A cikk a „Hüvelyesek kórokozókkal és kártevőkkel szembeni ellenálló képességének javítása” kutatási téma része, lásd mind az 5 cikket
A Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary gombás növényi betegség nekrózisának kórokozója többszintű stratégiát alkalmaz a különböző gazdanövények fertőzésére. Ez a tanulmány a diamin L-ornitin, egy nem fehérje eredetű aminosav, amely más esszenciális aminosavak szintézisét serkenti, alkalmazását javasolja alternatív kezelési stratégiaként a Phaseolus vulgaris L. molekuláris, fiziológiai és biokémiai válaszának fokozására a Pseudomonas sclerotiorum által okozott fehérpenészre. In vitro kísérletek kimutatták, hogy az L-ornitin dózisfüggő módon jelentősen gátolta az S. pyrenoidosa micéliumnövekedését. Ezenkívül jelentősen csökkenthette a fehérpenész súlyosságát üvegházi körülmények között. Továbbá az L-ornitin serkentette a kezelt növények növekedését, ami azt jelzi, hogy az L-ornitin tesztelt koncentrációi nem voltak fitotoxikusak a kezelt növényekre. Ezenkívül az L-ornitin fokozta a nem enzimatikus antioxidánsok (teljes oldható fenolok és flavonoidok) és az enzimatikus antioxidánsok (kataláz (CAT), peroxidáz (POX) és polifenol-oxidáz (PPO)) expresszióját, és növelte három antioxidánssal kapcsolatos gén (PvCAT1, PvSOD és PvGR) expresszióját. Továbbá az in silico analízis kimutatta egy feltételezett oxaloacetát-acetilhidroláz (SsOAH) fehérje jelenlétét az S. sclerotiorum genomban, amely funkcionális analízis, konzervált domének és topológia tekintetében nagymértékben hasonlított az Aspergillus fijiensis (AfOAH) és a Penicillium sp. (PlOAH) oxaloacetát-acetilhidroláz (SsOAH) fehérjéihez. Érdekes módon, az L-ornitin hozzáadása a burgonya-dextróz leves (PDB) táptalajhoz jelentősen csökkentette az SsOAH gén expresszióját az S. sclerotiorum micéliumban. Hasonlóképpen, az L-ornitin exogén alkalmazása jelentősen csökkentette az SsOAH gén expresszióját a kezelt növényekből gyűjtött gombamicéliumokban. Végül az L-ornitin alkalmazása szignifikánsan csökkentette az oxálsavszekréciót mind a PDB táptalajon, mind a fertőzött levelekben. Összefoglalva, az L-ornitin kulcsszerepet játszik a redox állapot fenntartásában, valamint a fertőzött növények védekező válaszának fokozásában. A tanulmány eredményei segíthetnek innovatív, környezetbarát módszerek kidolgozásában a fehérpenész elleni védekezésben, valamint a babtermesztésre és más növényekre gyakorolt ​​hatásának enyhítésében.
A fehérpenész, melyet a Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary nekrotrof gomba okoz, egy pusztító, terméshozam-csökkentő betegség, amely komoly veszélyt jelent a bab (Phaseolus vulgaris L.) globális termesztésére (Bolton et al., 2006). A Sclerotinia sclerotiorum az egyik legnehezebben irtható talajban élő gombás növényi kórokozó, több mint 600 növényfajból álló széles gazdaszervezettel rendelkezik, és képes a gazdaszöveteket nem specifikus módon gyorsan feldolgozni (Liang és Rollins, 2018). Kedvezőtlen körülmények között életciklusának kritikus szakaszán megy keresztül, hosszú ideig szunnyadó állapotban marad fekete, kemény, magszerű képződmények, úgynevezett „szkleróciumok” formájában a talajban, vagy fehér, pihe-puha kinövések formájában a fertőzött növények micéliumában vagy szárbélében (Schwartz et al., 2005). Az S. sclerotiorum képes szkleróciumok képzésére, amelyek lehetővé teszik számára, hogy hosszú ideig túléljen a fertőzött területeken, és a betegség alatt is fennmaradjon (Schwartz et al., 2005). A szkleróciumok tápanyagokban gazdagok, hosszú ideig fennmaradhatnak a talajban, és elsődleges oltóanyagként szolgálhatnak a későbbi fertőzésekhez (Schwartz et al., 2005). Kedvező körülmények között a szkleróciumok csíráznak és levegőben terjedő spórákat termelnek, amelyek megfertőzhetik a növény összes föld feletti részét, beleértve, de nem kizárólagosan a virágokat, szárakat vagy hüvelyeket (Schwartz et al., 2005).
A Sclerotinia sclerotiorum többszintű stratégiát alkalmaz gazdanövényeinek fertőzésére, amely a szkleróciumok csírázásától a tünetek kialakulásáig összehangolt események sorozatát foglalja magában. Kezdetben az S. sclerotiorum szuszpendált spórákat (aszkospóráknak nevezik) termel az apotéciumoknak nevezett gombaszerű struktúrákból, amelyek a levegőbe kerülnek, és a fertőzött növényi maradványokon nem mozgékony szkleróciumokká fejlődnek (Bolton et al., 2006). A gomba ezután oxálsavat, egy virulenciafaktort választ ki, hogy szabályozza a növényi sejtfal pH-értékét, elősegítse az enzimatikus lebontást és a szövetek invázióját (Hegedus és Rimmer, 2005), és elnyomja a gazdanövény oxidatív robbanását. Ez a savasodási folyamat gyengíti a növényi sejtfalat, kedvező környezetet teremtve a gombasejtfalat lebontó enzimek (CWDE-k) normális és hatékony működéséhez, lehetővé téve a kórokozó számára, hogy leküzdje a fizikai gátat és behatoljon a gazdaszövetekbe (Marciano et al., 1983). Miután bejutott a szervezetbe, az S. sclerotiorum számos CWDE-t választ ki, például poligalakturonázt és cellulázt, amelyek elősegítik a fertőzött szövetekben való terjedését és szöveti nekrózist okoznak. A léziók és a hifális szőnyegek progressziója a fehérpenész jellegzetes tüneteihez vezet (Hegedus és Rimmer, 2005). Eközben a gazdanövények mintázatfelismerő receptorokon (PRR) keresztül ismerik fel a kórokozókkal kapcsolatos molekuláris mintázatokat (PAMP), ami egy sor jelátviteli eseményt indít el, amelyek végső soron aktiválják a védekező válaszokat.
A betegség elleni védekezés évtizedes erőfeszítései ellenére a babban, akárcsak más kereskedelmi növényekben, továbbra is hiány mutatkozik a megfelelő rezisztens csíraplazmából a kórokozó rezisztenciája, túlélése és alkalmazkodóképessége miatt. A betegségkezelés ezért rendkívül kihívást jelent, és integrált, sokrétű stratégiát igényel, amely magában foglalja a termesztési gyakorlatok, a biológiai védekezés és a kémiai gombaölő szerek kombinációját (O'Sullivan et al., 2021). A fehérpenész kémiai védekezése a leghatékonyabb, mivel a gombaölő szerek, ha helyesen és megfelelő időben alkalmazzák, hatékonyan tudják szabályozni a betegség terjedését, csökkenteni a fertőzés súlyosságát és minimalizálni a termésveszteséget. A gombaölő szerek túlzott használata és túlzott függősége azonban a S. sclerotiorum rezisztens törzseinek megjelenéséhez vezethet, és negatívan befolyásolhatja a nem célzott élőlényeket, a talaj egészségét és a vízminőséget (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Ezért a környezetbarát alternatívák felkutatása kiemelt prioritássá vált.
A poliaminok (PA-k), mint például a putreszcin, spermidin, spermin és kadaverin, ígéretes alternatívát jelenthetnek a talajban élő növényi kórokozókkal szemben, ezáltal teljesen vagy részben csökkentve a veszélyes kémiai gombaölő szerek használatát (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). A magasabb rendű növényekben a PA-k számos fiziológiai folyamatban vesznek részt, beleértve, de nem kizárólagosan, a sejtosztódást, a differenciálódást és az abiotikus és biotikus stresszekre adott választ (Killiny és Nehela, 2020). Antioxidánsként működhetnek, segíthetnek a reaktív oxigénfajták (ROS) megkötésében, fenntarthatják a redox homeosztázist (Nehela és Killiny, 2023), indukálhatják a védekezéssel kapcsolatos géneket (Romero et al., 2018), szabályozhatják a különböző anyagcsere-utakat (Nehela és Killiny, 2023), modulálhatják az endogén fitohormonokat (Nehela és Killiny, 2019), szisztémás szerzett rezisztenciát (SAR) alakíthatnak ki, és szabályozhatják a növény-kórokozó kölcsönhatásokat (Nehela és Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Érdemes megjegyezni, hogy a PA-k specifikus mechanizmusai és szerepe a növényvédelemben növényfajtól, kórokozótól és környezeti feltételektől függően változik. A növényekben leggyakrabban előforduló PA az esszenciális L-ornitin poliaminból bioszintézissel képződik (Killiny és Nehela, 2020).
Az L-ornitin több szerepet játszik a növények növekedésében és fejlődésében. Például korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a rizsben (Oryza sativa) az ornitin összefüggésben állhat a nitrogén újrahasznosításával (Liu et al., 2018), a rizs hozamával, minőségével és aromájával (Lu et al., 2020), valamint a vízstresszre adott válasszal (Yang et al., 2000). Továbbá az L-ornitin exogén alkalmazása jelentősen javította a szárazságtűrést a cukorrépában (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019), és enyhítette a sóstresszet a hagyma- (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu és Çavuşoǧlu, 2021) és a kesudió- (Anacardium occidentale) növényekben (da Rocha et al., 2012). Az L-ornitin abiotikus stressz elleni védekezésben betöltött potenciális szerepe a kezelt növényekben a prolin felhalmozódásában betöltött szerepének tudható be. Például a prolin anyagcserével kapcsolatos gének, mint például az ornitin-delta-aminotranszferáz (delta-OAT) és a prolin-dehidrogenáz (ProDH1 és ProDH2) gének, korábban szerepet játszottak a Nicotiana benthamiana és az Arabidopsis thaliana nem gazda Pseudomonas syringae törzsekkel szembeni védelmében (Senthil-Kumar és Mysore, 2012). Másrészt a gombaeredetű ornitin-dekarboxiláz (ODC) szükséges a kórokozók növekedéséhez (Singh et al., 2020). A Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ODC-jének célba vétele gazdaszervezet által indukált géncsendesítéssel (HIGS) jelentősen fokozta a paradicsomnövények Fusarium hervadással szembeni ellenálló képességét (Singh et al., 2020). Az exogén ornitin alkalmazásának potenciális szerepe a biotikus stresszekkel, például a fitopatogénekkel szemben azonban még nem teljesen ismert. Ami még fontosabb, az ornitin betegség-rezisztenciára gyakorolt ​​hatása, valamint a kapcsolódó biokémiai és fiziológiai jelenségek nagyrészt feltáratlanok.
A hüvelyesek S. sclerotiorum fertőzésének összetettségének megértése fontos a hatékony védekezési stratégiák kidolgozásához. Ebben a tanulmányban célul tűztük ki az L-ornitin-diamin potenciális szerepének azonosítását, mint kulcsfontosságú tényezőt a hüvelyesek Sclerotinia sclerotiorum fertőzéssel szembeni védekező mechanizmusainak és rezisztenciájának fokozásában. Feltételezzük, hogy a fertőzött növények védekező válaszainak fokozása mellett az L-ornitin kulcsszerepet játszik a redox státusz fenntartásában is. Azt feltételezzük, hogy az L-ornitin lehetséges hatásai az enzimatikus és nem enzimatikus antioxidáns védekező mechanizmusok szabályozásához, valamint a gombapatogenitási/virulencia faktorok és a kapcsolódó fehérjék interferenciájához kapcsolódnak. Az L-ornitin kettős funkcionalitása ígéretes jelöltté teszi a fehérpenész hatásának enyhítésére és a közönséges hüvelyes növények ezen erős gombakórokozóval szembeni rezisztenciájának fokozására irányuló fenntartható stratégiához. A jelenlegi tanulmány eredményei segíthetnek innovatív, környezetbarát módszerek kidolgozásában a fehérpenész elleni védekezésben és a hüvelyesek termelésére gyakorolt ​​hatásának enyhítésében.
Ebben a tanulmányban egy fogékony kereskedelmi forgalomban kapható közönséges babfajtát, a Giza 3-at (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) használtunk kísérleti anyagként. Az egészséges magokat az egyiptomi Szántóföldi Növények Kutatóintézetének (FCRI) Hüvelyeskutatási Osztálya, Mezőgazdasági Kutatóközpont (ARC) bocsátotta rendelkezésünkre. Öt magot vetettünk műanyag cserepekbe (belső átmérő 35 cm, mélység 50 cm), amelyeket S. sclerotiorum-mal fertőzött talajjal töltöttünk meg üvegházi körülmények között (25 ± 2 °C, relatív páratartalom 75 ± 1%, 8 óra fény/16 óra sötét). A vetés utáni 7-10. napon (DPS) a palántákat megritkítottuk, hogy cserépben csak két egyenletes növekedésű és három teljesen kifejlett levéllel rendelkező palánta maradjon. Minden cserepes növényt kéthetente öntöztünk, és havonta trágyáztunk az adott fajtára ajánlott mennyiségben.
Az 500 mg/l koncentrációjú L-ornitin-diamin (más néven (+)-(S)-2,5-diaminopentánsav; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Németország) előállításához 50 mg-ot először 100 ml steril desztillált vízben oldottunk fel. A törzsoldatot ezután hígítottuk, és felhasználtuk a későbbi kísérletekben. Röviden, hat L-ornitin koncentrációsorozatot (12,5, 25, 50, 75, 100 és 125 mg/l) teszteltünk in vitro. Ezenkívül negatív kontrollként (Mock) steril desztillált vizet, pozitív kontrollként pedig kereskedelmi forgalomban kapható „Rizolex-T” 50%-os nedvesíthető por (toklofosz-metil 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia kormányzóság, Egyiptom) gombaölő szert használtunk. A kereskedelmi forgalomban kapható „Rizolex-T” gombaölő szert in vitro öt koncentrációban (2, 4, 6, 8 és 10 mg/l) tesztelték.
A fehérpenész tipikus tüneteit mutató közönséges babszár- és hüvelymintákat (fertőzöttségi arány: 10–30%) kereskedelmi gazdaságokból gyűjtötték. Bár a fertőzött növényi anyagok nagy részét faj/fajta alapján azonosították (fogékony kereskedelmi fajta a Giza 3), mások, különösen a helyi piacokról beszerzettek, ismeretlen fajúak voltak. A begyűjtött fertőzött anyagokat először 0,5%-os nátrium-hipoklorit oldattal felületileg fertőtlenítették 3 percig, majd többször steril desztillált vízzel öblítették, és steril szűrőpapírral szárazra törölték a felesleges víz eltávolítása érdekében. A fertőzött szerveket ezután a középső szövetből (az egészséges és a fertőzött szövetek között) apró darabokra vágták, burgonya-dextróz agar (PDA) táptalajon tenyésztették, és 25 ± 2 °C-on, 12 óra fény/12 óra sötét ciklussal inkubálták 5 napig a szkleróciumok képződésének serkentése érdekében. A micéliumcsúcs módszert alkalmazták a gombaizolátumok tisztítására kevert vagy szennyezett tenyészetekből. A tisztított gombaizolátumot először tenyészeti morfológiai jellemzői alapján azonosították, majd mikroszkópos jellemzők alapján megerősítették, hogy S. sclerotiorum. Végül az összes tisztított izolátumot patogenitási vizsgálatnak vetették alá a fogékony Giza 3 közönséges babfajtán, hogy megfeleljenek Koch posztulátumainak.
Ezenkívül a leginvazívabb S. sclerotiorum izolátumot (3. izolátum) belső transzkripciós spacer (ITS) szekvenálás alapján is megerősítették, White és munkatársai (1990); Baturo-Ciesniewska és munkatársai (2017) által leírtak szerint. Röviden, az izolátumokat burgonya-dextróz táptalajban (PDB) tenyésztették, és 25 ± 2 °C-on inkubálták 5-7 napig. A gombamicéliumot ezután összegyűjtötték, sajtkendőn átszűrték, kétszer steril vízzel mosták, és steril szűrőpapíron szárították. A genomiális DNS-t a Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah és munkatársai, 2022, 2024) segítségével izolálták. Az ITS rDNS régiót ezután amplifikáltuk a specifikus ITS1/ITS4 primerpárral (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; várható méret: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). A tisztított PCR-termékeket szekvenálásra nyújtottuk be (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Az ITS rDNS szekvenciákat kétirányúan szekvenáltuk a Sanger szekvenálási módszerrel. Az összeállított lekérdezési szekvenciákat ezután összehasonlítottuk a GenBank és a National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) legfrissebb adataival a BLASTn szoftver segítségével. A lekérdezési szekvenciát 20 másik S. sclerotiorum törzzsel/izolátummal hasonlítottuk össze, amelyeket az NCBI GenBank legfrissebb adataiból (S1. kiegészítő táblázat) nyertünk ki a ClustalW segítségével a Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package-ben (MEGA-11; 11-es verzió) (Kumar et al., 2024). Az evolúciós elemzést a maximum likelihood módszerrel és az általános időreverzibilis nukleotidszubsztitúciós modellel (Nei és Kumar, 2000) végeztük. A legmagasabb log-likelihooddal rendelkező fa látható. A heurisztikus kereséshez használt kezdeti fát a szomszédos csatlakozási (NJ) fa (Kumar et al., 2024) és a maximális parsimónia (MP) fa közül a magasabb log-likelihooddal rendelkező fa kiválasztásával választottuk ki. Az NJ fát az általános időreverzibilis modell (Nei és Kumar, 2000) alapján számított páronkénti távolságmátrix segítségével állítottuk elő.
Az L-ornitin és a „Rizolex-T” baktériumölő szer antibakteriális aktivitását in vitro agar diffúziós módszerrel határoztuk meg. Módszer: Az L-ornitin törzsoldatából (500 mg/l) megfelelő mennyiségű oldatot alaposan összekeverünk 10 ml PDA táptalajjal, így 12,5, 25, 50, 75, 100 és 125 mg/l végső koncentrációjú oldatokat kapunk. Kontrollként öt koncentrációjú „Rizolex-T” gombaölő szert (2, 4, 6, 8 és 10 mg/l) és steril desztillált vizet használtunk. Miután a táptalaj megszilárdult, egy frissen készített, 4 mm átmérőjű Sclerotinia sclerotiorum tenyészetből álló micéliumdugót helyeztünk a Petri-csésze közepére, és 25±2°C-on tenyésztettük, amíg a micélium be nem borította a kontroll Petri-csészét, majd a gombanövekedést feljegyeztük. Az S. sclerotiorum radiális növekedésének százalékos gátlását az 1. egyenlettel számítsuk ki:
A kísérletet kétszer megismételtük, minden kontroll/kísérleti csoporthoz hat biológiai replikátummal és öt cserepekkel (cserepenként két növény). Minden biológiai replikátumot kétszer elemeztünk (két technikai replikátum) a kísérleti eredmények pontosságának, megbízhatóságának és reprodukálhatóságának biztosítása érdekében. Ezenkívül probit regresszióanalízist alkalmaztunk a fél-maximális gátló koncentráció (IC50) és az IC99 kiszámítására (Prentice, 1976).
Az L-ornitin üvegházi körülmények között kifejtett potenciáljának értékeléséhez két egymást követő tenyészetes kísérletet végeztek. Röviden, a cserepeket sterilizált agyag-homok talajjal (3:1) töltötték meg, és frissen készített S. sclerotiorum kultúrával oltották be. Először az S. sclerotiorum leginvazívabb izolátumát (3. izolátum) tenyésztették úgy, hogy egy szkleróciumot félbevágtak, lefelé fordítva egy PDA-ra helyezték, és 25°C-on, állandó sötétségben (24 órán át) inkubálták 4 napig a micélium növekedésének serkentése érdekében. Ezután négy 5 mm átmérőjű agardugót vettek ki az elülső széléről, és 100 g steril búza- és rizskorpa keverékkel (1:1, v/v) oltottak be, majd az összes lombikot 25 ± 2°C-on, 12 óra fény/12 óra sötét ciklus alatt inkubálták 5 napig a szkleróciumok képződésének serkentése érdekében. A lombikok tartalmát alaposan összekeverték a homogenitás biztosítása érdekében, mielőtt a talajt hozzáadták volna. Ezután minden cserepbe 100 g kolonizáló korpakeveréket adtunk, hogy biztosítsuk a kórokozók állandó koncentrációját. A beoltott cserepeket megöntöztük a gombanövekedés aktiválása érdekében, majd 7 napra üvegházi körülmények közé helyeztük.
Ezután minden cserépbe öt Giza 3 fajta magot vetettek. Az L-ornitinnel és a Rizolex-T gombaölő szerrel kezelt cserepek esetében a sterilizált magokat először két órán át áztatták a két vegyület vizes oldatában, amelynek végső IC99 koncentrációja körülbelül 250 mg/l, illetve 50 mg/l volt, majd vetés előtt egy órán át levegőn szárították. Másrészt a magokat negatív kontrollként steril desztillált vízben áztatták. 10 nap elteltével, az első öntözés előtt a palántákat megritkították, és cserépenként csak két tiszta palántát hagytak. Ezenkívül az S. sclerotiorum fertőzés biztosítása érdekében az azonos fejlődési szakaszban lévő (10 napos) babnövény szárakat két különböző helyen elvágták sterilizált szikével, és minden sebbe körülbelül 0,5 g kolonizáló korpakeveréket helyeztek, majd magas páratartalmat alkalmaztak a fertőzés és a betegség kialakulásának serkentésére az összes beoltott növényben. A kontrollnövényeket hasonlóképpen sebesítették meg, és azonos mennyiségű (0,5 g) steril, nem kolonizált korpakeveréket helyeztek a sebbe, majd magas páratartalom mellett tartották, hogy szimulálják a betegség kialakulásának környezetét és biztosítsák a kezelési csoportok közötti konzisztenciát.
Kezelési módszer: A babpalántákat 500 ml L-ornitin (250 mg/l) vizes oldatával vagy Rizolex-T (50 mg/l) gombaölő szerrel öntöztük a talaj öntözésével, majd a kezelést háromszor megismételtük 10 napos időközönként. A placebóval kezelt kontrollokat 500 ml steril desztillált vízzel öntöztük. Minden kezelést üvegházi körülmények között végeztünk (25 ± 2°C, 75 ± 1% relatív páratartalom és 8 óra fény/16 óra sötét fotoperiódus). Minden cserepet kéthetente öntöztünk, és havonta 3-4 g/l koncentrációjú, kiegyensúlyozott NPK műtrágyával (20-20-20, 3,6% kénnel és TE mikroelemekkel; Zain Seeds, Egyiptom) kezeltünk lombtrágyával, az adott fajtára vonatkozó ajánlások és a gyártó utasításai szerint. Eltérő rendelkezés hiányában, a teljesen kifejlődött, érett leveleket (felülről a 2. és 3. levél) minden biológiai replikátumból a kezelés után 72 órával (hpt) gyűjtöttük, homogenizáltuk, összegyűjtöttük és -80 °C-on tároltuk további elemzések céljából, beleértve, de nem kizárólagosan, az oxidatív stressz indikátorok in situ hisztokémiai lokalizációjának meghatározását, a lipidperoxidációt, az enzimatikus és nem enzimatikus antioxidánsokat és a génexpressziót.
A fehérpenész fertőzés intenzitását a beoltás utáni 21. napon (dpi) hetente értékelték 1–9-es skálán (S2. kiegészítő táblázat), a Teran és munkatársai (2006) által módosított Petzoldt és Dickson skála (1996) alapján. Röviden, a babnövények szárát és ágait a beoltás helyétől kezdve vizsgálták, hogy kövessék a léziók progresszióját az internódiumok és a csomók mentén. Ezután megmérték a lézió távolságát a beoltás helyétől a szár vagy ág legtávolabbi pontjáig, és a lézió helye alapján 1–9 pontszámot adtak, ahol (1) a beoltás helyének közelében látható fertőzés hiányát, a (2–9) pedig a lézió méretének fokozatos növekedését és a csomók/internódiumok mentén történő progressziót jelezte (S2. kiegészítő táblázat). A fehérpenész fertőzés intenzitását ezután a 2. képlettel százalékosra konvertálták:
Ezenkívül a betegségprogressziós görbe alatti területet (AUDPC) a következő képlettel számították ki (Shaner és Finney, 1977), amelyet nemrégiben adaptáltak a közönséges bab fehérrothadására (Chauhan et al., 2020) a 3. egyenlet segítségével:
Ahol Yi = a betegség súlyossága a ti időpontban, Yi+1 = a betegség súlyossága a következő ti+1 időpontban, ti = az első mérés időpontja (napokban), ti+1 = a következő mérés időpontja (napokban), n = az időpontok vagy megfigyelési pontok teljes száma. A babnövény növekedési paramétereit, beleértve a növénymagasságot (cm), az ágak számát növényenként és a levelek számát növényenként, hetente rögzítették 21 napon keresztül minden biológiai ismétlésben.
Minden biológiai ismétlésben a kezelés utáni 45. napon (az utolsó kezelés után 15 nappal) levélmintákat gyűjtöttek (felülről a második és harmadik teljesen kifejlett levél). Minden biológiai ismétlés öt cserepből állt (cserepenként két növény). A zúzott szövet körülbelül 500 mg-ját használták fel a fotoszintetikus pigmentek (klorofill a, klorofill b és karotinoidok) extrakciójához 80%-os acetonban, 4 °C-on, sötétben. 24 óra elteltével a mintákat centrifugálták, és a felülúszót összegyűjtötték a klorofill a, klorofill b és karotinoidok tartalmának kolorimetriás meghatározásához UV-160A spektrofotométerrel (Shimadzu Corporation, Japán) a (Lichtenthaler, 1987) leírt módszer szerint, az abszorbancia három különböző hullámhosszon (A470, A646 és A663 nm) történő mérésével. Végül a fotoszintetikus pigmentek tartalmát a Lichtenthaler (1987) által leírt 4-6. képletek segítségével számították ki.
A kezelés után 72 órával (hpt) minden biológiai replikátumból leveleket (felülről a második és harmadik teljesen kifejlett levelet) gyűjtöttünk a hidrogén-peroxid (H2O2) és a szuperoxid-anion (O2•−) in situ hisztokémiai lokalizációjának meghatározásához. Minden biológiai replikátum öt cserepből állt (cserepenként két növény). Minden biológiai replikátumot duplikátumban (két technikai replikátumban) elemeztünk a módszer pontosságának, megbízhatóságának és reprodukálhatóságának biztosítása érdekében. A H2O2-t 0,1%-os 3,3′-diaminobenzidinnel (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Németország), illetve nitrokéke tetrazóliummal (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Németország) határoztuk meg, Romero-Puertas és munkatársai (2004), illetve Adam és munkatársai (1989) által leírt módszereket követve, kisebb módosításokkal. A H2O2 in situ hisztokémiai lokalizációjához a levélkéket vákuumban infiltráltuk 0,1%-os DAB-bal 10 mM Tris-pufferben (pH 7,8), majd szobahőmérsékleten, fényben inkubáltuk 60 percig. A levélkéket 0,15%-os (v/v) TCA-ban 4:1 (v/v) etanol:kloroformban (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairó, Egyiptom) fehérítettük, majd fénynek tettük ki, amíg besötétedtek. Hasonlóképpen, a billentyűket vákuumban infiltráltuk 10 mM kálium-foszfát pufferrel (pH 7,8), amely 0,1 tömeg/v% HBT-t tartalmazott az O2•− in situ hisztokémiai lokalizációjához. A levélkéket 20 percig, szobahőmérsékleten, fényben inkubáltuk, majd a fentiek szerint fehérítettük, végül pedig megvilágítottuk, amíg sötétkék/ibolya foltok nem jelentek meg. A kapott barna (H₂O₂ indikátorként) vagy kékesibolya (O₂•− indikátorként) szín intenzitását az ImageJ képfeldolgozó csomag Fiji-szigeteki verziójával értékeltük (http://fiji.sc; hozzáférés: 2024. március 7.).
A malondialdehidet (MDA; a lipidperoxidáció markereként) Du és Bramlage (1992) módszere szerint határoztuk meg, kisebb módosításokkal. Minden biológiai replikátumból (a második és harmadik teljesen kifejlett levél felülről) leveleket gyűjtöttünk 72 órával a kezelés után (hpt). Minden biológiai replikátum öt cserepet tartalmazott (cserepenként két növény). Minden biológiai replikátumot duplikátumban (két technikai replikátumban) elemeztünk a módszer pontosságának, megbízhatóságának és reprodukálhatóságának biztosítása érdekében. Röviden, 0,5 g őrölt levélszövetet használtunk az MDA extrakciójához 20%-os triklórecetsavval (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA), amely 0,01% butilezett hidroxi-toluolt (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tartalmazott. A felülúszó MDA-tartalmát ezután kolorimetriásan határoztuk meg az abszorbancia 532 és 600 nm-en történő mérésével UV-160A spektrofotométerrel (Shimadzu Corporation, Japán), majd nmol g−1 FW-ben fejeztük ki.
A nem enzimatikus és enzimatikus antioxidánsok értékeléséhez a kezelés után 72 órával (hpt) minden biológiai replikátumból leveleket (felülről a második és harmadik teljesen kifejlett levelet) gyűjtöttünk. Minden biológiai replikátum öt cserepből állt (cserepenként két növény). Minden biológiai mintát duplikátumban elemeztünk (két technikai minta). Két levelet folyékony nitrogénnel őröltünk, és közvetlenül felhasználtuk az enzimatikus és nem enzimatikus antioxidánsok, az összes aminosav, a prolintartalom, a génexpresszió és az oxalát mennyiségi meghatározására.
Az összes oldható fenolos vegyület mennyiségét Folin-Ciocalteu reagenssel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) határoztuk meg, Kahkonen és munkatársai (1999) által leírt módszer kismértékű módosításával. Röviden, körülbelül 0,1 g homogenizált levélszövetet extraháltunk 20 ml 80%-os metanollal sötétben 24 órán át, majd a felülúszót centrifugálás után összegyűjtöttük. A mintakivonat 0,1 ml-ét 0,5 ml Folin-Ciocalteu reagenssel (10%) összekevertük, 30 másodpercig ráztuk, majd 5 percig sötétben hagytuk. Ezután 0,5 ml 20%-os nátrium-karbonát-oldatot (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairó, Egyiptom) adtunk minden csőhöz, alaposan összekevertük, és szobahőmérsékleten, sötétben inkubáltuk 1 órán át. Az inkubálás után a reakcióelegy abszorbanciáját 765 nm-en mértük UV-160A spektrofotométerrel (Shimadzu Corporation, Japán). A mintakivonatokban található összes oldható fenol koncentrációját gallussav kalibrációs görbével (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) határoztuk meg, és gallussav-ekvivalens milligrammjában, friss tömeg grammjára vonatkoztatva fejeztük ki (mg GAE g-1 friss tömeg).
A teljes oldható flavonoid-tartalmat Djeridane és munkatársai (2006) módszere szerint határoztuk meg, apró módosításokkal. Röviden, a fenti metanolos kivonat 0,3 ml-ét 0,3 ml 5%-os alumínium-klorid-oldattal (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) összekevertük, erőteljesen kevertük, majd szobahőmérsékleten 5 percig inkubáltuk, ezt követően 0,3 ml 10%-os kálium-acetát-oldatot (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairó, Egyiptom) adtunk hozzá, alaposan összekevertük, és szobahőmérsékleten 30 percig sötétben inkubáltuk. Az inkubáció után a reakcióelegy abszorbanciáját 430 nm-en mértük UV-160A spektrofotométerrel (Shimadzu Corporation, Japán). A mintakivonatokban található teljes oldható flavonoidok koncentrációját rutin kalibrációs görbével (TCI America, Portland, OR, USA) határoztuk meg, majd rutin-ekvivalens milligrammjában, friss tömeg grammjára vonatkoztatva fejeztük ki (mg RE g-1 friss tömeg).
A bablevelek teljes szabad aminosav-tartalmát módosított ninhidrin reagenssel (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) határoztuk meg, Yokoyama és Hiramatsu (2003) által javasolt, valamint Sun és munkatársai (2006) által módosított módszer alapján. Röviden, 0,1 g őrölt szövetet extraháltunk pH 5,4 pufferrel, és a felülúszó 200 μl-ét 200 μl ninhidrinnel (2%) és 200 μl piridinnel (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA) reagáltattuk, forrásban lévő vízfürdőben inkubáltuk 30 percig, majd lehűtöttük és 580 nm-en mértük UV-160A spektrofotométerrel (Shimadzu Corporation, Japán). Másrészt a prolint Bates-módszerrel határoztuk meg (Bates és munkatársai, 1973). A prolint 3%-os szulfoszalicilsavval (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) extraháltuk, majd centrifugálás után a felülúszó 0,5 ml-ét 1 ml jégecettel (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) és ninhidrin reagenssel összekevertük, 90°C-on 45 percig inkubáltuk, lehűtöttük, és 520 nm-en mértük ugyanazzal a spektrofotométerrel, mint fent. A levélkivonatokban található összes szabad aminosavat és prolint glicin, illetve prolin kalibrációs görbékkel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) határoztuk meg, és mg/g friss tömegben fejeztük ki.
Az antioxidáns enzimek enzimatikus aktivitásának meghatározásához körülbelül 500 mg homogenizált szövetet extraháltunk 3 ml 50 mM Tris pufferrel (pH 7,8), amely 1 mM EDTA-Na2-t (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) és 7,5% polivinil-pirrolidont (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tartalmazott, 10 000 × g-vel centrifugáltuk 20 percig hűtőszekrényben (4 °C), és a felülúszót (nyers enzimkivonat) összegyűjtöttük (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). A katalázt (CAT) ezután 2 ml 0,1 M nátrium-foszfát pufferrel (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) és 100 μl 269 mM H2O2 oldattal reagáltattuk, hogy meghatározzuk enzimaktivitását Aebi (1984) módszere szerint, apró módosításokkal (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). A guaiakol-függő peroxidáz (POX) enzimaktivitását Harrach et al. (2009) módszerével határoztuk meg. (2008) által leírt módszert alkalmaztuk kisebb módosításokkal (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023), és a polifenol-oxidáz (PPO) enzimaktivitását 2,2 ml 100 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH 6,0), 100 μl guaiacollal (TCI Chemicals, Portland, OR, USA) és 100 μl 12 mM H2O2-vel történő reakció után határoztuk meg. A módszer kismértékben módosított az (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) publikációból. A vizsgálatot 3 ml frissen elkészített katekol oldattal (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) 0,1 M foszfát pufferben (pH 6,0) történő reakció után végeztük. A CAT-aktivitást a H2O2 240 nm-en történő bomlásának monitorozásával (A240), a POX-aktivitást az abszorbancia 436 nm-en történő növekedésének monitorozásával (A436), a PPO-aktivitást pedig az abszorbancia-ingadozások 495 nm-en történő (A495) 30 másodpercenkénti, 3 perces rögzítésével mértük UV-160A spektrofotométer (Shimadzu, Japán) segítségével.
Valós idejű RT-PCR-t alkalmaztunk három antioxidánssal kapcsolatos gén, köztük a peroxiszomális kataláz (PvCAT1; GenBank hozzáférési szám: KF033307.1), a szuperoxid-diszmutáz (PvSOD; GenBank hozzáférési szám: XM_068639556.1) és a glutation-reduktáz (PvGR; GenBank hozzáférési szám: KY195009.1) transzkriptumszintjének kimutatására bablevelekben (felülről a második és harmadik teljesen kifejlett levélben) 72 órával az utolsó kezelés után. Röviden, az RNS-t a Simply P Total RNA Extraction Kit (Kat. szám: BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Kína) segítségével izoláltuk a gyártó protokollja szerint. Ezután a cDNS-t a TOP script™ cDNA Synthesis Kit segítségével szintetizáltuk a gyártó utasításai szerint. A fenti három gén primer szekvenciáit az S3. kiegészítő táblázat tartalmazza. A PvActin-3 (GenBank hozzáférési szám: XM_068616709.1) gént használtuk háztartási génként, és a relatív génexpressziót a 2-ΔΔCT módszerrel számítottuk ki (Livak és Schmittgen, 2001). Az aktin stabilitását biotikus stressz (a közönséges hüvelyesek és a Colletotrichum lindemuthianum antracnóz gomba közötti inkompatibilis kölcsönhatás) és abiotikus stressz (szárazság, sótartalom, alacsony hőmérséklet) alatt igazoltuk (Borges et al., 2012).
Kezdetben az S. sclerotiorum oxaloacetát-acetilhidroláz (OAH) fehérjéinek genomszintű in silico elemzését végeztük el a protein-protein BLAST eszközzel (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Röviden, az Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxid: 1191702; GenBank hozzáférési szám XP_040799428.1; 342 aminosav) és a Penicillium lagena (PlOAH; taxid: 94218; GenBank hozzáférési szám XP_056833920.1; 316 aminosav) OAH-ját használtuk lekérdező szekvenciaként az S. sclerotiorum homológ fehérjéjének (taxid: 5180) feltérképezéséhez. A BLASTp vizsgálatot a National Center for Biotechnology Information (NCBI) weboldalán található GenBank legfrissebb elérhető S. sclerotiorum genom adataival végezték el: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Ezenkívül az S. sclerotiorumból származó, jósolt OAH gént (SsOAH), valamint az A. fijiensis CBS 313.89 AfOAH és a P. lagena PlOAH evolúciós elemzését és filogenetikai fáját a MEGA11 maximum likelihood módszerével (Tamura et al., 2021) és a JTT mátrix alapú modellel (Jones et al., 1992) következtették ki. A filogenetikai fát az S. sclerotiorumból származó összes jósolt OAH gén (SsOAH) fehérjeszekvenciáinak többszörös illesztési elemzésével és a lekérdezési szekvenciával kombinálták a Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) segítségével (Papadopoulos és Agarwala, 2007). Ezenkívül az S. sclerotiorumból származó SsOAH legjobban illeszkedő aminosav-szekvenciáit a ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) segítségével illesztettük a lekérdezési szekvenciákhoz (AfOAH és PlOAH) (Larkin et al., 2007), és az illesztésben konzervált régiókat az ESPript eszközzel (3.0 verzió; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) vizualizáltuk.
Továbbá az S. sclerotiorum SsOAH feltételezett funkcionális reprezentatív doménjeit és konzervált helyeit interaktívan osztályozták különböző családokba az InterPro eszköz (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) segítségével (Blum et al., 2021). Végül a feltételezett S. sclerotiorum SsOAH háromdimenziós (3D) szerkezeti modellezését a Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 szerver 2.0 verzió; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) segítségével végezték el, és validálták a SWISS-MODEL szerver (https://swissmodel.expasy.org/) segítségével (Biasini et al., 2014). A jósolt háromdimenziós struktúrákat (PDB formátum) interaktívan vizualizáltuk az UCSF-Chimera csomag (1.15-ös verzió; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) segítségével (Pettersen et al., 2004).
Kvantitatív valós idejű fluoreszcens PCR-t alkalmaztunk az oxaloacetát-acetilhidroláz (SsOAH; GenBank hozzáférési szám: XM_001590428.1) transzkripciós szintjének meghatározására a Sclerotinia sclerotiorum micéliumában. Röviden, az S. sclerotiorumot PDB-t tartalmazó lombikba oltottuk, és rázóinkubátorba (modell: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) helyeztük 25 ± 2 °C-on 24 órán át 150 fordulat/perc sebességgel és állandó sötétségben (24 óra) a micélium növekedésének serkentése érdekében. Ezt követően a sejteket L-ornitinnel és Rizolex-T fungiciddel kezeltük végső IC50 koncentrációkban (körülbelül 40, illetve 3,2 mg/l), majd további 24 órán át azonos körülmények között tenyésztettük. Az inkubálás után a tenyészeteket 2500 fordulat/perc sebességgel 5 percig centrifugáltuk, és a felülúszót (gombamicélium) összegyűjtöttük génexpressziós analízishez. Hasonlóképpen, gombamicéliumot gyűjtöttek a fertőzés utáni 0., 24., 48., 72., 96. és 120. órában a fertőzött szövetek felületén fehérpenészt és vattaszerű micéliumot képző növényekből. A gombamicéliumból RNS-t vontak ki, majd a fent leírtak szerint cDNS-t szintetizáltak. Az SsOAH primer szekvenciáit az S3. kiegészítő táblázat tartalmazza. Az SsActin (GenBank hozzáférési szám: XM_001589919.1) volt a háztartási gén, és a relatív génexpressziót a 2-ΔΔCT módszerrel számították ki (Livak és Schmittgen, 2001).
Az oxálsav meghatározása burgonya-dextróz táptalajban (PDB) és a Sclerotinia sclerotiorum gombakórokozót tartalmazó növényi mintákban Xu és Zhang (2000) módszere szerint, kisebb módosításokkal történt. Röviden, az S. sclerotiorum izolátumokat PDB-t tartalmazó lombikokba oltották be, majd rázóinkubátorban (I2400 modell, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) tenyésztették 150 fordulat/perc sebességgel 25 ± 2 °C-on 3-5 napig állandó sötétségben (24 óra) a micélium növekedésének serkentése érdekében. Az inkubálás után a gombatenyészetet először Whatman #1 szűrőpapíron szűrték, majd 2500 fordulat/perc sebességgel 5 percig centrifugálták a maradék micélium eltávolítása érdekében. A felülúszót összegyűjtötték és 4 °C-on tárolták az oxalát további kvantitatív meghatározása céljából. A növényi minták előkészítéséhez körülbelül 0,1 g növényi szövettöredéket háromszor extraháltak desztillált vízzel (alkalmanként 2 ml). A mintákat ezután 2500 fordulat/perc sebességgel 5 percig centrifugáltuk, a felülúszót Whatman 1-es szűrőpapíron szárazon szűrtük, és további elemzés céljából összegyűjtöttük.
Az oxálsav kvantitatív analíziséhez a reakcióelegyet üvegdugós kémcsőben a következő sorrendben készítettük el: 0,2 ml minta (vagy PDB kultúra szűrlet vagy oxálsav standard oldat), 0,11 ml brómfenol kék (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml 1 M kénsav (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egyiptom) és 0,176 ml 100 mM kálium-dikromát (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), majd az oldatot desztillált vízzel 4,8 ml-re hígítottuk, erőteljesen összekevertük, és azonnal 60 °C-os vízfürdőbe helyeztük. 10 perc elteltével a reakciót 0,5 ml nátrium-hidroxid oldat (NaOH; 0,75 M) hozzáadásával állítottuk le. A reakcióelegy abszorbanciáját (A600) 600 nm-en mértük UV-160 spektrofotométerrel (Shimadzu Corporation, Japán). Kontrollként PDB-t és desztillált vizet használtunk a tenyészetszűrletek, illetve a növényi minták mennyiségi meghatározásához. A tenyészetszűrletek oxálsavkoncentrációját, mikrogramm oxálsav/milliliter PDB táptalajban (μg.mL−1), valamint a levélkivonatok oxálsavkoncentrációját, mikrogramm oxálsav/gramm friss tömegben (μg.g−1 FW), oxálsav kalibrációs görbével (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) határoztuk meg.
A vizsgálat során minden kísérletet teljesen randomizált elrendezésben (CRD) terveztünk, kezelésenként hat biológiai replikátummal és biológiai replikátumonként öt cserepekkel (cserepenként két növény), hacsak másképp nem jelezzük. A biológiai replikátumokat duplikátumban elemeztük (két technikai replikátum). Technikai replikátumokat használtunk ugyanazon kísérlet reprodukálhatóságának ellenőrzésére, de a statisztikai elemzésben nem használtuk fel a hamis replikációk elkerülése érdekében. Az adatokat statisztikailag varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük, majd Tukey-Kramer őszintén szignifikáns különbség (HSD) tesztet alkalmaztunk (p ≤ 0,05). In vitro kísérletek esetén az IC50 és IC99 értékeket probit modellel számítottuk ki, és 95%-os konfidencia intervallumokat számoltunk.
Összesen négy izolátumot gyűjtöttek különböző szójababföldekről az egyiptomi El Ghabiya kormányzóságban. PDA táptalajon minden izolátum krémesfehér micéliumot termelt, amely gyorsan vattaszerű fehérré változott (1A. ábra), majd a szklerócium stádiumban bézs vagy barna színűvé vált. A szkleróciumok általában sűrűek, fekete, gömb alakúak vagy szabálytalan alakúak, 5,2-7,7 mm hosszúak és 3,4-5,3 mm átmérőjűek (1B. ábra). Bár négy izolátum 10-12 napos, 25 ± 2 °C-on történő inkubálás után a táptalaj szélén szkleróciumok peremmintázatát fejlesztette ki (1A. ábra), a lemezenkénti szkleróciumok száma szignifikánsan különbözött közöttük (P < 0,001), a 3. izolátum rendelkezett a legtöbb szkleróciummal (32,33 ± 1,53 szklerócium lemezenként; 1C. ábra). Hasonlóképpen, a 3. izolátum több oxálsavat termelt a PDB-ben, mint más izolátumok (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; 1D. ábra). A 3. izolátum a fitopatogén Sclerotinia sclerotiorum gomba tipikus morfológiai és mikroszkópos jellemzőit mutatta. Például a PDA-n a 3. izolátum telepei gyorsan növekedtek, krémfehérek (1A. ábra), fordított bézs vagy világos lazacsárga-barna színűek voltak, és 6-7 napra volt szükségük 25 ± 2°C-on ahhoz, hogy teljesen befedjék egy 9 cm átmérőjű lemez felületét. A fenti morfológiai és mikroszkópos jellemzők alapján a 3. izolátumot Sclerotinia sclerotiorumként azonosították.
1. ábra. A közönséges hüvelyes növényekből származó S. sclerotiorum izolátumok jellemzői és patogenitása. (A) Négy S. sclerotiorum izolátum micéliumnövekedése PDA táptalajon, (B) négy S. sclerotiorum izolátum szkleróciumai, (C) szkleróciumok száma (lemezenként), (D) oxálsavszekréció PDB táptalajon (μg.mL−1), és (E) négy S. sclerotiorum izolátum betegségének súlyossága (%) fogékony kereskedelmi forgalomban kapható Giza 3 hüvelyes fajtán üvegházi körülmények között. Az értékek öt biológiai replikátum átlagát ± SD-t jelentik (n = 5). A különböző betűk a kezelések közötti statisztikailag szignifikáns különbségeket jelzik (p < 0,05). (F–H) A tipikus fehérpenész tünetek a föld feletti szárakon, illetve a becőleveleken jelentek meg a 3. izolátummal (dpi) történő beoltás után 10 nappal. (I) Az S. sclerotiorum 3. izolátum belső transzkripciós spacer (ITS) régiójának evolúciós elemzését a maximum likelihood módszerrel végeztük, és összehasonlítottuk a National Center for Biotechnology Information (NCBI) adatbázisából (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) származó 20 referencia izolátummal/törzzsel. A klaszterező vonalak feletti számok a régió lefedettségét (%), a klaszterező vonalak alatti számok pedig az ág hosszát jelzik.
Továbbá a patogenitás megerősítése érdekében négy kapott S. sclerotiorum izolátumot használtak a fogékony kereskedelmi forgalomban kapható Giza 3 babfajta üvegházi körülmények között történő beoltására, ami összhangban van Koch posztulátumaival (1E. ábra). Bár az összes kapott gombaizolátum patogén volt, és képes volt megfertőzni a zöldbabot (Giza 3 fajta), tipikus fehérpenész tüneteket okozva a növény összes föld feletti részén (1F. ábra), különösen a szárakon (1G. ábra) és a hüvelyeken (1H. ábra) a beoltás után 10 nappal (dpi), a 3. izolátum volt a legagresszívabb izolátum két független kísérletben. A 3. izolátum mutatta a legmagasabb betegségsúlyosságot (%) a babnövényeken (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 és 76,7 ± 3,1 a fertőzés utáni 7., 14. és 21. napon; 1F. ábra).
A leginvazívabb S. sclerotiorum 3. izolátum azonosítását belső transzkripciós spacer (ITS) szekvenálás alapján tovább igazolták (1I. ábra). A 3. izolátum és a 20 referencia izolátum/törzs filogenetikai elemzése nagyfokú hasonlóságot (>99%) mutatott közöttük. Érdemes megjegyezni, hogy az S. sclerotiorum 3. izolátum (533 bp) nagyfokú hasonlóságot mutat az amerikai, száraz borsómagokból izolált LPM36 S. sclerotiorum izolátummal (GenBank hozzáférési szám: MK896659.1; 540 bp) és a kínai, ibolya (Matthiola incana) szárrothadást okozó YKY211 S. sclerotiorum izolátummal (GenBank hozzáférési szám: OR206374.1; 548 bp), amelyek mindegyike külön csoportosítva látható a dendrogram tetején (1I. ábra). Az új szekvenciát letétbe helyezték az NCBI adatbázisban, és „Sclerotinia sclerotiorum – izolátum YN-25” névet kapott (GenBank hozzáférési szám: PV202792). Látható, hogy a 3-as izolátum a leginvazívabb izolátum; ezért ezt az izolátumot választottuk a további kísérletek céljára.
A diamin L-ornitin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Németország) antibakteriális aktivitását különböző koncentrációkban (12,5, 25, 50, 75, 100 és 125 mg/l) vizsgálták az S. sclerotiorum 3-as izolátumával szemben in vitro. Érdemes megjegyezni, hogy az L-ornitin antibakteriális hatást fejtett ki, és dózisfüggő módon fokozatosan gátolta az S. sclerotiorum hifagombák radiális növekedését (2A., B. ábra). A legmagasabb vizsgált koncentrációban (125 mg/l) az L-ornitin mutatta a legnagyobb micéliumnövekedés-gátlási arányt (99,62 ± 0,27%; 2B. ábra), amely egyenértékű volt a kereskedelmi forgalomban kapható Rizolex-T gombaölő szerrel (gátlási arány 99,45 ± 0,39%; 2C. ábra) a legmagasabb vizsgált koncentrációban (10 mg/l), ami hasonló hatékonyságra utal.
2. ábra. Az L-ornitin in vitro antibakteriális aktivitása Sclerotinia sclerotiorum ellen. (A) Különböző koncentrációjú L-ornitin antibakteriális aktivitásának összehasonlítása az S. sclerotiorum ellen a kereskedelmi forgalomban kapható Rizolex-T (10 mg/L) gombaölő szerrel. (B, C) Az S. sclerotiorum micéliumnövekedésének gátlási aránya (%) különböző koncentrációjú L-ornitinnel (12,5, 25, 50, 75, 100 és 125 mg/L), illetve Rizolex-T-vel (2, 4, 6, 8 és 10 mg/L) történő kezelés után. Az értékek öt biológiai replikátum átlagát ± SD-t jelentik (n = 5). A különböző betűk a kezelések közötti statisztikai különbségeket jelölik (p < 0,05). (D, E) Az L-ornitin és a kereskedelmi forgalomban kapható Rizolex-T gombaölő szer probit modell regresszióanalízise. A probit modell regressziós vonalát folytonos kék vonal, a konfidencia intervallumot (95%) pedig szaggatott piros vonal mutatja.
Ezenkívül probit regresszióanalízist végeztünk, és a megfelelő diagramokat az 1. táblázat és a 2D,E ábrák mutatják. Röviden, az L-ornitin elfogadható meredekségi értéke (y = 2,92x − 4,67) és a hozzá tartozó szignifikáns statisztikák (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 és p < 0,0001; 2D ábra) fokozott gombaellenes aktivitást mutatott az S. sclerotiorum ellen a kereskedelmi forgalomban kapható Rizolex-T gombaölő szerhez képest (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 és p < 0,0001) (1. táblázat).
1. táblázat. Az L-ornitin és a kereskedelmi forgalomban kapható „Rizolex-T” gombaölő szer fél-maximális gátlókoncentrációjának (IC50) és IC99 (mg/l) értékei S. sclerotiorum ellen.
Összességében az L-ornitin (250 mg/l) szignifikánsan csökkentette a fehérpenész kialakulását és súlyosságát a kezelt közönséges bab növényeken a kezeletlen S. sclerotiorum-mal fertőzött növényekhez képest (kontroll; 3A. ábra). Röviden, bár a kezeletlen, fertőzött kontroll növények betegségének súlyossága fokozatosan nőtt (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 és 92,33 ± 3,06%), az L-ornitin szignifikánsan csökkentette a betegség súlyosságát (%) a kísérlet során (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 és 26,36 ± 3,07) a kezelés utáni 7., 14. és 21. napon (3A. ábra). Hasonlóképpen, amikor az S. sclerotiorum-mal fertőzött babnövényeket 250 mg/L L-ornitinnel kezelték, a betegségprogressziós görbe alatti terület (AUDPC) a kezeletlen kontrollban 1274,33 ± 33,13-ról 281,03 ± 7,95-re csökkent, ami kissé alacsonyabb volt, mint a pozitív kontrollként használt 50 mg/L Rizolex-T gombaölő szer esetében (183,61 ± 7,71; 3B. ábra). Ugyanez a tendencia volt megfigyelhető a második kísérletben is.
3. ábra. Az L-ornitin exogén alkalmazásának hatása a Sclerotinia sclerotiorum által okozott fehérrothadás kialakulására a közönséges babban üvegházi körülmények között. (A) A közönséges bab fehérpenészének betegségprogressziós görbéje 250 mg/L L-ornitinnel történő kezelés után. (B) A közönséges bab fehérpenészének betegségprogressziós görbéje alatti terület (AUDPC) L-ornitinnel történő kezelés után. Az értékek öt biológiai ismétlés átlagát ± SD-t jelentik (n = 5). A különböző betűk a kezelések közötti statisztikailag szignifikáns különbségeket jelölik (p < 0,05).
A 250 mg/L L-ornitin exogén alkalmazása 42 nap elteltével fokozatosan növelte a növény magasságát (4A. ábra), az ágak számát növényenként (4B. ábra) és a levelek számát növényenként (4C. ábra). Míg a kereskedelmi forgalomban kapható Rizolex-T (50 mg/L) gombaölő szernek volt a legnagyobb hatása az összes vizsgált tápanyag-paraméterre, a 250 mg/L L-ornitin exogén alkalmazása a második legnagyobb hatást mutatta a kezeletlen kontrollokhoz képest (4A–C. ábra). Másrészt az L-ornitin kezelésnek nem volt szignifikáns hatása a fotoszintetikus pigmentek, a klorofill a (4D. ábra) és a klorofill b (4E. ábra) tartalmára, de kismértékben növelte a teljes karotinoid-tartalmat (0,56 ± 0,03 mg/g terméstömeg) a negatív kontrollhoz (0,44 ± 0,02 mg/g terméstömeg) és a pozitív kontrollhoz (0,46 ± 0,02 mg/g terméstömeg; 4F. ábra) képest. Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy az L-ornitin nem fitotoxikus a kezelt hüvelyesekre, sőt, akár serkentheti is azok növekedését.
4. ábra. Az exogén L-ornitin alkalmazás hatása a Sclerotinia sclerotiorummal fertőzött bablevelek növekedési jellemzőire és fotoszintetikus pigmentjeire üvegházi körülmények között. (A) Növénymagasság (cm), (B) Ágak száma növényenként, (C) Levelek száma növényenként, (D) Klorofill-a tartalom (mg g-1 tömegszázalék), (E) Klorofill-b tartalom (mg g-1 tömegszázalék), (F) Teljes karotinoid tartalom (mg g-1 tömegszázalék). Az értékek öt biológiai ismétlés átlagát ± SD-t jelentik (n = 5). A különböző betűk a kezelések közötti statisztikailag szignifikáns különbségeket jelzik (p < 0,05).
A reaktív oxigénfajták (ROS; hidrogén-peroxidként [H2O2] kifejezve) és a szabad gyökök (szuperoxid-anionként [O2•−] kifejezve) in situ hisztokémiai lokalizációja kimutatta, hogy az L-ornitin (250 mg/l) exogén alkalmazása szignifikánsan csökkentette a H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; 5A. ábra) és az O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; 5B. ábra) felhalmozódását mind a kezeletlen, fertőzött növények (173,31 ± 12,06, illetve 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW), mind a kereskedelmi forgalomban kapható Rizolex-T gombaölő szer 50 mg/l dózisával kezelt növények (170,12 ± 9,50, illetve 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt) felhalmozódásához képest 72 óra elteltével. A hpt alatt magas H2O2 és O2•− szint halmozódott fel (5A., B. ábra). Hasonlóképpen, a TCA-alapú malondialdehid (MDA) vizsgálat kimutatta, hogy az S. sclerotiorum-mal fertőzött babnövények leveleiben magasabb MDA-szint (113,48 ± 10,02 nmol.g/tömeg/tömeg) halmozódott fel (5C. ábra). Az L-ornitin exogén alkalmazása azonban jelentősen csökkentette a lipidperoxidációt, amit a kezelt növények MDA-tartalmának csökkenése is bizonyít (33,08 ± 4,00 nmol.g/tömeg/tömeg).
5. ábra. Az exogén L-ornitin alkalmazás hatása az oxidatív stressz és a nem enzimatikus antioxidáns védekező mechanizmusok főbb markereire S. sclerotiorum-mal fertőzött bablevelekben a fertőzés után 72 órával, üvegházi körülmények között. (A) Hidrogén-peroxid (H2O2; nmol g−1 FW) 72 hpt-nál, (B) szuperoxid-anion (O2•−; nmol g−1 FW) 72 hpt-nál, (C) malondialdehid (MDA; nmol g−1 FW) 72 hpt-nál, (D) összes oldható fenol (mg GAE g−1 FW) 72 hpt-nál, (E) összes oldható flavonoid (mg RE g−1 FW) 72 hpt-nál, (F) összes szabad aminosav (mg g−1 FW) 72 hpt-nál és (G) prolintartalom (mg g−1 FW) 72 hpt-nál. Az értékek 5 biológiai replikátum átlagát ± szórást (átlag ± SD) jelentik (n = 5). A különböző betűk a kezelések közötti statisztikailag szignifikáns különbségeket jelzik (p < 0,05).