisra (FDR = 0,00001), a mitofágiára (FDR = 0,00029) és a TNF jelátviteli útvonalakra (FDR = 0,000006) összpontosítottunk (1A. ábra, 2. táblázat és 1A-B. kiegészítő ábrák).
Globális, mitokondrium-asszociált transzkriptumok és DNS-metiláció átfedő elemzése emberi májban a szérum IPA-szintekkel összefüggésben. Az A 268 globális transzkriptumot, 119 mitokondrium-asszociált transzkriptumot és DNS-metilált transzkriptumot jelöl, amelyek 3092, a szérum IPA-szintekkel összefüggő CpG-helyhez vannak leképezve (p-értékek < 0,01 a globális transzkriptumok és a metilált DNS esetében, és p-értékek < 0,05 a mitokondriális transzkriptumok esetében). A főbb átfedő transzkriptumok középen láthatók (AKT1 és YKT6). B A legmagasabb interakciós pontszámmal (0,900) más génekkel rendelkező 13 gén interakciós térképét az 56 átfedő génből (fekete vonal régió) állítottuk össze, amelyek szignifikánsan társultak a szérum IPA-szintekkel a StringDB online eszköz segítségével. Zöld: A Gén Ontológia (GO) sejtes komponenséhez: mitokondriumok (GO:0005739) leképezett gének. Az AKT1 a legmagasabb pontszámmal (0,900) rendelkező fehérje a más fehérjékkel való kölcsönhatások tekintetében az adatok alapján (szövegbányászat, kísérletek, adatbázisok és koexpresszió alapján). A hálózati csomópontok a fehérjéket, az élek pedig a fehérjék közötti kapcsolatokat jelképezik.
Mivel a bélmikrobiota metabolitjai a DNS-metiláción keresztül szabályozhatják az epigenetikai összetételt [32], megvizsgáltuk, hogy a szérum IPA-szintje összefüggésben áll-e a máj DNS-metilációjával. Megállapítottuk, hogy a szérum IPA-szintjével összefüggő két fő metilációs hely a prolin-szerinben gazdag 3-as régió (C19orf55) és a hősokkfehérje B-család (kis) 6-os tagja (HSPB6) közelében található (3. kiegészítő fájl). A 4350 CpG DNS-metilációja (p < 0,01) korrelált a szérum IPA-szintjével, és gazdagodott a hosszú élettartamot szabályozó útvonalakban (p = 0,006) (1A. ábra, 2. táblázat és 1C. kiegészítő ábra).
A szérum IPA-szintek, a globális transzkriptumok, a mitokondriumhoz kapcsolódó transzkriptumok és az emberi májban a DNS-metiláció közötti összefüggések mögött meghúzódó biológiai mechanizmusok megértése érdekében átfedési elemzést végeztünk az előző útvonalelemzésben azonosított géneken (1A. ábra). Az 56 átfedő gén (az 1A. ábrán a fekete vonalon belül) útvonal-dúsulási elemzésének eredményei azt mutatták, hogy az apoptózis útvonal (p = 0,00029) két, a három elemzésben közös gént emelt ki: az AKT1-et és az YKT6-ot (YKT6 v-SNARE homológ), amint azt a Venn-diagram is mutatja (2. kiegészítő ábra és 1A. ábra). Érdekes módon azt találtuk, hogy az AKT1 (cg19831386) és az YKT6 (cg24161647) pozitív korrelációt mutatott a szérum IPA-szintjével (3. kiegészítő fájl). A géntermékek közötti potenciális fehérje-kölcsönhatások azonosítása érdekében az 56 átfedő gén közül 13, a legmagasabb közös régió pontszámmal (0,900) rendelkező gént választottuk ki bemenetként, és interakciós térképet készítettünk. A konfidenciaszint (marginális konfidencia) szerint az AKT1 gén, amely a legmagasabb pontszámot (0,900) érte el, helyezkedett el felül (1B. ábra).
Az útvonal-elemzés alapján azt találtuk, hogy az apoptózis a fő útvonal, ezért megvizsgáltuk, hogy az IPA-kezelés befolyásolja-e a HSC-k apoptózisát in vitro. Korábban kimutattuk, hogy az IPA különböző dózisai (10 μM, 100 μM és 1 mM) nem toxikusak az LX-2 sejtekre [15]. Ez a tanulmány kimutatta, hogy a 10 μM és 100 μM IPA-kezelés növelte az életképes és a nekrotikus sejtek számát. A kontrollcsoporthoz képest azonban a sejtek életképessége 1 mM IPA-koncentrációnál csökkent, míg a sejtek nekrózisának aránya változatlan maradt (2A., B. ábra). Ezután, hogy megtaláljuk az LX-2 sejtekben az apoptózis kiváltásához optimális koncentrációt, 24 órán át teszteltük a 10 μM, 100 μM és 1 mM IPA-t (2A-E. ábra és 3A-B. kiegészítő ábra). Érdekes módon az IPA 10 μM és 100 μM csökkentette az apoptózis mértékét (%), míg az IPA 1 mM növelte a késői apoptózist és az apoptózis mértékét (%) a kontrollhoz képest, ezért további kísérletekhez választottuk (2A–D. ábra).
Az IPA az LX-2 sejtek apoptózisát indukálja. Az apoptózis mértékét és a sejtek morfológiáját áramlási citometriával Annexin V és 7-AAD kettős festési módszerrel számszerűsítettük. A BA sejteket 10 μM, 100 μM és 1 mM IPA-val inkubáltuk 24 órán át, vagy F–H TGF-β1-gyel (5 ng/ml) és 1 mM IPA-val szérummentes táptalajban 24 órán át. A: élő sejtek (Annexin V -/ 7AAD-); B: nekrotikus sejtek (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: korai (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: késői (Annexin V+/7AAD.+); E, H: az összes korai és késői apoptotikus sejt százalékos aránya az apoptózis mértékében (%). Az adatokat átlag ± SD-ként fejeztük ki, n = 3 független kísérlet. A statisztikai összehasonlításokat egyutas ANOVA-val végeztük Bonferroni post hoc teszttel. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Amint azt korábban bemutattuk, az 5 ng/ml TGF-β1 a klasszikus markergének expressziójának fokozásával képes HSC aktivációt indukálni [15]. Az LX-2 sejteket 5 ng/ml TGF-β1 és 1 mM IPA kombinációjával kezeltük (2E–H. ábra). A TGF-β1 kezelés nem változtatta meg az apoptózis sebességét, azonban az IPA együttes kezelés növelte a késői apoptózist és az apoptózis sebességét (%) a TGF-β1 kezeléshez képest (2E–H. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az 1 mM IPA a TGF-β1 indukciójától függetlenül is elősegítheti az apoptózist az LX-2 sejtekben.
Tovább vizsgáltuk az IPA mitokondriális légzésre gyakorolt ​​hatását LX-2 sejtekben. Az eredmények azt mutatták, hogy 1 mM IPA csökkentette az oxigénfogyasztási sebesség (OCR) paramétereit: a nem mitokondriális légzést, a bazális és maximális légzést, a protonszivárgást és az ATP-termelést a kontrollcsoporthoz képest (3A., B. ábra), míg a bioenergetikai egészségindex (BHI) nem változott.
Az IPA csökkenti a mitokondriális légzést az LX-2 sejtekben. A mitokondriális légzési görbét (OCR) mitokondriális légzési paraméterekként mutatjuk be (nem mitokondriális légzés, bazális légzés, maximális légzés, protonszivárgás, ATP-képződés, SRC és BHI). Az A és B sejteket 10 μM, 100 μM és 1 mM IPA-val inkubáltuk 24 órán át. A C és D sejteket TGF-β1-gyel (5 ng/ml) és 1 mM IPA-val inkubáltuk szérummentes táptalajban 24 órán át. Minden mérést normalizáltunk a DNS-tartalomhoz a CyQuant kit segítségével. BHI: bioenergetikai egészségindex; SRC: légzési tartalékkapacitás; OCR: oxigénfogyasztási sebesség. Az adatokat átlag ± szórás (SD) formájában adjuk meg, n = 5 független kísérlet. A statisztikai összehasonlításokat egyutas ANOVA és Bonferroni post hoc teszt segítségével végeztük. *p < 0,05; **p < 0,01; és ***p < 0,001
Az IPA TGF-β1-aktivált LX-2 sejtek bioenergetikai profiljára gyakorolt ​​hatásának átfogóbb megértése érdekében OCR-rel elemeztük a mitokondriális oxidatív foszforilációt (3C, D ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a TGF-β1 kezelés csökkentheti a maximális légzést, a légzési tartalékkapacitást (SRC) és a BHI-t a kontrollcsoporthoz képest (3C, D ábra). Ezenkívül a kombinált kezelés csökkentette az alaplégzést, a protonszivárgást és az ATP-termelést, de az SRC és a BHI szignifikánsan magasabb volt, mint a TGF-β1-gyel kezelt csoportban (3C, D ábra).
Elvégeztük a Seahorse szoftver által biztosított „Cellular Energy Phenotype Test” (4A–D kiegészítő ábra) tesztet is. Amint a 3B kiegészítő ábrán látható, mind az OCR, mind az ECAR metabolikus potenciálja csökkent a TGF-β1 kezelés után, azonban a kombinált és az IPA kezelési csoportokban nem volt különbség a kontrollcsoporthoz képest. Továbbá, mind az OCR bazális, mind a stressz szintje csökkent a kombinációs és az IPA kezelés után a kontrollcsoporthoz képest (4C kiegészítő ábra). Érdekes módon hasonló mintázatot figyeltek meg a kombinált terápia során, ahol az ECAR bazális és stressz szintjében nem volt változás a TGF-β1 kezeléshez képest (4C kiegészítő ábra). A HSC-kben a mitokondriális oxidatív foszforiláció csökkenése és a kombinált kezelés SCR és BHI helyreállítására való képessége a TGF-β1 kezelés után nem változtatta meg a metabolikus potenciált (OCR és ECAR). Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatják, hogy az IPA csökkentheti a bioenergetikát a HSC-kben, ami arra utal, hogy az IPA alacsonyabb energetikai profilt indukálhat, ami a HSC fenotípust az inaktiváció felé tolja el (4D kiegészítő ábra).
Az IPA mitokondriális dinamikájára gyakorolt ​​hatását a mitokondriális morfológia és hálózati kapcsolatok háromdimenziós kvantifikálásával, valamint MTR festéssel vizsgálták (4. ábra és 5. kiegészítő ábra). A 4. ábra azt mutatja, hogy a kontrollcsoporthoz képest a TGF-β1 kezelés csökkentette az átlagos felületet, az ágak számát, a teljes ághosszt és az elágazási pontok számát (4A. és B. ábra), és a mitokondriumok arányát szférikusról köztes morfológiára változtatta (4C. ábra). Csak az IPA kezelés csökkentette az átlagos mitokondriális térfogatot és változtatta meg a mitokondriumok arányát szférikusról köztes morfológiára a kontrollcsoporthoz képest (4A. ábra). Ezzel szemben a szférikusság, az átlagos ághossz és a mitokondriális aktivitás, amelyet a mitokondriális membránpotenciál-függő MTR-rel mértek (4A. és E. ábra), változatlan maradt, és ezek a paraméterek nem különböztek a csoportok között. Összefoglalva, ezek az eredmények arra utalnak, hogy a TGF-β1 és az IPA kezelés úgy tűnik, hogy modulálja a mitokondriumok alakját és méretét, valamint a hálózati komplexitást az élő LX-2 sejtekben.
Az IPA megváltoztatja a mitokondriális dinamikát és a mitokondriális DNS mennyiségét LX-2 sejtekben. A. Élő LX-2 sejtek reprezentatív konfokális képei, melyeket TGF-β1-gyel (5 ng/ml) és 1 mM IPA-val inkubáltunk 24 órán át szérummentes táptalajban, a Mitotracker™ Red CMXRos-szal festett mitokondriális hálózatokon és DAPI-val kékre festett sejtmagokon. Minden adat legalább 15 képet tartalmazott csoportonként. Minden mintatípushoz 10 Z-stack képet készítettünk. Minden Z-tengely szekvencia 30 szeletet tartalmazott, mindegyik vastagsága 9,86 μm volt. Lépték: 10 μm. B. Reprezentatív objektumok (csak mitokondriumok), amelyeket adaptív küszöbérték alkalmazásával azonosítottunk a képen. A mitokondriális morfológiai hálózati kapcsolatok kvantitatív elemzését és összehasonlítását minden csoport összes sejtjére elvégeztük. C. A mitokondriális alakarányok gyakorisága. A 0-hoz közeli értékek gömb alakú alakzatokat, az 1-hez közeli értékek pedig fonalas alakzatokat jelölnek. D A mitokondriális DNS (mtDNS) tartalmát az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint határoztuk meg. Az E Mitotracker™ Red CMXRos analízist áramlási citometriával végeztük (30 000 esemény) az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint. Az adatokat átlag ± SD formátumban adjuk meg, n = 3 független kísérlet. A statisztikai összehasonlításokat egyutas ANOVA és Bonferroni post hoc teszttel végeztük. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Ezután elemeztük az LX-2 sejtek mtDNS-tartalmát, amely a mitokondriális szám indikátora. A kontrollcsoporthoz képest a TGF-β1-gyel kezelt csoportban a mtDNS-tartalom magasabb volt (4D. ábra). A TGF-β1-gyel kezelt csoporthoz képest a kombinált kezelési csoportban a mtDNS-tartalom csökkent (4D. ábra), ami arra utal, hogy az IPA csökkentheti a mtDNS-tartalmat és esetleg a mitokondriális számot, valamint a mitokondriális légzést (3C. ábra). Továbbá úgy tűnt, hogy az IPA csökkentette a mtDNS-tartalmat a kombinált kezelésben, de nem befolyásolta az MTR-közvetített mitokondriális aktivitást (4A–C. ábra).
Vizsgáltuk az IPA és a fibrózissal, apoptózissal, túléléssel és mitokondriális dinamikával kapcsolatos gének mRNS-szintjének összefüggését LX-2 sejtekben (5A–D ábra). A kontrollcsoporthoz képest a TGF-β1-gyel kezelt csoport olyan gének fokozott expresszióját mutatta, mint az I. típusú kollagén α2 lánc (COL1A2), az α-simaizom aktin (αSMA), a mátrix metalloproteináz 2 (MMP2), a metalloproteináz 1 szöveti inhibitora (TIMP1) és a dinamin 1-szerű gén (DRP1), ami fokozott fibrózisra és aktivációra utal. Továbbá a kontrollcsoporthoz képest a TGF-β1 kezelés csökkentette a nukleáris pregnán X receptor (PXR), a kaszpáz 8 (CASP8), a MAPKAPK3, a B-sejt α inhibitora, a nukleáris faktor κ gén fénypeptidjének fokozója (NFκB1A) és a nukleáris faktor κB kináz alegység β inhibitora (IKBKB) mRNS-szintjét (5A–D ábra). A TGF-β1 kezeléssel összehasonlítva a TGF-β1 és IPA kombinált kezelés csökkentette a COL1A2 és az MMP2 expresszióját, de növelte a PXR, TIMP1, B-sejtes limfóma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β és IKBKB mRNS szintjét. Az IPA kezelés szignifikánsan csökkentette az MMP2, a Bcl-2-asszociált protein X (BAX), az AKT1, az optikus atrófia protein 1 (OPA1) és a mitokondriális fúziós protein 2 (MFN2) expresszióját, míg a CASP8, NFκB1A, NFκB1B és IKBKB expressziója megnőtt a kontrollcsoporthoz képest. A kaszpáz-3 (CASP3), az apoptotikus peptidáz aktiváló faktor 1 (APAF1), a mitokondriális fúziós protein 1 (MFN1) és a hasadási protein 1 (FIS1) expressziójában azonban nem találtak különbséget. Ezek az eredmények együttesen arra utalnak, hogy az IPA kezelés modulálja a fibrózissal, az apoptózissal, a túléléssel és a mitokondriális dinamikával kapcsolatos gének expresszióját. Adataink arra utalnak, hogy az IPA-kezelés csökkenti a fibrózist az LX-2 sejtekben; ugyanakkor serkenti a túlélést azáltal, hogy a fenotípust az inaktiváció felé tolja el.
Az IPA modulálja a fibroblaszt, apoptotikus, életképességi és mitokondriális dinamikai gének expresszióját LX-2 sejtekben. A hisztogramok az mRNS expresszióját mutatják az endogén kontrollhoz (RPLP0 vagy PPIA) viszonyítva, miután az LX-2 sejteket TGF-β1-gyel és IPA-val indukáltuk szérummentes táptalajban 24 órán át. Az A a fibroblasztokat, a B az apoptotikus sejteket, a C a túlélő sejteket, a D pedig a mitokondriális dinamikai génexpressziót jelöli. Az adatokat átlag ± szórás (SD) formájában adjuk meg, n = 3 független kísérlet. A statisztikai összehasonlításokat egyutas ANOVA és Bonferroni post hoc teszt segítségével végeztük. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Ezután áramlási citometriával (6A., B. ábra) értékeltük a sejtméret (FSC-H) és a citoplazmatikus komplexitás (SSC-H) változásait, az IPA-kezelés utáni sejtmorfológiai változásokat pedig transzmissziós elektronmikroszkópiával (TEM) és fáziskontraszt mikroszkópiával (6A-B. kiegészítő ábra). A várakozásoknak megfelelően a TGF-β1-gyel kezelt csoportban a sejtek mérete megnőtt a kontrollcsoporthoz képest (6A., B. ábra), ami a durva endoplazmatikus retikulum (ER*) és a fagolizoszómák (P) klasszikus expanzióját mutatja, ami a hematopoietikus őssejtek (HSC) aktivációját jelzi (6A. kiegészítő ábra). A TGF-β1-gyel kezelt csoporthoz képest azonban a sejtek mérete, a citoplazmatikus komplexitás (6A., B. ábra) és az ER*-tartalom csökkent a TGF-β1 és IPA kombinációs kezelési csoportban (6A. kiegészítő ábra). Továbbá az IPA-kezelés csökkentette a sejtek méretét, a citoplazmatikus komplexitást (6A., B. ábra), a P és az ER*-tartalmat (6A. kiegészítő ábra) a kontrollcsoporthoz képest. Ezenkívül az apoptotikus sejtek tartalma 24 órás IPA-kezelés után megnőtt a kontrollcsoporthoz képest (fehér nyilak, Kiegészítő 6B. ábra). Ezek az eredmények együttesen arra utalnak, hogy az 1 mM IPA stimulálhatja a HSC apoptózist és visszafordíthatja a TGF-β1 által kiváltott sejtmorfológiai paraméterek változásait, ezáltal szabályozva a sejtek méretét és komplexitását, ami összefüggésben lehet a HSC inaktivációjával.
Az IPA megváltoztatja a sejtek méretét és a citoplazmatikus komplexitását LX-2 sejtekben. Az áramlási citometriás analízis reprezentatív képei. Az analízis az LX-2 sejtekre specifikus kapuzási stratégiát alkalmazta: SSC-A/FSC-A a sejtpopuláció meghatározásához, FSC-H/FSC-A a dubletek azonosításához, és SSC-H/FSC-H a sejtméret és a komplexitás elemzéséhez. A sejteket TGF-β1-gyel (5 ng/ml) és 1 mM IPA-val inkubáltuk szérummentes táptalajban 24 órán át. Az LX-2 sejteket a bal alsó kvadránsba (SSC-H-/FSC-H-), a bal felső kvadránsba (SSC-H+/FSC-H-), a jobb alsó kvadránsba (SSC-H-/FSC-H+) és a jobb felső kvadránsba (SSC-H+/FSC-H+) osztottuk el a sejtméret és a citoplazmatikus komplexitás elemzéséhez. B. A sejtek morfológiáját áramlási citometriával elemeztük FSC-H (előreszórás, sejtméret) és SSC-H (oldalszórás, citoplazmatikus komplexitás) (30 000 esemény) segítségével. Az adatokat átlag ± SD formátumban adjuk meg, n = 3 független kísérlet. A statisztikai összehasonlításokat egyutas ANOVA és Bonferroni post hoc teszt segítségével végeztük. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 és ****p < 0,0001
Az IPA-hoz hasonló bélmetabolitok a kutatás forró témájává váltak, ami arra utal, hogy új célpontokat fedezhetnek fel a bélmikrobiotában. Ezért érdekes, hogy az IPA, egy olyan metabolit, amelyet emberekben a májfibrózissal hoztak összefüggésbe [15], potenciális antifibrotikus vegyületnek bizonyult állatmodellekben [13, 14]. Ebben a tanulmányban elsőként mutatunk be összefüggést a szérum IPA és a globális máj transzkriptomika, valamint a DNS-metiláció között elhízott, 2-es típusú cukorbetegségben (T2D) nem szenvedő egyénekben, kiemelve az apoptózist, a mitofágiát és a hosszú élettartamot, valamint egy lehetséges AKT1 gént, amely a máj homeosztázisát szabályozza. Tanulmányunk további újdonsága, hogy bemutattuk az IPA-kezelés kölcsönhatását az apoptózissal, a sejtmorfológiával, a mitokondriális bioenergetikával és a dinamikával LX-2 sejtekben, ami egy alacsonyabb energiaspektrumra utal, amely a HSC fenotípust az inaktiváció felé tolja el, így az IPA potenciális jelöltté válik a májfibrózis javításában.
Megállapítottuk, hogy az apoptózis, a mitofágia és a hosszú élettartam voltak a legfontosabb kanonikus útvonalak, amelyek a keringő szérum IPA-val kapcsolatos májgénekben gazdagok voltak. A mitokondriális minőségellenőrzési (MQC) rendszer zavara mitokondriális diszfunkcióhoz, mitofágiához és apoptózishoz vezethet, ezáltal elősegítve a MASLD kialakulását [33, 34]. Ezért feltételezhetjük, hogy az IPA szerepet játszhat a sejtdinamika és a mitokondriális integritás fenntartásában az apoptózis, a mitofágia és a hosszú élettartam révén a májban. Adataink azt mutatták, hogy két gén volt közös a három vizsgálatban: az YKT6 és az AKT1. Érdemes megjegyezni, hogy az YKT6 egy SNARE fehérje, amely részt vesz a sejtmembrán fúziójának folyamatában. Szerepet játszik az autofágiában és a mitofágiában azáltal, hogy iniciációs komplexet képez az STX17-tel és a SNAP29-cel az autofagoszómán, ezáltal elősegítve az autofagoszómák és a lizoszómák fúzióját [35]. Továbbá az YKT6 funkciójának elvesztése károsodott mitofágiát eredményez [36], míg az YKT6 felregulációja a hepatocelluláris karcinóma (HCC) progressziójával jár, ami fokozott sejttúlélést mutat [37]. Másrészt az AKT1 a legfontosabb kölcsönható gén, és fontos szerepet játszik a májbetegségekben, beleértve a PI3K/AKT jelátviteli útvonalat, a sejtciklust, a sejtmigrációt, a proliferációt, a fokális adhéziót, a mitokondriális funkciót és a kollagénszekréciót [38–40]. Az aktivált PI3K/AKT jelátviteli útvonal aktiválhatja a hematopoietikus őssejteket (HSC-ket), amelyek az extracelluláris mátrix (ECM) termeléséért felelős sejtek, és szabályozásának zavara hozzájárulhat a májfibrózis kialakulásához és progressziójához [40]. Ezenkívül az AKT az egyik kulcsfontosságú sejttúlélési faktor, amely gátolja a p53-függő sejtapoptosist, és az AKT aktiváció összefüggésben állhat a májsejtapoptosis gátlásával [41, 42]. A kapott eredmények arra utalnak, hogy az IPA szerepet játszhat a máj mitokondriumához kapcsolódó apoptózisban azáltal, hogy befolyásolja a hepatociták döntését az apoptózisba lépés és a túlélés között. Ezeket a hatásokat az AKT és/vagy YKT6 jelöltgének szabályozhatják, amelyek kritikus fontosságúak a máj homeosztázisa szempontjából.
Eredményeink azt mutatták, hogy az 1 mM IPA apoptózist indukált és csökkentette a mitokondriális légzést az LX-2 sejtekben, függetlenül a TGF-β1 kezeléstől. Figyelemre méltó, hogy az apoptózis a fibrózis feloldásának és a hematopoietikus őssejtek (HSC) aktiválódásának egyik fő útvonala, valamint kulcsfontosságú esemény a májfibrózis reverzibilis fiziológiai válaszában [4, 43]. Ezenkívül a BHI helyreállítása az LX-2 sejtekben a kombinált kezelés után új ismereteket nyújtott az IPA potenciális szerepéről a mitokondriális bioenergetika szabályozásában. Nyugalmi és inaktív körülmények között a hematopoietikus sejtek normális esetben a mitokondriális oxidatív foszforilációt használják ATP előállítására, és alacsony metabolikus aktivitással rendelkeznek. Másrészt a HSC aktiváció fokozza a mitokondriális légzést és bioszintézist, hogy kompenzálja a glikolítikus állapotba való belépéshez szükséges energiaigényt [44]. Az a tény, hogy az IPA nem befolyásolta a metabolikus potenciált és az ECAR-t, arra utal, hogy a glikolítikus útvonal kevésbé prioritást élvez. Hasonlóképpen, egy másik tanulmány kimutatta, hogy az 1 mM IPA képes volt modulálni a mitokondriális légzési lánc aktivitását szívizomsejtekben, emberi májsejt sejtvonalban (Huh7) és emberi köldökvéna endotélsejtekben (HUVEC); Azonban az IPA nem befolyásolta a glikolízist a szívizomsejtekben, ami arra utal, hogy az IPA befolyásolhatja más sejttípusok bioenergetikáját [45]. Ezért feltételezzük, hogy az 1 mM IPA enyhe kémiai szétkapcsolóként működhet, mivel jelentősen csökkentheti a fibrogén génexpressziót, a sejtmorfológiát és a mitokondriális bioenergetikát anélkül, hogy megváltoztatná az mtDNS mennyiségét [46]. A mitokondriális szétkapcsolók gátolhatják a tenyészet által kiváltott fibrózist és a HSC aktivációt [47], és csökkenthetik a mitokondriális ATP-termelést, amelyet bizonyos fehérjék, például a szétkapcsoló fehérjék (UCP) vagy az adenin nukleotid transzlokáz (ANT) szabályoznak vagy indukálnak. A sejttípustól függően ez a jelenség megvédheti a sejteket az apoptózistól és/vagy elősegítheti az apoptózist [46]. Azonban további vizsgálatokra van szükség az IPA mitokondriális szétkapcsoló szerepének tisztázásához a hematopoietikus őssejtek inaktivációjában.
Ezután megvizsgáltuk, hogy a mitokondriális légzésben bekövetkező változások tükröződnek-e az élő LX-2 sejtek mitokondriális morfológiájában. Érdekes módon a TGF-β1 kezelés a mitokondriális arányt gömb alakúról köztes alakúra változtatja, csökkent mitokondriális elágazással és a DRP1, a mitokondriális hasadás kulcsfontosságú tényezőjének fokozott expressziójával [48]. Továbbá, a mitokondriális fragmentáció összefügg az általános hálózati komplexitással, és a fúzióból a hasadásba való átmenet kritikus fontosságú a hematopoietikus őssejtek (HSC) aktiválódása szempontjából, míg a mitokondriális hasadás gátlása HSC apoptózishoz vezet [49]. Így eredményeink azt mutatják, hogy a TGF-β1 kezelés a mitokondriális hálózati komplexitás csökkenését idézheti elő az elágazás csökkenésével, ami gyakoribb az aktivált hematopoietikus őssejtekkel (HSC-kkel) összefüggő mitokondriális hasadásban. Továbbá adataink azt mutatták, hogy az IPA megváltoztathatja a mitokondriumok arányát gömb alakúról köztes alakúra, ezáltal csökkentve az OPA1 és az MFN2 expresszióját. Tanulmányok kimutatták, hogy az OPA1 szabályozásának csökkentése a mitokondriális membránpotenciál csökkenését okozhatja és sejtapoptózist válthat ki [50]. Az MFN2-ről ismert, hogy közvetíti a mitokondriális fúziót és az apoptózist [51]. A kapott eredmények arra utalnak, hogy az LX-2 sejtek TGF-β1 és/vagy IPA általi indukciója úgy tűnik, hogy modulálja a mitokondriumok alakját és méretét, valamint az aktivációs állapotot és a hálózati komplexitást.
Eredményeink azt mutatják, hogy a TGFβ-1 és IPA kombinált kezelése csökkentheti a mtDNS és a sejtmorfológiai paramétereket azáltal, hogy szabályozza a fibrózis, az apoptózis és a túléléssel kapcsolatos gének mRNS expresszióját az apoptózist elkerülő sejtekben. Valóban, az IPA csökkentette az AKT1 és a fontos fibrózis gének, például a COL1A2 és az MMP2 mRNS expressziós szintjét, de növelte a CASP8 expressziós szintjét, amely az apoptózissal van összefüggésben. Eredményeink azt mutatták, hogy az IPA kezelés után a BAX expressziója csökkent, és a TIMP1 család alegységeinek, a BCL-2-nek és az NF-κB-nek az mRNS expressziója nőtt, ami arra utal, hogy az IPA stimulálhatja a túlélési jeleket az apoptózist elkerülő hematopoietikus őssejtekben (HSC-k). Ezek a molekulák pro-túlélési jelként működhetnek az aktivált hematopoietikus őssejtekben, ami összefüggésben állhat az anti-apoptotikus fehérjék (például Bcl-2) fokozott expressziójával, a pro-apoptotikus BAX csökkent expressziójával, valamint a TIMP és az NF-κB közötti komplex kölcsönhatással [5, 7]. Az IPA a PXR-en keresztül fejti ki hatását, és azt tapasztaltuk, hogy a TGF-β1 és IPA kombinált kezelés növelte a PXR mRNS expressziós szintjét, ami a HSC aktiváció elnyomását jelzi. Az aktivált PXR jelátvitelről ismert, hogy in vivo és in vitro is gátolja a HSC aktivációt [52, 53]. Eredményeink azt mutatják, hogy az IPA részt vehet az aktivált HSC-k elszámolásában az apoptózis elősegítésével, a fibrózis és a mitokondriális anyagcsere csökkentésével, valamint a túlélési jelek fokozásával, amelyek tipikus folyamatok, amelyek az aktivált HSC fenotípust inaktiválttá alakítják. Az IPA apoptózisban betöltött potenciális mechanizmusának és szerepének egy másik lehetséges magyarázata az, hogy a diszfunkcionális mitokondriumokat elsősorban a mitofágián (intrinsic útvonal) és a külső TNF jelátviteli útvonalon (1. táblázat) keresztül gyűjti össze, amely közvetlenül kapcsolódik az NF-κB túlélési jelátviteli útvonalhoz (7. kiegészítő ábra). Érdekes módon az IPA-val kapcsolatos dúsított gének képesek pro-apoptotikus és pro-túlélési jeleket indukálni az apoptotikus útvonalon [54], ami arra utal, hogy az IPA ezekkel a génekkel kölcsönhatásba lépve indukálhatja az apoptotikus útvonalat vagy a túlélést. Azonban az IPA apoptózist vagy túlélést indukáló mechanizmusa a HSC aktiváció során és annak mechanizmusai továbbra sem tisztázottak.
Az IPA egy mikrobiális metabolit, amely az étrendi triptofánból képződik a bélmikrobiotán keresztül. Tanulmányok kimutatták, hogy gyulladáscsökkentő, antioxidáns és epigenetikai szabályozó tulajdonságokkal rendelkezik a bélrendszerben.[55] Tanulmányok kimutatták, hogy az IPA modulálhatja a bélbarrier funkcióját és csökkentheti az oxidatív stresszt, ami hozzájárulhat lokális fiziológiai hatásaihoz.[56] Valójában az IPA a keringésen keresztül jut el a célszervekhez, és mivel az IPA hasonló fő metabolitszerkezettel rendelkezik, mint a triptofán, a szerotonin és az indol származékok, az IPA metabolikus hatásokat fejt ki, ami versengő metabolikus sorsokat eredményez.[52] Az IPA versenghet a triptofánból származó metabolitokkal az enzimek vagy receptorok kötőhelyeiért, potenciálisan megzavarva a normál metabolikus útvonalakat. Ez rávilágít a farmakokinetikájának és farmakodinamikájának további vizsgálatára, hogy jobban megértsük terápiás ablakát.[57] Még nem tisztázott, hogy ez hematopoietikus őssejtekben (HSC-k) is előfordulhat-e.
Elismerjük, hogy tanulmányunknak vannak bizonyos korlátai. Az IPA-val kapcsolatos összefüggések célzott vizsgálata érdekében kizártuk a 2-es típusú cukorbetegségben (T2DM) szenvedő betegeket. Elismerjük, hogy ez korlátozza eredményeink széles körű alkalmazhatóságát a 2-es típusú cukorbetegségben és előrehaladott májbetegségben szenvedő betegekre. Bár az IPA fiziológiás koncentrációja az emberi szérumban 1–10 μM [11, 20], az 1 mM IPA koncentrációt a legmagasabb nem toxikus koncentráció [15] és a legmagasabb apoptózisarány alapján választottuk ki, a nekrotikus sejtpopuláció százalékos arányában nem mutatkozva különbség. Bár ebben a vizsgálatban az IPA szuprafiziológiai szintjeit alkalmaztuk, jelenleg nincs konszenzus az IPA hatékony dózisát illetően [52]. Bár eredményeink jelentősek, az IPA tágabb metabolikus sorsa továbbra is aktív kutatási terület. Ezenkívül a szérum IPA-szintjei és a máj transzkriptumok DNS-metilációja közötti összefüggésre vonatkozó eredményeinket nemcsak hematopoietikus őssejtekből (HSC-k), hanem májszövetekből is szereztük. Korábbi transzkriptomanalízis eredményei alapján választottuk az emberi LX-2 sejteket, melyek szerint az IPA összefüggésben áll a hematopoietikus őssejtek (HSC) aktivációjával [15], és a HSC-k a májfibrózis progressziójában részt vevő fő sejtek. A máj több sejttípusból áll, ezért más sejtmodelleket, például a hepatocita-HSC-immunsejt kokultúra rendszert kaszpáz aktivációval és DNS fragmentációval kombinálva, valamint a hatásmechanizmust, beleértve a fehérjeszintet is, figyelembe kell venni az IPA szerepének és más májsejttípusokkal való kölcsönhatásának tanulmányozásához.