Különböző növényvédelmi elméletek fontos elméleti útmutatást nyújtanak a növények specializált anyagcseréjének mintázatainak magyarázatához, de főbb előrejelzéseik még tesztelésre várnak. Jelen tanulmányban elfogulatlan tandem tömegspektrometriás (MS/MS) analízist alkalmaztunk a dohány attenuált törzseinek metabolomjának szisztematikus feltárására az egyes növényektől a populációkig és a közeli rokon fajokig, és nagyszámú tömegspektrometriás jellemzőelméletet dolgoztunk fel az információs vegyületspektrumok alapján. Keretrendszer az optimális védekezés (OD) és a mozgó célpont (MT) elméletek főbb előrejelzéseinek tesztelésére. A növényi metabolomika információs komponense összhangban van az OD elmélettel, de ellentmond az MT elmélet fő előrejelzésének a növényevők által okozott metabolomikai dinamikákról. A mikro- és makro evolúciós skálától a jázmonát jel az OD fő meghatározójaként azonosítható, míg az etilén jel a növényevő-specifikus válasz finomhangolását biztosította, amelyet az MS/MS molekuláris hálózat annotált.
A növények környezethez való alkalmazkodásában, különösen az ellenségek elleni védekezésben, a speciális, változatos szerkezetű metabolitok a fő résztvevői (1). A növényekben található speciális anyagcsere elképesztő diverzifikációja évtizedekig tartó mélyreható kutatásokat indított el ökológiai funkcióinak számos aspektusával kapcsolatban, és számos növényvédelmi elméletet hozott létre, amelyek a növény-rovar kölcsönhatások evolúciós és ökológiai fejlődését írják le. Az empirikus kutatások fontos útmutatást nyújtanak (2). Ezek a növényvédelmi elméletek azonban nem a hipotetikus deduktív érvelés normatív útját követték, amelyben a kulcsfontosságú előrejelzések ugyanazon az elemzési szinten voltak (3), és kísérletileg tesztelték őket az elméleti fejlődés következő ciklusának előmozdítása érdekében (4). A technikai korlátok az adatgyűjtést meghatározott metabolikus kategóriákra korlátozzák, és kizárják a specializált metabolitok átfogó elemzését, így megakadályozva a kategóriák közötti összehasonlításokat, amelyek elengedhetetlenek az elméleti fejlődéshez (5). Az átfogó metabolomikai adatok és a különböző növénycsoportok közötti anyagcsere-tér feldolgozási munkafolyamatának összehasonlítására szolgáló közös valuta hiánya akadályozza a terület tudományos érettségét.
A tandem tömegspektrometriás (MS/MS) metabolomika területén elért legújabb fejlesztések átfogóan jellemzik az adott rendszerkládon belüli és a fajokon belüli metabolikus változásokat, és számítási módszerekkel kombinálva kiszámítható ezen komplex keverékek szerkezeti hasonlósága. Kémiai előzetes ismeretek (5). A fejlett elemzési és számítási technológiák kombinációja biztosítja a szükséges keretet az anyagcsere-diverzitás ökológiai és evolúciós elméletei által tett számos jóslat hosszú távú teszteléséhez. Shannon (6) 1948-as alapvető cikkében mutatta be először az információelméletet, lerakva az információk matematikai elemzésének alapjait, amelyet az eredeti alkalmazásán kívül számos más területen is alkalmaztak. A genomikában az információelméletet sikeresen alkalmazták a szekvencia-konzervatív információk számszerűsítésére (7). A transzkriptomikai kutatásokban az információelmélet a transzkriptom általános változásait elemzi (8). Korábbi kutatásainkban az információelmélet statisztikai keretrendszerét alkalmaztuk a metabolomikára, hogy leírjuk a növények szöveti szintű metabolikus szakértelmét (9). Itt az MS/MS-alapú munkafolyamatot az információelmélet statisztikai keretrendszerével kombináljuk, amelyet a közös pénznem metabolikus diverzitása jellemez, hogy összehasonlítsuk a növényvédő elmélet főbb jóslatait a növényevők által indukált metabolomra vonatkozóan.
A növényvédelem elméleti keretei általában kölcsönösen befogadóak, és két kategóriába sorolhatók: azok, amelyek a növényspecifikus metabolitok eloszlását próbálják megmagyarázni a védekező funkciók alapján, mint például az optimális védekezés (OD) (10), a mozgó célpont (MT) (11) és a megjelenés (12) elmélete, míg mások mechanikus magyarázatokat keresnek arra vonatkozóan, hogy az erőforrások elérhetőségének változásai hogyan befolyásolják a növények növekedését és a specializált metabolitok, például a szén felhalmozódását: tápanyag-egyensúly hipotézis (13), növekedési ütem hipotézis (14), valamint a növekedési és differenciálódási egyensúly hipotézis (15). A két elméletcsoport az elemzés különböző szintjén áll (4). Azonban két, a funkcionális szintű védekező funkciókat magában foglaló elmélet dominál a növények konstitutív és indukálható védekezéséről szóló párbeszédben: az OD elmélet, amely feltételezi, hogy a növények csak szükség esetén fektetnek be drága kémiai védekezésükbe, például amikor lenyelik őket. Amikor egy fűféle támad, tehát a jövőbeni támadás lehetősége szerint a védekező funkciójú vegyületet rendelik hozzá (10); Az MT hipotézis szerint nincs irányított metabolitváltozási tengely, hanem a metabolit véletlenszerűen változik, ezáltal megteremtve a lehetőséget a támadó növényevők metabolikus „mozgáscélpontjának” akadályozására. Más szóval, ez a két elmélet ellentétes előrejelzéseket tesz a növényevők támadását követő metabolikus átalakulásról: a védekező funkciójú metabolitok (OD) egyirányú felhalmozódása és a nem irányított metabolikus változások (MT) közötti kapcsolatról (11).
Az OD és MT hipotézisek nemcsak a metabolomban indukált változásokat foglalják magukban, hanem ezen metabolitok felhalmozódásának ökológiai és evolúciós következményeit is, például ezen metabolikus változások adaptív költségeit és előnyeit egy adott ökológiai környezetben (16). Bár mindkét hipotézis elismeri a specializált metabolitok védekező funkcióját, amely lehet költséges vagy nem, az OD és MT hipotéziseket megkülönböztető kulcsfontosságú predikció az indukált metabolikus változások irányultságában rejlik. Az OD elmélet predikciója kapta eddig a legtöbb kísérleti figyelmet. Ezek a tesztek magukban foglalják specifikus vegyületek különböző szöveteinek közvetlen vagy közvetett védekező funkcióinak vizsgálatát üvegházakban és természetes körülmények között, valamint a növények fejlődési szakaszában bekövetkező változásokat (17-19). Azonban eddig, mivel hiányzik a munkafolyamat és a statisztikai keretrendszer bármely élőlény metabolikus diverzitásának globális, átfogó elemzéséhez, a két elmélet közötti fő különbség-előrejelzés (azaz az anyagcsere-változások iránya) még tesztelésre vár. Itt egy ilyen elemzést nyújtunk.
A növényspecifikus metabolitok egyik legjelentősebb jellemzője a rendkívüli szerkezeti sokféleség minden szinten, az egyes növényektől a populációkig a hasonló fajokig (20). A specializált metabolitokban számos mennyiségi változás figyelhető meg populációs szinten, míg a fajok szintjén általában erős minőségi különbségek maradnak fenn (20). Ezért a növények anyagcsere-diverzitása a funkcionális diverzitás fő aspektusa, amely tükrözi a különböző résekhez való alkalmazkodóképességet, különösen azokhoz a résekhez, ahol eltérő inváziós lehetőségek vannak a speciális rovarok és a gyakori növényevők számára (21). Fraenkel (22) úttörő cikke óta, amely a növényspecifikus metabolitok létezésének okait tárgyalja, a különböző rovarokkal való kölcsönhatásokat fontos szelekciós nyomásnak tekintik, és úgy vélik, hogy ezek a kölcsönhatások formálták a növényeket az evolúció során. Metabolikus útvonal (23). A specializált metabolitok sokféleségében mutatkozó fajok közötti különbségek tükrözhetik a növényevő stratégiákkal szembeni konstitutív és indukálható növényi védekezéssel kapcsolatos fiziológiai egyensúlyt is, mivel a két faj gyakran negatív korrelációban áll egymással (24). Bár előnyös lehet folyamatosan fenntartani egy jó védekezőképességet, a védekezéssel összefüggő időben bekövetkező anyagcsere-változások egyértelmű előnyökkel járnak, mivel lehetővé teszik a növények számára, hogy értékes erőforrásokat más fiziológiai beruházásokra fordítsanak (19, 24), és elkerüljék a szimbiózis szükségességét. Járulékos károk (25). Ezenkívül a rovarnövényevők által okozott specializált metabolitok átszerveződései destruktív eloszláshoz vezethetnek a populációban (26), és tükrözhetik a jázmonsav (JA) jel jelentős természetes változásainak közvetlen leolvasásait, amelyek fennmaradhatnak a populációban. A magas és alacsony JA-jelek kompromisszumok a növényevők elleni védekezés és az egyes fajokkal való versengés között (27). Ezenkívül a specializált metabolit bioszintézis útvonalak gyorsan elvesznek és átalakulnak az evolúció során, ami a szorosan rokon fajok között foltos anyagcsere-eloszlást eredményez (28). Ezek a polimorfizmusok gyorsan kialakulhatnak a változó növényevő mintákra válaszul (29), ami azt jelenti, hogy a növényevő közösségek fluktuációja kulcsfontosságú tényező az anyagcsere-heterogenitásban.
Itt konkrétan a következő problémákat oldottuk meg. (I) Hogyan alakítja át a növényevő rovar a növényi metabolomot? (Ii) Melyek a metabolikus plaszticitás fő információs összetevői, amelyek számszerűsíthetők a hosszú távú védekezési elméletek jóslatainak tesztelésére? (Iii) Vajon a növényi metabolomot a támadóra jellemző módon kell-e átprogramozni, és ha igen, milyen szerepet játszik a növényi hormon egy specifikus metabolikus válasz szabásában, és mely metabolitok járulnak hozzá a védekezés fajspecifikusságához? (Iv) Mivel számos védekezési elmélet által tett jóslatok kiterjeszthetők a biológiai szövetek minden szintjére, azt a kérdést tettük fel, hogy mennyire konzisztens a belső összehasonlítástól a fajok közötti összehasonlításig az okozott metabolikus válasz? Ennek érdekében szisztematikusan tanulmányoztuk a dohánynikotin levélmetabolomját, amely egy gazdag, specializált anyagcseréjű ökológiai modellnövény, és hatékony két őshonos növényevő, a Lepidoptera Datura (Ms) (nagyon agresszív, főként fogyasztott) lárvái ellen. A Solanaceae és a Spodoptera littoralis (Sl) növényeken a gyapotlevél-férgek egyfajta „nemzetséget” alkotnak, a burgonyafélék és más nemzetségek és családok (növényi táplálék) gazdanövényeivel. Elemeztük az MS/MS metabolomikai spektrumot, és kinyertük az információelméleti statisztikai leírókat az OD és MT elméletek összehasonlítására. Specificitási térképeket készítettünk a főbb metabolitok azonosságának feltárására. Az elemzést kiterjesztettük az N. nasi őshonos populációjára és a szorosan rokon dohányfajokra, hogy tovább elemezzük a növényi hormonjelzés és az OD indukció közötti kovarianciát.
Annak érdekében, hogy átfogó térképet készítsünk a növényevő dohány levélmetabolomjának plaszticitásáról és szerkezetéről, egy korábban kidolgozott elemzési és számítási munkafolyamatot használtunk a növényi kivonatokból származó nagy felbontású, adatfüggetlen MS/MS spektrumok átfogó gyűjtésére és dekonvolúciójára (9). Ez a differenciálatlan módszer (MS/MS-nek nevezik) nem redundáns vegyületspektrumokat képes létrehozni, amelyek aztán az itt leírt összes vegyületszintű elemzéshez felhasználhatók. Ezek a dekonvolúcióval kapott növényi metabolitok különféle típusúak, több száztól több ezer metabolitig terjednek (itt körülbelül 500-1000 s/MS/MS). Itt az információelmélet keretében vizsgáljuk a metabolikus plaszticitást, és a metabolikus gyakorisági eloszlás Shannon-entrópiája alapján számszerűsítjük a metabolom diverzitását és professzionalizmusát. A korábban implementált képlet (8) segítségével kiszámítottunk egy olyan indikátorkészletet, amely felhasználható a metabolom diverzitásának (Hj indikátor), a metabolikus profil specializációjának (δj indikátor) és az egyes metabolitok metabolikus specificitásának (Si indikátor) számszerűsítésére. Ezenkívül a relatív távolság plaszticitási indexét (RDPI) alkalmaztuk a növényevők metabolitjainak indukálhatóságának számszerűsítésére (1A. ábra) (30). Ezen statisztikai keretrendszeren belül az MS/MS spektrumot kezeljük alapvető információegységként, és az MS/MS relatív abunciáját egy frekvenciaeloszlási térképpé dolgozzuk fel, majd a Shannon-entrópiát használjuk a metabolitjainak diverzitásának becslésére. A metabolitjainak specializációját egyetlen MS/MS spektrum átlagos specificitása méri. Ezért egyes MS/MS osztályok abundanciájának növekedése a herbivor indukció után spektrális inducibilitássá, RDPI-vé és specializációvá alakul, azaz a δj index növekedésévé, mivel több specializált metabolit keletkezik, és magas Si index keletkezik. A Hj diverzitási index csökkenése azt tükrözi, hogy vagy a keletkezett MS/MS száma csökken, vagy a profilfrekvencia-eloszlás kevésbé egyenletes irányba változik, miközben csökkenti annak általános bizonytalanságát. Az Si index kiszámításán keresztül kiemelhető, hogy mely MS/MS-eket indukálják bizonyos növényevők, és melyek nem reagálnak az indukcióra, ami kulcsfontosságú mutató az MT és OD predikció megkülönböztetésében.
(A) Statisztikai leírók a növényevő (H1-től Hx-ig) MS/MS adatindukció (RDPI), diverzitás (Hj index), specializáció (δj index) és metabolitspecificitás (Si index) meghatározására. A specializáció mértékének növekedése (δj) azt jelzi, hogy átlagosan több növényevő specifikus metabolit termelődik, míg a diverzitás csökkenése (Hj) a metabolitok termelésének csökkenését vagy a metabolitok egyenetlen eloszlását jelzi az eloszlási térképen. Az Si érték azt méri fel, hogy a metabolit egy adott körülményre (itt növényevő) specifikus-e, vagy fordítva, ugyanazon a szinten marad. (B) A védekezési elmélet predikciójának fogalmi diagramja az információelméleti tengely segítségével. Az OD elmélet azt jósolja, hogy a növényevők támadása növeli a védekezési metabolitokat, ezáltal növeli a δj-t. Ugyanakkor a Hj csökken, mert a profil a metabolikus információk bizonytalanságának csökkenése felé szerveződik át. Az MT elmélet azt jósolja, hogy a növényevők támadása nem irányított változásokat okoz a metabolomban, ezáltal növeli a Hj-t, mint a megnövekedett metabolikus információ bizonytalanságának indikátorát, és a Si véletlenszerű eloszlását okozza. Javasoltunk egy vegyes modellt is, a legjobb MT-t, amelyben egyes, magasabb védekező értékű metabolitok mennyisége különösen megnő (magas Si-érték), míg mások véletlenszerű válaszreakciókat mutatnak (alacsonyabb Si-érték).
Információelméleti leírók segítségével az OD-elméletet úgy értelmezzük, hogy azt jósoljuk, a növényevők által indukált speciális metabolitváltozások egy nem indukált konstitutív állapotban (i) a metabolikus specificitás (Si-index) növekedéséhez vezetnek, ami a metabonomikus specificitást (δj index) hajtja (bizonyos, magasabb védekező értékű speciális metabolitcsoportok növekedése), és (ii) a metabolom diverzitásának (Hj index) csökkenéséhez a metabolikus frekvencia eloszlásának a leptin test eloszlás felé történő változása miatt. Egyetlen metabolit szintjén rendezett Si-eloszlás várható, ahol a metabolit a védekező értékének megfelelően növeli a Si-értéket (1B. ábra). Ezzel összhangban az MT-elméletet úgy értelmezzük, hogy azt jósoljuk, hogy a gerjesztés (i) a metabolitok nem irányított változásaihoz vezet, ami a δj index csökkenését eredményezi, és (ii) a Hj-index növekedéséhez a metabolikus bizonytalanság növekedése miatt. Vagy véletlenszerűség, amelyet a Shannon-entrópia számszerűsíthet általánosított diverzitás formájában. Ami az anyagcsere-összetételt illeti, az MT-elmélet a Si véletlenszerű eloszlását jósolja. Figyelembe véve, hogy bizonyos metabolitok specifikus körülmények között, specifikus körülmények között vannak jelen, míg mások nem, és védekező értékük a környezettől függ, egy vegyes védekező modellt is javasoltunk, amelyben δj és Hj kétfelé oszlanak el a Si mentén. Minden irányban növekszik, csak bizonyos metabolitcsoportok, amelyek magasabb védekező értékkel rendelkeznek, növelik különösen a Si-t, míg mások véletlenszerű eloszlásúak lesznek (1B. ábra).
Az információelméleti leíró tengelyén újradefiniált védekezési elmélet predikciójának tesztelésére szakértői (Ms) vagy generalista (Sl) növényevő lárvákat neveltünk a Nepenthes pallens levelein (2A. ábra). MS/MS analízis segítségével 599 nem redundáns MS/MS spektrumot (S1 adatfájl) nyertünk ki hernyóetetés után gyűjtött levélszövet metanolos kivonataiból. Az RDPI, Hj és δj indexek használata az MS/MS konfigurációs fájlokban található információtartalom átrendeződésének vizualizálására érdekes mintázatokat tár fel (2B. ábra). Az általános tendencia az, hogy – ahogy az információleíró is leírja –, ahogy a hernyók folytatják a levelek fogyasztását, az anyagcsere-reorganizáció mértéke idővel növekszik: 72 órával a növényevő evése után az RDPI jelentősen megnő. A sértetlen kontrollhoz képest a Hj szignifikánsan csökkent, ami az anyagcsere-profil megnövekedett specializációjának köszönhető, amelyet a δj index számszerűsített. Ez a látszólagos tendencia összhangban van az OD-elmélet jóslataival, de ellentmond az MT-elmélet főbb jóslatainak, amelyek szerint a metabolitszintek véletlenszerű (nem irányított) változásai védekező álcázásként szolgálnak (1B. ábra). Bár a két növényevő orális szekréciójának (OS) elicitor-tartalma és táplálkozási viselkedése eltérő, közvetlen táplálkozásuk hasonló változásokat eredményezett a Hj és δj irányában a 24 és 72 órás betakarítási időszakok alatt. Az egyetlen különbség az RDPI 72. órájában jelentkezett. Az Ms etetés által okozotthoz képest az Sl etetés által indukált teljes anyagcsere magasabb volt.
(A) Kísérleti terv: a közönséges sertés (S1) vagy szakértő (Ms) növényevőket kancsóka sótalanított leveleivel etetik, míg a szimulált növényevéshez az Ms (W + OSM) OS-ét használják a szabványosított levélpozíciók szúrásának kezelésére. S1 (W + OSSl) lárvák vagy víz (W + W). A kontroll (C) egy sértetlen levél. (B) Az indukálhatóság (RDPI a kontrollkártyához képest), a diverzitás (Hj index) és a specializáció (δj index) indexét a speciális metabolittérképre (599 MS/MS; S1 adatfájl) számították ki. A csillagok a közvetlen növényevő etetés és a kontrollcsoport közötti szignifikáns különbségeket jelzik (Student-féle t-próba párosított t-próbával, *P<0,05 és ***P<0,001). ns, nem fontos. (C) A fő (kék doboz, aminosav, szerves sav és cukor; S2 adatfájl) és a speciális metabolit spektrum (piros doboz 443 MS/MS; S1 adatfájl) időfelbontási indexe szimulált növényevő kezelés után. A színes sáv a 95%-os konfidencia intervallumot jelöli. A csillag a kezelés és a kontroll közötti szignifikáns különbséget jelzi [kvadratikus varianciaanalízis (ANOVA), majd a Tukey-féle őszintén szignifikáns különbség (HSD) a post hoc többszörös összehasonlításokhoz, *P<0,05, **P<0,01 és *** P <0,001]. (D) A szóródási diagramok és a speciális metabolit profilok specializációja (ismételt minták különböző kezelésekkel).
Annak vizsgálatára, hogy a növényevők által kiváltott metabolomszintű átrendeződés tükröződik-e az egyes metabolitok szintjének változásaiban, először a korábban a bizonyítottan növényevő rezisztens Nepenthes pallens leveleiben vizsgált metabolitokra összpontosítottunk. A fenol-amidok hidroxi-cinnamamid-poliamin konjugátumok, amelyek felhalmozódnak a rovarok növényevő folyamata során, és amelyekről ismert, hogy csökkentik a rovarok teljesítményét (32). Megkerestük a megfelelő MS/MS prekurzorait, és ábrázoltuk kumulatív kinetikai görbéiket (S1. ábra). Nem meglepő módon a növényevők elleni védekezésben közvetlenül nem részt vevő fenolszármazékok, mint például a klorogénsav (CGA) és a rutin, a növényevő állatoknál csökkennek. Ezzel szemben a növényevők a fenol-amidokat rendkívül hatékonysá tehetik. A két növényevő folyamatos táplálkozása a fenol-amidok szinte azonos gerjesztési spektrumát eredményezte, és ez a minta különösen szembetűnő volt a fenol-amidok de novo szintézise esetében. Ugyanez a jelenség figyelhető meg a 17-hidroxigeranil-nonándiol-diterpén glikozidok (17-HGL-DTG) útvonalának vizsgálatakor, amely nagyszámú, hatékony herbivorellenes funkciókkal rendelkező aciklusos diterpént termel (33), amelyek közül az Ms Sl-lel történő táplálása hasonló expressziós profilt váltott ki (S1. ábra)).
A közvetlen növényevő táplálkozási kísérletek lehetséges hátránya a növényevők levélfogyasztási sebességének és táplálkozási idejének különbsége, ami megnehezíti a sebek és a növényevők által okozott növényevő-specifikus hatások kiküszöbölését. Annak érdekében, hogy jobban megoldjuk az indukált levélanyagcsere-válasz növényevő fajspecificitását, az Ms és Sl lárvák táplálkozását úgy szimuláltuk, hogy a frissen gyűjtött OS-t (OSM és OSS1) azonnal alkalmaztuk a konzisztens levélpozíciók standard W punkciójára. Ezt az eljárást W + OS kezelésnek nevezik, és szabványosítja az indukciót azáltal, hogy pontosan időzíti a növényevő által kiváltott válasz kezdetét anélkül, hogy a szövetveszteség sebességében vagy mennyiségében mutatkozó különbségek zavaró hatásait okozná (2A. ábra) (34). Az MS/MS elemzési és számítási folyamatsor segítségével 443 MS/MS spektrumot nyertünk ki (S1 adatfájl), amelyek átfedésben voltak a korábban közvetlen táplálkozási kísérletekből összeállított spektrumokkal. Ezen MS/MS adatkészlet információelméleti elemzése kimutatta, hogy a levélre specializálódott metabolomok átprogramozása növényevők szimulációjával OS-specifikus indukálásokat mutatott (2C. ábra). Különösen az OSS1 kezeléshez képest az OSM a metabolom specializációjának fokozódását okozta 4 óra elteltével. Érdemes megjegyezni, hogy a közvetlen növényevő táplálkozási kísérleti adathalmazhoz képest a Hj és δj koordinátákkal kétdimenziós térben vizualizált metabolikus kinetika, valamint a metabolom specializációjának irányultsága a szimulált növényevő kezelésre adott válaszként az idő múlásával konzisztens növekedést mutatott (2D. ábra). Ugyanakkor számszerűsítettük az aminosavak, szerves savak és cukrok tartalmát (S2. adatfájl), hogy megvizsgáljuk, hogy ez a célzott metabolom szakértelem-növekedés a központi szén-anyagcsere átkonfigurációjának köszönhető-e a szimulált növényevőkre adott válaszként (S2. ábra). Ennek a mintázatnak a jobb magyarázata érdekében tovább monitoroztuk a korábban tárgyalt fenolamid és 17-HGL-DTG útvonalak metabolikus felhalmozódási kinetikáját. A növényevők OS-specifikus indukciója a fenolamid-anyagcserén belüli differenciális átrendeződési mintázattá alakul át (S3. ábra). A kumarin és koffeoil részeket tartalmazó fenolos amidokat elsősorban az OSS1 indukálja, míg az OSM-ek a ferulil konjugátumok specifikus indukcióját váltják ki. A 17-HGL-DTG útvonal esetében a malonilezési és dimalonilezési termékek által kiváltott differenciális OS indukciót észlelték (S3. ábra).
Ezután az OS által kiváltott transzkriptom plaszticitást vizsgáltuk időfüggvényű microarray adatkészlet segítségével, amely szimulálja az OSM-ek használatát a rozetta növények leveleinek kezelésére növényevőkben. A mintavételi kinetika alapvetően átfedésben van a jelen metabolomikai vizsgálatban használt kinetikával (35). A metabolom rekonfigurációjához képest, amelyben a metabolikus plaszticitás különösen idővel növekszik, az Ms által indukált tranziens transzkripciós kitöréseket figyeltünk meg a levelekben, ahol a transzkriptom indukcióképessége (RDPI) és specializációja (δj) 1-en van. Jelentős növekedés volt megfigyelhető az órákban, és a diverzitásban (Hj) ebben az időpontban, a BMP1 expressziója szignifikánsan csökkent, majd a transzkriptom specializációja ellazult (S4. ábra). A metabolikus géncsaládok (mint például a P450, a glikoziltranszferáz és a BAHD aciltranszferáz) részt vesznek a speciális metabolitok összeállításának folyamatában az elsődleges anyagcseréből származó szerkezeti egységekből, a fent említett korai magas specializációs modellt követve. Esettanulmányként a fenilalanin útvonalat elemeztük. Az elemzés megerősítette, hogy a fenolamid-anyagcserében részt vevő maggének nagymértékben OS-indukáltak a növényevőkben a nem vonzott növényekhez képest, és expressziós mintázataik szorosan illeszkednek egymáshoz. Az MYB8 transzkripciós faktor, valamint a PAL1, PAL2, C4H és 4CL strukturális gének ezen útvonal felső szakaszában a transzkripció korai iniciációját mutatták. Az aciltranszferázok, amelyek szerepet játszanak a fenolamid végső összeszerelésében, mint például az AT1, DH29 és CV86, elnyújtott upregulációs mintázatot mutatnak (S4. ábra). A fenti megfigyelések azt jelzik, hogy a transzkriptom specializációjának korai iniciációja és a metabolomikai specializáció későbbi fokozódása kapcsolt módot mutat, ami a szinkron szabályozórendszernek köszönhető, amely egy erőteljes védekező választ indít el.
A növényi hormonok jelátvitelének átkonfigurációja szabályozó rétegként működik, amely integrálja a növényevő információkat a növények fiziológiájának újraprogramozásához. A növényevő szimuláció után megmértük a kulcsfontosságú növényi hormonkategóriák kumulatív dinamikáját, és vizualizáltuk az időbeli koexpressziójukat közöttük [Pearson korrelációs együttható (PCC) > 0,4] (3A. ábra). A várakozásoknak megfelelően a bioszintézishez kapcsolódó növényi hormonok összekapcsolódnak a növényi hormonok koexpressziós hálózatán belül. Ezenkívül a metabolikus specificitást (Si index) is ehhez a hálózathoz rendeltük, hogy kiemeljük a különböző kezelések által indukált növényi hormonokat. A növényevő specifikus válasz két fő területét rajzoltuk ki: az egyik a JA klaszterben található, ahol a JA (biológiailag aktív formája, a JA-Ile) és más JA-származékok mutatják a legmagasabb Si pontszámot; a másik az etilén (ET). A gibberellin csak mérsékelt növekedést mutatott a növényevő specificitásban, míg más növényi hormonok, például a citokinin, az auxin és az abszcizinsav alacsony indukciós specificitással rendelkeztek a növényevők esetében. A W + W önmagában történő alkalmazásával összehasonlítva a JA-származékok csúcsértékének OS alkalmazáson keresztüli amplifikációja (W + OS) alapvetően a JA-k erős specifikus indikátorává alakítható. Váratlan módon a különböző elicitor-tartalmú OSM és OSS1 hasonló JA- és JA-Ile-felhalmozódást okoznak. Az OSS1-gyel ellentétben az OSM-et specifikusan és erősen indukálják az OSM-ek, míg az OSS1 nem erősíti fel a bazális sebek válaszát (3B. ábra).
(A) Koexpressziós hálózatanalízis a növényevők által indukált növényi hormon felhalmozódási kinetika szimulációjának PCC számításán alapul. A csomópont egyetlen növényi hormont jelöl, a csomópont mérete pedig a növényi hormonra specifikus Si indexet jelöli a kezelések között. (B) A JA, JA-Ile és ET felhalmozódása a levelekben a különböző kezelések hatására, különböző színekkel jelölve: sárgabarack, W + OSM; kék, W + OSSl; fekete, W + W; szürke, C (kontroll). A csillagok a kezelés és a kontroll közötti szignifikáns különbségeket jelzik (kétutas ANOVA, majd Tukey HSD post hoc többszörös összehasonlítás, *** P <0,001). Az (C)697 MS/MS (S1 adatfájl) információelméleti elemzése JA bioszintézisben és károsodott észlelési spektrumban (irAOC és irCOI1), valamint az (D)585 MS/MS (S1 adatfájl) információelméleti elemzése ETR1-ben károsodott ET jellel Két szimulált növényevő kezelés aktiválta a növényi vonalakat és üres vivőanyaggal (EV) kezelt kontrollnövényeket. A csillagok a W+OS kezelés és a sértetlen kontroll közötti szignifikáns különbségeket jelzik (kétutas ANOVA, majd Tukey HSD post hoc többszörös összehasonlítás, *P<0,05, **P<0,01 és ***P<0,001). (E) A specializációval szembeni szórt ellenállást ábrázoló szórt grafikonok. A színek a különböző genetikailag módosított törzseket jelölik; a szimbólumok a különböző kezelési módszereket jelölik: háromszög, W + OSS1; téglalap, W + OSM; C kör
Ezután egy genetikailag módosított, attenuált Nepenthes törzset (irCOI1 és sETR1) használunk a JA és ET bioszintézis (irAOC és irACO) és az érzékelés (irCOI1 és sETR1) kulcslépéseiben, hogy elemezzük e két növényi hormon anyagcseréjét növényevőkön. Az átprogramozás relatív hozzájárulása. A korábbi kísérletekkel összhangban megerősítettük a herbivore-OS indukcióját az üres hordozó (EV) növényekben (3. ábra, C-D), valamint az OSM által okozott Hj index általános csökkenését, míg a δj index nőtt. A válasz kifejezettebb, mint az OSS1 által kiváltott válasz. A Hj és δj koordinátáit használó kétvonalas grafikon a specifikus deregulációt mutatja (3E. ábra). A legnyilvánvalóbb tendencia az, hogy a JA jel nélküli törzsekben a növényevők által okozott metabolom-diverzitás és specializációs változások szinte teljesen megszűnnek (3C. ábra). Ezzel szemben az sETR1 növényekben a csendes ET-észlelés, bár a növényevő anyagcsere változásaira gyakorolt ​​összességében jóval alacsonyabb hatást gyakorol, mint a JA-jelátvitelé, csökkenti a Hj és δj indexek különbségét az OSM és az OSS1 gerjesztések között (3D. ábra és S5. ábra). Ez azt jelzi, hogy a JA-jelátvitel alapvető funkciója mellett az ET-jelátvitel a növényevők fajspecifikus metabolikus válaszának finomhangolását is szolgálja. Ezzel a finomhangoló funkcióval összhangban az sETR1 növényekben nem történt változás a metabolomok teljes indukálhatóságában. Másrészt az sETR1 növényekkel összehasonlítva az irACO növények hasonló összességében amplitúdójú metabolikus változásokat indukáltak a növényevők által, de szignifikánsan eltérő Hj és δj pontszámokat mutattak az OSM és az OSS1 kihívások között (S5. ábra).
A növényevők fajspecifikus válaszreakciójához fontos mértékben hozzájáruló specializált metabolitok azonosítása és termelésük ET-jelek segítségével történő finomhangolása érdekében a korábban kidolgozott strukturális MS/MS módszert alkalmaztuk. Ez a módszer a bi-klaszterezési módszerre támaszkodik, hogy az MS/MS fragmensekből [normalizált skaláris szorzat (NDP)] és a semleges veszteségen (NL) alapuló hasonlósági pontszámból újra kikövetkeztesse a metabolikus családot. Az ET transzgénikus vonalak elemzésével létrehozott MS/MS adatkészlet 585 MS/MS-t eredményezett (S1 adatfájl), amelyeket hét fő MS/MS modulba (M) csoportosítással bontottunk fel (4A. ábra). Ezen modulok némelyike ​​sűrűn van tele korábban jellemzett speciális metabolitokkal: például az M1, M2, M3, M4 és M7 gazdag különféle fenolszármazékokban (M1), flavonoid glikozidokban (M2), acilcukrokban (M3 és M4) és 17-HGL-DTG-ben (M7). Ezenkívül kiszámításra kerül az egyes modulokban található egyetlen metabolit metabolikus specifikus információja (Si index), és annak Si eloszlása ​​intuitív módon látható. Röviden, a magas herbivory és genotípus specificitást mutató MS/MS spektrumokat magas Si értékek jellemzik, és a kurtosis statisztikák a szőrzet eloszlását jelzik a jobb farok sarkán. Egy ilyen sovány kolloid eloszlást detektáltak az M1-ben, amelyben a fenol-amid mutatta a legmagasabb Si-frakciót (4B. ábra). A korábban említett herbivory indukálható 17-HGL-DTG az M7-ben mérsékelt Si-pontszámot mutatott, ami a két OS-típus közötti mérsékelt eltérő szabályozásra utal. Ezzel szemben a legtöbb konstitutívan termelt specializált metabolit, mint például a rutin, a CGA és az acilcukrok, a legalacsonyabb Si-pontszámúak közé tartoznak. A speciális metabolitok szerkezeti komplexitásának és Si-eloszlásának jobb feltárása érdekében minden modulhoz molekuláris hálózatot hoztak létre (4B. ábra). Az OD-elmélet egyik fontos jóslata (az 1B. ábrán összefoglalva) az, hogy a speciális metabolitok átszerveződése a növényevők után egyirányú változásokhoz vezet a nagy védekező értékű metabolitokban, különösen a specificitásuk növelésével (szemben a véletlenszerű eloszlással) (módus). A védekező metabolit, amelyet az MT-elmélet jósolt. Az M1-ben felhalmozódott fenolszármazékok többsége funkcionálisan összefügg a rovarok teljesítményének csökkenésével (32). Amikor összehasonlítottuk az M1 metabolitok Si-értékeit az indukált levelek és az EV kontroll növények alkotó levelei között 24 óra elteltével, azt figyeltük meg, hogy számos metabolit metabolikus specificitása a növényevő rovarok után jelentősen növekvő tendenciát mutat (4C. ábra). A Si-érték fajlagos növekedését csak a védekező fenolamidokban észleltük, de a modulban egyidejűleg jelen lévő más fenolokban és ismeretlen metabolitokban nem észleltünk Si-érték növekedést. Ez egy specializált modell, amely az OD-elmélethez kapcsolódik. A növényevők által okozott metabolikus változások főbb jóslatai konzisztensek. Annak tesztelésére, hogy a fenolamid-spektrum ezen sajátosságát az OS-specifikus ET indukálja-e, ábrázoltuk a Si metabolit indexét, és differenciális expressziós értéket kaptunk az OSM és az OSS1 között az EV és az sETR1 genotípusokban (4D. ábra). Az sETR1 esetében a fenamid által kiváltott különbség az OSM és az OSS1 között nagymértékben csökkent. A bi-klaszterezési módszert olyan MS/MS adatokra is alkalmaztuk, amelyeket olyan törzsekből gyűjtöttünk, amelyekben nem volt elegendő JA ahhoz, hogy következtetni lehessen a JA által szabályozott metabolikus specializációhoz kapcsolódó fő MS/MS modulokra (S6. ábra).
(A) Az 585 MS/MS klaszterezési eredményei a közös fragmens (NDP hasonlóság) és a közös neutrális veszteség (NL hasonlóság) alapján azt eredményezik, hogy a modul (M) összhangban van az ismert vegyületcsaláddal, vagy ismeretlen vagy rosszul metabolizált metabolit-összetétellel. Minden modul mellett a metabolit (MS/MS) specifikus (Si) eloszlása ​​látható. (B) Moduláris molekuláris hálózat: A csomópontok az MS/MS-t és az éleket, az NDP (piros) és NL (kék) MS/MS pontszámokat (határérték, > 0,6) jelölik. A fokozatos metabolitspecificitási index (Si) a modul alapján színezve (balra) és a molekuláris hálózathoz rendelve (jobbra). (C) Az EV növény M1 modulja konstitutív (kontroll) és indukált állapotban (szimulált növényevő) 24 óra elteltével: molekuláris hálózati diagram (a Si érték a csomópont mérete, a védekező fenolamid kékkel van kiemelve). (D) Az sETR1 spektrumvonal M1 molekuláris hálózati diagramja károsodott EV és ET érzékeléssel: a zöld kör csomópont által jelölt fenolos vegyület, és a W + OSM és W + OSS1 kezelések közötti szignifikáns különbség (P-érték) a csomópont méretének függvényében. CP, N-koffeoil-tirozin; CS, N-koffeoil-spermidin; FP, N-ferulinsav-észter-húgysav; FS, N-ferulil-spermidin; CoP, N', N“-kumarolil-tirozin; DCS, N', N”-dikaffeoil-spermidin; CFS, N', N”-koffeoil, feruloil-spermidin; Lycium barbarum (farkasbogyó Sonban); Nick. O-AS, O-acilcukor.
Tovább kiterjesztettük az elemzést egyetlen attenuált Nepenthes genotípusról a természetes populációkra, ahol korábban már leírtak erős fajon belüli változásokat a növényevő JA-szintekben és a specifikus metabolitszintekben természetes populációkban (26). Ezt az adathalmazt 43 csíraplazma lefedésére használjuk. Ezek a csíraplazmák az N. pallens 123 növényfajából állnak. Ezeket a növényeket Utah, Nevada, Arizona és Kalifornia különböző őshonos élőhelyein gyűjtött magokból vettük (S7. ábra), kiszámítottuk a metabolom diverzitását (itt populációs szintnek nevezzük) (β diverzitás) és az OSM által okozott specializációt. A korábbi vizsgálatokkal összhangban a Hj és δj tengelyek mentén a metabolikus változások széles skáláját figyeltük meg, ami azt jelzi, hogy a csíraplazmák jelentős különbségeket mutatnak a növényevőkre adott metabolikus válaszaik plaszticitásában (S7. ábra). Ez a szerveződés emlékeztet a növényevők által okozott JA-változások dinamikus tartományával kapcsolatos korábbi megfigyelésekre, és egyetlen populációban is nagyon magas értéket tartott fenn (26, 36). A JA és JA-Ile segítségével teszteltük a Hj és δj közötti általános szintű korrelációt, és azt találtuk, hogy szignifikáns pozitív korreláció van a JA és a metabolom β diverzitási és specializációs indexe között (S7. ábra). Ez arra utal, hogy a populációs szinten kimutatott, növényevők által kiváltott heterogenitás a rovarnövényevőkből való szelekció által okozott kulcsfontosságú metabolikus polimorfizmusoknak tudható be.
Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a dohányfajták típusukban és az indukált, valamint konstitutív metabolikus védekezéstől való relatív függőségükben nagymértékben különböznek. Úgy vélik, hogy ezeket a változásokat a növényevő ellenes jelátvitelben és a védekező képességekben a rovarpopuláció nyomása, a növény életciklusa és a védekező termelési költségek szabályozzák abban a résben, ahol egy adott faj nő. Hat, Észak- és Dél-Amerikában őshonos Nicotiana faj növényevői által indukált levélmetabolom-átalakulás következetességét vizsgáltuk. Ezek a fajok szoros rokonságban állnak a Nepenthes North America fajokkal, nevezetesen a Nicolas Bociflo. La, az N. nicotinis, a Nicotiana n. attenuated grass, a Nicotiana tabacum, a lineáris dohány, a dohány (Nicotiana spegazzinii) és a dohánylevél dohány (Nicotiana obtusifolia) (5A. ábra) (37). Ezen fajok közül hat, köztük a jól jellemzett N. please faj, a petúnia klád egynyári növénye, az obtusifolia N. pedig a Trigonophyllae testvérklád évelő növénye (38). Ezt követően W + W, W + OSM és W + OSS1 indukciót végeztek ezen a hét fajon a rovarok táplálkozásának fajszintű metabolikus átrendeződésének vizsgálata céljából.
(A) Maximum likelihood alapú bootstrap filogenetikai fa [a nukleáris glutamin szintézisre (38)] és hét közeli rokon Nicotiana faj földrajzi eloszlása ​​(különböző színek) (37). (B) Hét Nicotiana faj metabolikus profiljának specializált diverzitását ábrázoló szóródási diagram (939 MS/MS; S1 adatfájl). Fajszinten a metabolom diverzitása negatív korrelációt mutat a specializáció mértékével. A metabolikus diverzitás és a specializáció, valamint a JA felhalmozódása közötti fajszintű korreláció elemzését a 2. ábra mutatja. S9. Szín, különböző típusok; háromszög, W + OSS1; téglalap, W + OSM; (C) A Nicotiana JA és JA-Ile dinamikáját az OS gerjesztési amplitúdója szerint rangsoroltuk (kétutas ANOVA és Tukey HSD többszörös összehasonlítás után, * P <0,05, ** P <0,01 és * ** A W + OS és a W + W összehasonlítására, P <0,001). Az egyes fajok (D) diverzitásának és (E) specializációjának dobozdiagramja a növényevő és metil JA (MeJA) szimulációja után. A csillag a W + OS és a W + W vagy lanolin plusz W (Lan + W) vagy Lan plusz MeJA (Lan + MeJa) és a Lan kontroll közötti szignifikáns különbséget jelzi (kétutas varianciaanalízis, majd Tukey-féle HSD post hoc többszörös összehasonlítás, *P<0,05, **P<0,01 és ***P<0,001).
A kettős klaszter módszerrel 9 modult azonosítottunk, összesen 939 MS/MS-sel (S1 adatfájl). A különböző kezelések által átkonfigurált MS/MS összetétele nagymértékben eltér a fajok közötti modulok között (S8. ábra). A Hj (erre itt fajszintű γ-diverzitásként hivatkozunk) és a δj vizualizálása azt mutatja, hogy a különböző fajok nagyon különböző csoportokba aggregálódnak az anyagcsere-térben, ahol a fajszintű megosztottság általában hangsúlyosabb, mint a gerjesztés. Az N. linear és az N. obliquus kivételével ezek az indukciós hatások széles dinamikus tartományát mutatják (5B. ábra). Ezzel szemben az olyan fajok, mint az N. purpurea és az N. obtusifolia, kevésbé nyilvánvaló metabolikus választ adnak a kezelésre, de a metabolom diverzitása változatosabb. Az indukált metabolikus válasz fajspecifikus eloszlása ​​szignifikáns negatív korrelációt eredményezett a specializáció és a gamma-diverzitás között (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Az OS által kiváltott JA-szintek változásai pozitív korrelációt mutatnak a metabolom specializációjával, és negatív korrelációt az egyes fajok által mutatott metabolikus gamma-diverzitással (5B. ábra és S9. ábra). Érdemes megjegyezni, hogy az 5C. ábrán köznyelven „jelre reagáló” fajoknak nevezett fajok, mint például a Nepenthes fonálférgek, a Nepenthes nepenthes, a Nepenthes acute és a Nepenthes attenuált, 30 perc elteltével jelentős tüneteket okoztak. A közelmúltbeli OS-specifikus JA és JA-Ile járványok, míg más, „jelre nem reagálónak” nevezett baktériumok, mint például a Nepenthes mills, a Nepenthes powdery és az N. obtusifolia, csak JA-Ile Edge indukciót mutatnak OS-specificitás nélkül (5C. ábra). Az anyagcsere szintjén, amint azt fentebb említettük, a attenuált Nepenthes esetében a jelre reagáló anyagok OS-specificitást mutattak, és jelentősen megnövelték a δj értéket, miközben csökkentették a Hj értéket. Ezt az OS-specifikus priming hatást nem észlelték a jelre nem reagáló fajként besorolt ​​fajoknál (5. ábra, D és E). Az OS-specifikus metabolitok gyakrabban oszlanak meg a jelre reagáló fajok között, és ezek a jelcsoportok a gyengébb jelválaszú fajokkal csoportosulnak, míg a gyengébb jelválaszú fajok kisebb kölcsönös függőséget mutatnak (S8. ábra). Ez az eredmény azt jelzi, hogy a JA-k OS-specifikus indukciója és a downstream metabolom OS-specifikus átkonfigurációja faji szinten összekapcsolódik.
Ezután metil-JA-t (MeJA) tartalmazó lanolinpasztát használtunk növények kezelésére, hogy megvizsgáljuk, vajon ezeket a kapcsolási módokat korlátozza-e az exogén JA által alkalmazott JA elérhetősége, amely a növények citoplazmájában lesz. A gyors deészterifikáció JA. Ugyanezt a tendenciát tapasztaltuk, miszerint a JA folyamatos ellátása fokozatos átmenetet eredményezett a jelre reagáló fajoktól a jelre nem reagáló fajokig (5. ábra, D és E). Röviden, a MeJA kezelés erősen átprogramozta a lineáris fonálférgek, az N. obliquus, az N. aquaticus, az N. pallens és az N. mikimotoi metabolomjait, ami a δj jelentős növekedését és a Hj csökkenését eredményezte. Az N. purpurea csak a δj növekedését mutatta, a Hj csökkenését nem. Az N. obtusifolia, amelyről korábban kimutatták, hogy rendkívül alacsony JA-szintet halmoz fel, szintén rosszul reagál a MeJA kezelésre a metabolom-rekonfiguráció tekintetében. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a JA-termelés vagy a jelátvitel fiziológiailag korlátozott a jelre nem reagáló fajoknál. A hipotézis tesztelésére négy fajt (N. pallens, N. mills, N. pink és N. microphylla) vizsgáltunk, melyeket W + W, W + OSM-ek és W + OSS1 transzkriptom indukált (39). A metabolom átépülésének mintázatával összhangban a fajok jól elkülönülnek a transzkriptom térben, amelyek közül az N. attenuated mutatta a legmagasabb OS-indukált RDPI-t, míg az N. gracilis a legalacsonyabbat (6A. ábra). Azt tapasztaltuk azonban, hogy az N. oblonga által indukált transzkriptom diverzitás volt a legalacsonyabb a négy faj között, ellentétben az N. oblonga korábban hét fajnál kimutatott legmagasabb metabonomikus diverzitásával. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a korai védekező jelekkel, beleértve a JA jeleket is, kapcsolatos gének egy csoportja magyarázza a növényevőkkel kapcsolatos elicitorok által kiváltott korai védekező válaszok specificitását a Nicotiana fajokban (39). A JA jelátviteli útvonalak összehasonlítása e négy faj között érdekes mintázatot tárt fel (6B. ábra). Az ebben az útvonalban található gén többsége, mint például az AOC, OPR3, ACX és COI1, viszonylag magas indukciós szintet mutatott ebben a négy fajban. Egy kulcsgén, a JAR4 azonban a JA-t biológiailag aktív, JA-Ile felhalmozódott transzkriptumokká alakítja, és transzkripciós szintje nagyon alacsony, különösen az N. mills, a Nepenthes pieris és az N. microphylla fajokban. Ezenkívül csak egy másik gén, az AOS transzkriptuma nem volt kimutatható az N. bifidumban. Ezek a génexpressziós változások felelősek lehetnek a szignálanerg fajokban az alacsony JA-termelés és az N. gracilis indukciója által kiváltott extrém fenotípusokért.
(A) Négy közeli rokon dohányfaj korai transzkripciós válaszainak átprogramozásának információelméleti elemzése, 30 perccel a herbivor indukció után vett mintákban. Az RDPI-t a herbivor OS által indukált levelek és a sebkontroll összehasonlításával számítjuk ki. A színek különböző fajokat, a szimbólumok pedig különböző kezelési módszereket jelölnek. (B) A génexpresszió elemzése a JA jelátviteli útvonalakban négy faj között. Az egyszerűsített JA útvonal a dobozdiagram mellett látható. A különböző színek különböző feldolgozási módszereket jelölnek. A csillag azt jelzi, hogy szignifikáns különbség van a W + OS kezelés és a W + W kontroll között (a páros különbségek Student-féle t-próbájában *P<0,05, **P<0,01 és ***P<0,001). OPDA, 12-oxofitodiénsav; OPC-8: 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenil)-ciklopentán-1-oktánsav.
Az utolsó részben azt vizsgáltuk, hogy a különböző növényfajok metabolomjának rovarspecifikus átalakulása hogyan lehet rezisztens a növényevőkkel szemben. Korábbi kutatások a Nicotiana nemzetséget hangsúlyozták. Az Ms-szel és a lárvákkal szembeni rezisztenciájuk nagymértékben eltér (40). Itt a modell és metabolikus plaszticitásuk közötti kapcsolatot vizsgáltuk. A fenti négy dohányfaj felhasználásával, és a növényevők által okozott metabolom diverzitása és specializációja, valamint a növények Ms-sel és Sl-lel szembeni rezisztenciája közötti összefüggés tesztelésével azt találtuk, hogy a generalista Sl All-lel szembeni rezisztencia, diverzitás és specializáció pozitív korrelációt mutat, míg a szakértő hölgyekkel szembeni rezisztencia és a specializáció közötti korreláció gyenge, a diverzitással való korreláció pedig nem szignifikáns (S10. ábra). Az S1 rezisztenciát tekintve mind a gyengített N. chinensis, mind az N. gracilis, amelyekről korábban kimutatták, hogy mind JA jelátviteli szinteket, mind metabolom plaszticitást mutatnak, nagymértékben eltérően reagáltak a növényevő indukcióra, és hasonlóan magas rezisztenciát is mutattak. Nem.
Az elmúlt hatvan évben a növényvédelmi elmélet egy olyan elméleti keretet biztosított, amelyre alapozva a kutatók jelentős számú növényi specializált metabolit evolúcióját és funkcióját jósolták meg. Ezen elméletek többsége nem követi az erős következtetések szokásos eljárását (41). Az elemzés ugyanazon szintjén tesznek kulcsfontosságú előrejelzéseket (3). Amikor a kulcsfontosságú előrejelzések tesztelése lehetővé teszi bizonyos elméletek elemzését, az a területet előremozdítja. Támogatást nyerhet, de másokat elutasít (42). Ehelyett az új elmélet különböző elemzési szinteken tesz előrejelzéseket, és új leíró megfontolások rétegét adja hozzá (42). A funkcionális szinten javasolt két elmélet, az MT és az OD azonban könnyen magyarázható a növényevők által okozott specializált metabolikus változások fontos előrejelzéseként: Az OD elmélet úgy véli, hogy a specializált metabolikus „térben” bekövetkező változások erősen irányítottak. Az MT elmélet úgy véli, hogy ezek a változások nem irányítottak lesznek, véletlenszerűen helyezkednek el az anyagcsere-térben, és általában nagy védekező értékű metabolitokkal rendelkeznek. Az OD és MT előrejelzések korábbi vizsgálatait egy szűk a priori „védekezési” vegyületkészlettel tesztelték. Ezek a metabolit-központú tesztek kizárják a metabolom rekonfigurációjának mértékének és pályájának elemzését a növényevő növények élete során, és nem teszik lehetővé a következetes statisztikai keretrendszeren belüli tesztelést, amely olyan kulcsfontosságú előrejelzéseket igényelne, amelyeket egészében lehetne számszerűsíteni a növényi metabolom változásainak számszerűsítésére. Itt a metabolomikában alkalmazott, számítógépes MS-en alapuló innovatív technológiát alkalmaztuk, és dekonvolúciós MS-analízist végeztünk az információelméleti leírók általános valutájában, hogy teszteljük a kettő közötti különbséget a globális metabolomikai szinten. Ennek az elméletnek a kulcsfontosságú előrejelzése. Az információelméletet számos területen alkalmazták, különösen a biodiverzitás és a tápanyagáramlás kutatása kapcsán (43). Tudomásunk szerint azonban ez az első alkalmazás, amelyet a növények metabolikus információs terének leírására és a környezeti jelekre adott átmeneti metabolikus változásokkal kapcsolatos ökológiai problémák megoldására használnak. Ennek a módszernek a képessége különösen abban rejlik, hogy képes összehasonlítani a növényfajokon belüli és a növényfajok közötti mintákat, hogy megvizsgálja, hogyan fejlődtek a növényevők a különböző fajoktól a fajok közötti makroevolúciós mintákig az evolúció különböző szintjein. Anyagcsere.
A főkomponens-analízis (PCA) egy többváltozós adathalmazt dimenziócsökkentő térré alakít, így az adatok fő trendje magyarázható, ezért általában feltáró technikaként használják az adathalmaz elemzésére, például dekonvolúciós metabolom elemzésére. A dimenziócsökkentés azonban az adathalmaz információtartalmának egy részét elveszíti, és a PCA nem tud kvantitatív információt szolgáltatni az ökológiai elmélet szempontjából különösen releváns jellemzőkről, például: hogyan alakítják át a növényevők a diverzitást a speciális területeken (például gazdagság, eloszlás és bőség) a metabolitokban? Mely metabolitok előrejelzői egy adott növényevő indukált állapotának? A specificitás, a diverzitás és az indukálhatóság szempontjából a levélspecifikus metabolitprofil információtartalma lebomlik, és azt találják, hogy a növényevők evése aktiválhatja a specifikus anyagcserét. Váratlanul azt tapasztaltuk, hogy - amint azt az alkalmazott információelméleti indikátorokban leírtuk - a két növényevő (az éjszakai táplálkozású generalista Sl) és a Solanaceae szakértő Ms. támadása után a keletkező metabolikus helyzet nagy átfedést mutat. Bár táplálkozási viselkedésük és koncentrációjuk jelentősen eltér. Zsírsav-aminosav konjugátum (FAC) iniciátor az OS-ben (31). A növényevő OS standardizált szúrt sebek kezelésére való felhasználásával a szimulált növényevő kezelés is hasonló tendenciát mutatott. Ez a szabványosított eljárás a növények növényevő támadásokra adott válaszának szimulálására kiküszöböli a növényevők étkezési viselkedésében bekövetkező változások által okozott zavaró tényezőket, amelyek különböző időpontokban eltérő mértékű károsodáshoz vezetnek (34). A FAC, amelyről ismert, hogy az OSM fő oka, csökkenti a JAS és más növényi hormonok válaszát az OSS1-ben, míg az OSS1 több százszorosára csökkenti (31). Az OSS1 azonban hasonló mértékű JA-felhalmozódást okozott az OSM-hez képest. Korábban kimutatták, hogy a JA-válasz a gyengített Nepenthes-ben nagyon érzékeny az OSM-re, ahol a FAC akkor is megőrzi aktivitását, ha 1:1000 arányban vízzel hígítják (44). Ezért az OSM-hez képest, bár az OSS1-ben a FAC nagyon alacsony, elegendő a JA-kitörés megfelelő kiváltásához. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a porinszerű fehérjék (45) és az oligoszacharidok (46) molekuláris nyomként használhatók a növényi védekező válaszok kiváltására az OSS1-ben. Azonban még mindig nem világos, hogy ezek az OSS1-ben lévő elicitorok felelősek-e a jelenlegi vizsgálatban megfigyelt JA felhalmozódásért.
Bár kevés tanulmány ír le a különböző növényevők vagy exogén JA vagy SA (szalicilsav) alkalmazása által okozott eltérő metabolikus ujjlenyomatokat (47), senki sem vizsgálta a növényevő fajspecifikus zavart a növény-fű hálózatban, és annak hatását a specifikus személyes adatokra. Ez az elemzés tovább megerősítette, hogy a belső hormonhálózat kapcsolata a JA-kon kívüli más növényi hormonokkal alakítja a növényevők által okozott metabolikus átrendeződés specifitását. Különösen azt észleltük, hogy az OSM által okozott ET szignifikánsan nagyobb volt, mint az OSS1 által okozott. Ez a mód összhangban van az OSM magasabb FAC-tartalmával, ami szükséges és elégséges feltétele az ET-kitörés kiváltásának (48). A növények és a növényevők közötti kölcsönhatás összefüggésében az ET jelátviteli funkciója a növényspecifikus metabolitdinamikára továbbra is szórványos, és csak egyetlen vegyületcsoportot céloz meg. Ezenkívül a legtöbb tanulmány az ET vagy prekurzorainak, illetve különböző inhibitorainak exogén alkalmazását használta az ET szabályozásának tanulmányozására, amelyek közül ezek az exogén kémiai alkalmazások számos nem specifikus mellékhatást okoznak. Tudomásunk szerint ez a tanulmány az első nagyszabású, szisztematikus vizsgálatot jelenti az ET szerepéről az ET használatában a károsodott transzgénikus növények előállításában és érzékelésében, a növényi metabolom dinamikájának koordinálásában. A növényevőkre jellemző ET indukció végső soron modulálhatja a metabolom választ. A legjelentősebb az ET bioszintézis (ACO) és érzékelés (ETR1) gének transzgénikus manipulációja, amely feltárta a fenolamidok növényevőkre jellemző de novo felhalmozódását. Korábban kimutatták, hogy az ET a putreszcin N-metiltranszferáz szabályozásával képes finomhangolni a JA által kiváltott nikotinfelhalmozódást (49). Mechanikai szempontból azonban nem világos, hogy az ET hogyan finomhangolja a fenamid indukcióját. Az ET jelátviteli funkciója mellett az anyagcsere-fluxus az S-adenozil-1-metioninhoz is átirányítható, hogy szabályozza a poliaminofenol-amidokba történő befektetést. Az S-adenozil-1-metionin az ET és a poliamin bioszintézis útvonalának közös köztiterméke. Az a mechanizmus, amellyel az ET jel szabályozza a fenolamid szintjét, további vizsgálatokat igényel.
Hosszú ideig a nagyszámú, ismeretlen szerkezetű speciális metabolit miatt az egyes metabolikus kategóriákra irányuló intenzív figyelem nem volt képes szigorúan felmérni a metabolikus diverzitás időbeli változásait a biológiai kölcsönhatások után. Jelenleg, az információelméleti elemzés alapján, az elfogulatlan metabolitokon alapuló MS/MS spektrumfelvétel fő eredménye az, hogy a növényevőket fogyasztó vagy azokat utánzó növényevők továbbra is csökkentik a levél metabolomjának általános metabolikus diverzitását, miközben növelik annak specializációjának mértékét. A növényevők által okozott metabolomspecificitás átmeneti növekedése a transzkriptom specificitásának szinergikus növekedésével jár. Az a tulajdonság, amely a leginkább hozzájárul ehhez a nagyobb metabolom specializációhoz (magasabb Si-értékkel), a korábban jellemzett növényevő funkcióval rendelkező speciális metabolit. Ez a modell összhangban van az OD-elmélet jóslatával, de a metabolom átprogramozásának véletlenszerűségével kapcsolatos MT-nek az előrejelzése nem következetes. Ez az adat azonban összhangban van a vegyes modell (legjobb MT; 1B. ábra) jóslatával is, mivel más, nem jellemzett, ismeretlen védekező funkciókkal rendelkező metabolitok továbbra is követhetnek véletlenszerű Si-eloszlást.
Egy figyelemre méltó minta, amelyet ez a kutatás is kiemel, hogy a mikroevolúciós szinttől (egyetlen növény és dohánypopuláció) egy nagyobb evolúciós léptékig (közeli rokon dohányfajok) az evolúciós szerveződés különböző szintjei a „legjobb védekezésben” vannak. Jelentős különbségek vannak a növényevők képességeiben. Moore és munkatársai (20), valamint Kessler és Kalske (1) egymástól függetlenül azt javasolták, hogy a Whittaker (50) által eredetileg megkülönböztetett három funkcionális szintet a kémiai diverzitás konstitutív és indukált időbeli változásaivá alakítsák át; ezek a szerzők sem foglaltak össze semmit. A nagyléptékű metabolom adatgyűjtés eljárásai azt sem vázolják fel, hogyan kell kiszámítani az anyagcsere-diverzitást ezekből az adatokból. Ebben a tanulmányban a Whittaker funkcionális osztályozásának kisebb módosításai az α-metabolikus diverzitást egy adott növény MS/MS spektrumainak diverzitásaként, a β-metabolikus diverzitást pedig egy populációcsoport alapvető fajon belüli anyagcseréjeként fogják figyelembe venni, a γ-metabolikus diverzitás pedig a hasonló fajok elemzésének kiterjesztése lesz.
A JA-jel elengedhetetlen a növényevő állatok metabolikus válaszainak széles skálájához. Azonban hiányoznak a szigorú kvantitatív vizsgálatok a JA-bioszintézis fajon belüli szabályozásának a metabolit-diverzitáshoz való hozzájárulásáról, és az, hogy a JA-jel általános helyszíne-e a stressz által kiváltott metabolikus diverzifikációnak magasabb makroevolúciós léptékben, még mindig nem tisztázott. Megfigyeltük, hogy a Nepenthes növényevő növényevő természete metabolit-specializációt indukál, és a metabolit-specializáció változása a Nicotiana fajok populációján belül és a közeli rokon Nicotiana fajok között szisztematikusan pozitív korrelációt mutat a JA-jelátvitellel. Ezenkívül, amikor a JA-jel károsodik, az egyetlen genotípusú növényevő által indukált metabolikus specificitás megszűnik (3. ábra, C és E). Mivel a természetesen legyengített Nepenthes populációk metabolikus spektrumának változásai többnyire kvantitatívak, a metabolikus β-diverzitás és -specificitás változásait ebben az elemzésben nagyrészt a metabolitokban gazdag vegyületkategóriák erős gerjesztése okozhatja. Ezek a vegyületosztályok dominálják a metabolitprofil egy részét, és pozitív korrelációhoz vezetnek a JA-jelátvitellel.
Mivel a közeli rokonságban álló dohányfajok biokémiai mechanizmusai nagyon eltérőek, a metabolitok specifikusan a kvalitatív aspektusban azonosíthatók, így analitikusabb a módszer. Az információelmélet által a rögzített metabolikus profil feldolgozása azt mutatja, hogy a növényevő indukció súlyosbítja a metabolikus gamma-diverzitás és a specializáció közötti kompromisszumot. A JA-jel központi szerepet játszik ebben a kompromisszumban. A metabolom specializációjának növekedése összhangban van a fő OD-előrejelzéssel, és pozitív korrelációban áll a JA-jellel, míg a JA-jel negatív korrelációban áll a metabolikus gamma-diverzitásssal. Ezek a modellek azt jelzik, hogy a növények OD-kapacitását főként a JA plaszticitása határozza meg, akár mikroevolúciós, akár nagyobb evolúciós léptékben. Az exogén JA-alkalmazási kísérletek, amelyek megkerülik a JA bioszintézis hibáit, azt is feltárják, hogy a közeli rokonságban álló dohányfajok megkülönböztethetők jelre reagáló és jelre nem reagáló fajokra, akárcsak a növényevők által indukált JA-módjuk és metabolom-plaszticitásuk. A jelre nem reagáló fajok nem tudnak válaszolni, mivel nem képesek endogén JA-t termelni, ezért fiziológiai korlátoknak vannak kitéve. Ezt a JA jelátviteli útvonal néhány kulcsfontosságú génjének (AOS és JAR4 az N. crescensben) mutációi okozhatják. Ez az eredmény rávilágít arra, hogy ezeket a fajok közötti makroevolúciós mintázatokat főként a belső hormonok érzékelésében és reagálásában bekövetkező változások vezérelhetik.
A növények és a növényevők közötti kölcsönhatáson túl az anyagcsere-diverzitás feltárása összefügg a környezethez való biológiai alkalmazkodás és a komplex fenotípusos tulajdonságok evolúciójának kutatásában elért összes fontos elméleti előrelépéssel. A modern MS-eszközök által gyűjtött adatok mennyiségének növekedésével az anyagcsere-diverzitásra vonatkozó hipotézisvizsgálatok ma már képesek túllépni az egyéni/kategória metabolit-különbségeken, és globális elemzést végezni a váratlan mintázatok feltárása érdekében. A nagyléptékű elemzések folyamatában fontos metafora az értelmes térképek megalkotásának ötlete, amelyek felhasználhatók az adatok feltárására. Ezért az elfogulatlan MS/MS metabolomika és az információelmélet jelenlegi kombinációjának egyik fontos eredménye, hogy egy egyszerű metrikát biztosít, amely felhasználható térképek létrehozására az anyagcsere-diverzitás különböző taxonómiai skálákon történő böngészésére. Ez a módszer alapvető követelménye. A mikro/makro evolúció és a közösségi ökológia tanulmányozása.
Makroevolúciós szinten Ehrlich és Raven (51) növény-rovar koevolúciós elméletének lényege, hogy a fajok közötti anyagcsere-diverzitás változása okozza a növényi leszármazási vonalak diverzifikációját. Azonban e korszakalkotó munka megjelenése óta eltelt ötven évben ezt a hipotézist ritkán tesztelték (52). Ez nagyrészt a nagy távolságú növényi leszármazási vonalak összehasonlítható anyagcsere-jellemzőinek filogenetikai jellemzőinek köszönhető. Ez a ritkaság felhasználható a célzott elemzési módszerek lehorgonyzására. Az információelmélet által feldolgozott jelenlegi MS/MS munkafolyamat számszerűsíti az ismeretlen metabolitok MS/MS szerkezeti hasonlóságát (előzetes metabolit-kiválasztás nélkül), és ezeket az MS/MS-eket MS/MS halmazzá konvertálja, így a professzionális anyagcserében ezeket a makroevolúciós modelleket osztályozási skálán hasonlítják össze. Egyszerű statisztikai mutatók. A folyamat hasonló a filogenetikai elemzéshez, amely szekvenciaillesztést használhat a diverzifikáció vagy a karakterfejlődés sebességének számszerűsítésére előzetes előrejelzés nélkül.
Biokémiai szinten Firn és Jones (53) szűrőhipotézise azt mutatja, hogy az anyagcsere-diverzitás különböző szinteken fennmarad, hogy nyersanyagokat biztosítson a korábban nem kapcsolódó vagy helyettesített metabolitok biológiai aktivitásának kifejtéséhez. Az információelméleti módszerek olyan keretet biztosítanak, amelyben ezek a metabolit-specifikus evolúciós átmenetek, amelyek a metabolit-specializáció során történnek, számszerűsíthetők a javasolt evolúciós szűrőfolyamat részeként: biológiailag aktív adaptáció az alacsony specificitástól a magas specificitásig. Egy adott környezet gátolt metabolitjai.
Összességében a molekuláris biológia korai napjaiban fontos növényvédelmi elméleteket fejlesztettek ki, és a deduktív hipotézisvezérelt módszereket széles körben a tudományos fejlődés egyetlen eszközének tekintik. Ez nagyrészt a teljes metabolom mérésének technikai korlátainak köszönhető. Bár a hipotézisvezérelt módszerek különösen hasznosak más ok-okozati mechanizmusok kiválasztásában, a biokémiai hálózatok megértésének előmozdítására való képességük korlátozottabb, mint a kortárs adatintenzív tudományban jelenleg elérhető számítási módszereké. Ezért az előre nem jelezhető elméletek messze túlmutatnak a rendelkezésre álló adatok keretein, így a kutatási területen a haladás hipotetikus képlet/teszt ciklusa nem szüntethető meg (4). Úgy látjuk, hogy a metabolomika itt bemutatott számítási munkafolyamata újra felkeltheti az érdeklődést az anyagcsere-diverzitás legújabb (hogyan) és végső (miért) kérdései iránt, és hozzájárulhat az elméletileg vezérelt adattudomány új korszakához. Ez a korszak újra megvizsgálta a korábbi generációkat inspiráló fontos elméleteket.
A növényevők közvetlen táplálását úgy végezték, hogy egyetlen rózsavirágzó növény halvány színű kancsóka levelén egy második stádiumú lárvát vagy Sl-lárvát neveltek fel, növényenként 10 növényi replikátummal. A rovarlárvákat szorítókkal fogták le, a fennmaradó levélszövetet a fertőzés után 24 és 72 órával összegyűjtötték, gyorsfagyasztották, és a metabolitokat kivonták.
Szimuláljon növényevő kezelést nagymértékben szinkronizált módon. A módszer lényege, hogy a szövetmintázó kerekek segítségével a szövetfüzér növekedési szakaszában a növény három teljesen kifejlődött levelének középső erezetének mindkét oldalán három-három sor tövist szúrnak ki, majd azonnal 1:5 arányban hígított Ms-t visznek fel. Vagy kesztyűs ujjakkal S1 OS-t helyeznek a szúrt sebbe. A fent leírtak szerint betakarítják és feldolgozzák a levelet. A korábban leírt módszerrel kivonják az elsődleges metabolitokat és a növényi hormonokat (54).
Exogén JA alkalmazásokhoz minden faj hat rózsanövényének három levélnyelét 20 μl 150 μg MeJA-t tartalmazó lanolinpasztával (Lan + MeJA) és 20 μl lanolinnal plusz sebkezeléssel (Lan + W) kezelik, vagy 20 μl tiszta lanolint használnak kontrollként. A leveleket 72 órával a kezelés után betakarítják, folyékony nitrogénben gyorsfagyasztják, és felhasználásig -80°C-on tárolják.
Kutatócsoportunkban négy JA és ET transzgénikus vonalat azonosítottunk, nevezetesen az irAOC-t (36), az irCOI1-et (55), az irACO-t és az sETR1-et (48). Az irAOC esetében a JA és JA-Ile szintje jelentősen csökkent, míg az irCOI1 nem volt érzékeny a JA-kra. Az EV-hez képest a JA-Ile felhalmozódása fokozódott. Hasonlóképpen, az irACO csökkenti az ET termelését, míg az EV-hez képest az ET-re érzéketlen sETR1 növeli az ET termelését.
Egy fotoakusztikus lézerspektrométert (Sensor Sense ETD-300 valós idejű ET-érzékelő) használnak az ET-mérés nem invazív elvégzésére. A kezelés után azonnal a levelek felét levágták, és egy 4 ml-es, lezárt üvegcsébe helyezték, majd a levegőben lévő folyadékot 5 órán belül hagyták felhalmozódni. A mérés során minden üvegcsét 2 liter/óra tiszta levegőárammal öblítettek 8 percig, amelyet előzőleg a Sensor Sense által biztosított katalizátoron átengedtek a CO2 és a víz eltávolítása érdekében.
A microarray adatokat eredetileg a (35) hivatkozásban tették közzé, és a National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Comprehensive Database adatbázisában (hozzáférési szám: GSE30287) tárolták. A vizsgálathoz a W + OSMs kezelés által okozott leveleknek és a sértetlen kontrollnak megfelelő adatokat vették ki. A nyers intenzitás log2. A statisztikai elemzés előtt az alapértéket az R szoftvercsomag segítségével konvertálták és normalizálták a 75. percentilisre.
A Nicotiana fajok eredeti RNS-szekvenálási (RNS-seq) adatait az NCBI Short Reading Archives (SRA) adatbázisából szereztük be, a PRJNA301787 projektszámmal, melyet Zhou és munkatársai (39) publikáltak, és az (56)-ban leírtak szerint jártunk el. A W + W, W + OSM és W + OSS1 által feldolgozott, a Nicotiana fajoknak megfelelő nyers adatokat választottuk ki az elemzéshez a jelen vizsgálatban, és a következő módon dolgoztuk fel: Először a nyers RNS-szekvenálási értékeket FASTQ formátumba konvertáltuk. A HISAT2 a FASTQ-t SAM-má konvertálja, a SAMtools pedig a SAM-fájlokat rendezett BAM-fájlokká alakítja. A StringTie programot használják a génexpresszió kiszámításához, expressziós módszere pedig az, hogy ezer bázispárra jutó fragmensből millió szekvenált transzkripciós fragmensből áll a fragmens.
Az analízisben használt Acclaim kromatográfiás oszlop (150 mm x 2,1 mm; részecskeméret 2,2 μm) és a 4 mm x 4 mm-es előtétoszlop ugyanabból az anyagból készült. A Dionex UltiMate 3000 ultra nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (UHPLC) rendszerben a következő bináris gradienst alkalmazzák: 0-0,5 perc, izokratikus 90% A [ioncserélt víz, 0,1% (v/v) acetonitril és 0,05% hangyasav], 10% B (acetonitril és 0,05% hangyasav); 0,5-23,5 perc, a gradiens fázis 10% A és 90% B; 23,5-25 perc, izokratikus 10% A és 90% B. Az áramlási sebesség 400 μl/perc. Minden MS analízishez az oszlop eluenst egy kvadrupól és repülési idő (qTOF) analizátorba kell injektálni, amely pozitív ionizációs módban működő elektrospray forrással van felszerelve (kapilláris feszültség: 4500 V; kapilláris kimenet 130 V; szárítási hőmérséklet 200 °C; szárító légáramlás 10 liter/perc).
Végezzen el MS/MS fragmensanalízist (a továbbiakban: MS/MS) az adatoktól irreleváns vagy azoktól megkülönböztethetetlen módon, hogy szerkezeti információkat szerezzen az általános kimutatható metabolikus profilról. A megkülönböztetés nélküli MS/MS módszer koncepciója azon a tényen alapul, hogy a kvadrupól nagyon nagy tömegizolációs ablakkal rendelkezik [ezért az összes tömeg-töltés arány (m/z) jelet fragmensnek tekintse]. Emiatt, mivel az Impact II műszer nem tudott CE dőlést létrehozni, több független elemzést végeztek megnövelt ütközés által kiváltott disszociációs ütközési energia (CE) értékekkel. Röviden, először elemezze a mintát UHPLC-elektrospray ionizációval/qTOF-MS-sel egyetlen tömegspektrometriás módban (alacsony fragmentációs körülmények, amelyeket a forráson belüli fragmentáció generál), 50-től 1500-ig terjedő m/z szkenneléssel 5 Hz ismétlési frekvenciával. Használjon nitrogént ütközési gázként az MS/MS elemzéshez, és végezzen független méréseket a következő négy különböző ütközés által kiváltott disszociációs feszültségen: 20, 30, 40 és 50 eV. A mérési folyamat során a kvadrupól rendelkezik a legnagyobb tömegizolációs ablakkal, m/z 50-től 1500-ig. Amikor az elülső test m/z és izolációs szélesség kísérletét 200-ra állítják, a tömegtartományt a műszer operációs szoftvere automatikusan aktiválja, és 0 Da. A tömegfragmentumokat az egyszeres tömegű módhoz hasonlóan keressük. A tömegkalibrációhoz nátrium-formiátot (50 ml izopropanol, 200 μl hangyasav és 1 ml 1 M NaOH vizes oldat) használjunk. A Bruker nagy pontosságú kalibrációs algoritmusával az adatfájlt egy adott időszakon belüli átlagos spektrum lefuttatása után kalibráljuk. A Data Analysis v4.0 szoftver (Brook Dalton, Bremen, Németország) export funkciójával konvertáljuk a nyers adatfájlokat NetCDF formátumba. Az MS/MS adatkészletet a MetaboLights (www.ebi.ac.uk) nyílt metabolomikai adatbázisba mentettük az MTBLS1471 hozzáférési számmal.
Az MS/MS összeszerelés az MS1 és az alacsony és magas ütközési energia MS/MS minőségi jelei közötti korrelációanalízissel, valamint újonnan implementált szabályokkal valósítható meg. Az R szkriptet használják a prekurzor és a termék közötti eloszlás korrelációanalízisének megvalósítására, a szabályok implementálására pedig a C# szkriptet (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline).
Annak érdekében, hogy csökkentsük a háttérzaj és a bizonyos m/z jellemzők csak néhány mintában történő detektálása által okozott téves pozitív hibákat, az R csomag XCMS „kitöltött csúcs” függvényét (a háttérzaj korrekciójához) használjuk. Ezt kell használni az „NA” (nem detektált csúcs) intenzitás helyettesítésére. A kitöltött csúcs függvény használatakor továbbra is sok „0” intenzitásérték van az adathalmazban, amelyek befolyásolják a korrelációszámítást. Ezután összehasonlítjuk a kitöltött csúcs függvény használatával és a kitöltött csúcs függvény nélkül kapott adatfeldolgozási eredményeket, és az átlagos korrigált becsült érték alapján kiszámítjuk a háttérzaj értékét, majd ezeket a 0 intenzitásértékeket helyettesítjük a kiszámított háttérértékkel. Csak azokat a jellemzőket vettük figyelembe, amelyek intenzitása meghaladta a háttérérték háromszorosát, és ezeket tekintettük „valódi csúcsoknak”. A PCC számításokhoz csak a minta prekurzor (MS1) és a legalább nyolc valódi csúccsal rendelkező fragmens adathalmazok m/z jeleit vesszük figyelembe.
Ha a prekurzor minőségi jellemző intenzitása a teljes mintában szignifikánsan korrelál az alacsony vagy magas ütközési energiának kitett ugyanazon minőségi jellemző csökkent intenzitásával, és a jellemzőt a CAMERA nem jelöli izotópcsúcsként, akkor az tovább definiálható. Ezután a 3 másodpercen belüli összes lehetséges prekurzor-termék pár kiszámításával (a csúcs retenciójának becsült retenciós időablaka) elvégezzük a korrelációanalízist. Csak akkor tekintjük fragmensnek, ha az m/z érték alacsonyabb, mint a prekurzor értéke, és az MS/MS fragmentáció az adatkészletben ugyanabban a mintahelyen történik, mint az a prekurzor, amelyből származik.
E két egyszerű szabály alapján kizárjuk azokat a meghatározott fragmenseket, amelyek m/z értéke nagyobb, mint az azonosított prekurzor m/z értéke, a prekurzor megjelenésének mintapéldánybeli pozíciója és a meghatározott fragmens alapján. Az is lehetséges, hogy az MS1 módban generált számos, forrásból származó fragmens által generált minőségi jellemzőket jelölt prekurzorként választhatók ki, ezáltal redundáns MS/MS vegyületeket generálva. Az adatredundancia csökkentése érdekében, ha a spektrumok NDP-hasonlósága meghaladja a 0,6-ot, és a CAMERA által annotált „pcgroup” kromatogramhoz tartoznak, akkor egyesítjük őket. Végül a prekurzorhoz és a fragmensekhez kapcsolódó mind a négy CE-eredményt egyesítjük a végső dekonvolúciós kompozit spektrumba úgy, hogy az összes azonos m/z értékű jelöltcsúcs közül a legnagyobb intenzitású csúcsot választjuk ki különböző ütközési energiáknál. A következő feldolgozási lépések az összetett spektrum koncepcióján alapulnak, és figyelembe veszik a fragmentáció valószínűségének maximalizálásához szükséges különböző CE-feltételeket, mivel egyes fragmensek csak egy adott ütközési energia alatt detektálhatók.
Az anyagcsere-profil indukálhatóságát az RDPI (30) programmal számítottuk ki. Az anyagcsere-spektrum diverzitását (Hj index) az MS/MS prekurzorok gyakoriságából származtatjuk, az MS/MS frekvenciaeloszlás Shannon-entrópiáját használva, a Martínez és munkatársai (8) által leírt következő egyenlet segítségével. Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), ahol Pij az i-edik MS/MS relatív gyakoriságát jelenti a j-edik mintában (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
A metabolikus specificitás (Si index) egy adott MS/MS expressziós azonossága a vizsgált minták közötti gyakorisághoz viszonyítva. Az MS/MS specificitást a következőképpen számítjuk ki: Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
A következő képlettel mérjük meg az egyes j minták metabolom-specifikus δj indexét, valamint az MS/MS specificitás átlagát δj = ∑i = 1mPijSi
Az MS/MS spektrumokat párosával illesztjük, és a hasonlóságot a két pontszám alapján számítjuk ki. Először standard NDP (más néven koszinusz korrelációs módszer) alkalmazásával a következő egyenlet segítségével értékeljük a spektrumok közötti szegmenshasonlóságot: NDP = (∑iS1 és S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 ahol S1 és S2 Ennek megfelelően az 1. és 2. spektrum, valamint a WS1, i és WS2 esetében az i a csúcsintenzitáson alapuló súlyt jelöli, amely szerint a két spektrum i-edik közös csúcsának különbsége kisebb, mint 0,01 Da. A súlyt a következőképpen számítjuk ki: W = [csúcsintenzitás] m [minőség] n, m = 0,5, n = 2, a MassBank javaslata szerint.
Egy második pontozási módszert is bevezettünk, amely az MS/MS között megosztott NL-listát elemezte. Ehhez az MS fragmentációs folyamat során gyakran előforduló 52 NL-listát együttesen, valamint a korábban a legyengített Nepenthes fajok másodlagos metabolitjainak MS/MS-spektrumához annotált specifikusabb NL-listát (S1 adatfájl) használtuk (9, 26). Minden MS/MS-hez létrehoztunk egy 1-es és 0-s bináris vektort, amelyek rendre megfelelnek valamelyik NL aktuális, illetve nem létező értékének. Az euklideszi távolsághasonlóság alapján kiszámítottuk az NL-hasonlósági pontszámot minden bináris NL-vektor-párra.
A kettős klaszterezéshez a DiffCoEx R csomagot használtuk, amely a Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA) kiterjesztésén alapul. Az MS/MS spektrumok NDP és NL pontozási mátrixait felhasználva a DiffCoEx segítségével számítottuk ki az összehasonlító korrelációs mátrixot. A bináris klaszterezést a „cutreeDynamic” paraméter method = „hybrid”, cutHeight = 0,9999, deepSplit = T és minClusterSize = 10 értékre állításával végeztük. A DiffCoEx R forráskódját Tesson és munkatársai (57) töltötték le az 1. számú kiegészítő fájlból; A szükséges R WGCNA szoftvercsomag a https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA címen található.
Az MS/MS molekuláris hálózati elemzés elvégzéséhez párosított spektrális összekapcsolhatóságot számítottunk ki az NDP és NL hasonlósági típusok alapján, és a Cytoscape szoftvert használtuk a hálózati topológia vizualizálására organikus elrendezéssel a CyFilescape yFiles elrendezési algoritmus bővítő alkalmazásában.
Az adatok statisztikai elemzéséhez az R 3.0.1-es verzióját használtuk. A statisztikai szignifikanciát kétutas varianciaanalízissel (ANOVA), majd Tukey-féle őszintén szignifikáns különbség (HSD) post-hoc teszttel értékeltük. A növényevő kezelés és a kontroll közötti különbség elemzéséhez az azonos varianciájú két mintacsoport kétoldali eloszlását Student-féle t-próbával elemeztük.
A cikkhez tartozó kiegészítő anyagokért kérjük, látogassa meg a http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1 weboldalt.
Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, amely a Creative Commons Nevezd meg! – Ne add el! Licenc feltételei szerint kerül terjesztésre, amely lehetővé teszi a felhasználást, terjesztést és sokszorosítást bármilyen médiumban, feltéve, hogy a végső felhasználás nem kereskedelmi célú, és a feltétel az, hogy az eredeti mű helyes. Hivatkozás.
Megjegyzés: Csak azért kérjük az e-mail címed megadását, hogy az oldalra ajánlott személy tudja, hogy szeretnéd, ha látná az e-mailt, és hogy az nem spam. Nem fogunk rögzíteni semmilyen e-mail címet.
Ez a kérdés arra szolgál, hogy teszteljük, látogató-e, és megakadályozzuk az automatikus spamküldést.
Az információelmélet univerzális valutát biztosít a speciális metabolomok összehasonlításához és a tesztvédelmi elméletek előrejelzéséhez.
Az információelmélet univerzális valutát biztosít a speciális metabolomok összehasonlításához és a tesztvédelmi elméletek előrejelzéséhez.
©2021 American Association for the Advancement of Science. minden jog fenntartva. Az AAAS a HINARI, az AGORA, az OARE, a CHORUS, a CLOCKSS, a CrossRef és a COUNTER partnere. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.