Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozottan támogatja a CSS-t. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon egy frissített böngészőt (vagy kapcsolja ki a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Időközben a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
A nagy mennyiségű inzulin nanorészecskék (NP-k) különböző alkalmazásokat találtak különböző dózisformákban. Ez a munka a fagyasztva szárítási és porlasztva szárítási eljárások inzulinnal töltött kitozán nanorészecskék szerkezetére gyakorolt ​​hatását vizsgálja, mannittal, mint krioprotektánssal vagy anélkül. Ezen nanorészecskék minőségét is felmértük újraoldásukkal. Dehidratálás előtt a kitin/nátrium-tripolifoszfát/inzulin térhálósított nanorészecskék részecskeméretét 318 nm-re optimalizáltuk, a PDI-t 0,18-nak, a kapszulázási hatékonyságot 99,4%-nak, a töltetet pedig 25,01%-nak tekintettük. Feloldás után az összes nanorészecske, kivéve a mannit nélküli fagyasztva szárítási módszerrel előállítottakat, megtartotta gömb alakú részecskeszerkezetét. A mannitot tartalmazó, mindkét módszerrel dehidratált nanorészecskékhez képest a mannitmentes, porlasztva szárított nanorészecskék mutatták a legkisebb átlagos részecskeméretet (376 nm) és a legmagasabb töltetet (25,02%), szárítás esetén hasonló kapszulázási aránnyal (98,7%) és PDI-vel (0,20). vagy fagyasztva szárítási technikákkal. A mannit nélküli porlasztva szárítással szárított nanorészecskék eredményezték az inzulin leggyorsabb felszabadulását és a sejtek felvételének legnagyobb hatékonyságát. Ez a munka azt mutatja, hogy a porlasztva szárítás krioprotektánsok nélkül is képes dehidratálni az inzulin nanorészecskéket a hagyományos fagyasztva szárítási módszerekhez képest, ami nagyobb terhelési kapacitást, alacsonyabb adalékanyag-igényt és jelentős üzemeltetési költségeket eredményez.
1922-es felfedezése óta1,2,3 az inzulin és gyógyszerkészítményei megmentették az 1-es típusú cukorbetegségben (T1DM) és a 2-es típusú cukorbetegségben (T1DM) szenvedő betegek életét. Azonban, mivel nagy molekulatömegű fehérje, az inzulin könnyen aggregálódik, proteolitikus enzimek lebontják, és az első menetes metabolizmus révén eliminálódik. Az 1-es típusú cukorbetegséggel diagnosztizált embereknek életük végéig inzulininjekciókra van szükségük. Sok, kezdetben 2-es típusú cukorbetegséggel diagnosztizált betegnek hosszú távú inzulininjekciókra is szüksége van. A napi inzulininjekciók komoly mindennapi fájdalmat és kellemetlenséget okoznak ezeknek az embereknek, negatív hatással vannak a mentális egészségre. Ennek eredményeként az inzulinadagolás más, kevésbé kellemetlenséget okozó formáit, például az orális inzulinadagolást, széles körben tanulmányozzák,5 mivel ezek potenciálisan helyreállíthatják a világszerte körülbelül 5 milliárd cukorbeteg ember életminőségét.
A nanorészecske-technológia jelentős előrelépést hozott az orális inzulin bevitelére irányuló kísérletekben4,6,7. Olyan technológiát, amely hatékonyan magába foglalja és megvédi az inzulint a lebomlástól, hogy célzottan a test specifikus részeibe juthasson. A nanorészecske-készítmények alkalmazásának azonban számos korlátja van, főként a részecske-szuszpenziók stabilitási problémái miatt. Tárolás során némi aggregáció léphet fel, ami csökkenti az inzulinnal töltött nanorészecskék biohasznosulását8. Ezenkívül a nanorészecskék és az inzulin polimer mátrixának kémiai stabilitását is figyelembe kell venni az inzulin nanorészecskék (NP-k) stabilitásának biztosítása érdekében. Jelenleg a fagyasztva szárítási technológia az arany standard a stabil NP-k létrehozásában, miközben megakadályozza a tárolás során fellépő nem kívánt változásokat9.
A fagyasztva szárítás azonban krioprotektánsok hozzáadását igényli, hogy megakadályozzák az NP-k gömb alakú szerkezetének jégkristályok mechanikai feszültség általi befolyásolását. Ez jelentősen csökkenti az inzulin nanorészecskék terhelését a liofilizálás után, mivel a krioprotektáns a tömegarány nagy részét foglalja el. Ezért az előállított inzulin NP-k gyakran alkalmatlannak bizonyulnak száraz porkészítmények, például orális tabletták és orális filmek gyártására, mivel nagy mennyiségű száraz nanorészecskékre van szükség az inzulin terápiás ablakának eléréséhez.
A porlasztva szárítás egy jól ismert és olcsó ipari méretű eljárás száraz porok előállítására folyékony fázisokból a gyógyszeriparban10,11. A részecskeképződési folyamat feletti kontroll lehetővé teszi számos bioaktív vegyület megfelelő kapszulázását 12, 13. Továbbá hatékony technikává vált a kapszulázott fehérjék orális beadásra történő előállítására. A porlasztva szárítás során a víz nagyon gyorsan elpárolog, ami segít alacsonyan tartani a részecskemag hőmérsékletét 11,14, lehetővé téve alkalmazását hőérzékeny komponensek kapszulázására. A porlasztva szárítás előtt a bevonóanyagot alaposan homogenizálni kell a kapszulázott összetevőket tartalmazó oldattal 11,14. A fagyasztva szárítással ellentétben a porlasztva szárítás során a kapszulázás előtti homogenizálás javítja a kapszulázás hatékonyságát a dehidratálás során. Mivel a porlasztva szárításos kapszulázási eljárás nem igényel krioprotektánsokat, a porlasztva szárítás felhasználható nagy mennyiségű szárított NP előállítására.
Ez a tanulmány inzulinnal töltött NP-k előállítását ismerteti kitin és nátrium-tripolifoszfát térhálósításával iongél módszerrel. Az iongélesedés egy olyan előállítási módszer, amely lehetővé teszi nanorészecskék előállítását két vagy több ionos faj közötti elektrosztatikus kölcsönhatások révén bizonyos körülmények között. Mind a fagyasztva szárítási, mind a porlasztva szárítási technikákat alkalmazták az optimalizált kitin/nátrium-tripolifoszfát/inzulin térhálósított nanorészecskék dehidratálására. Dehidratálás után morfológiájukat SEM-mel elemezték. Rekombinációs képességüket méreteloszlásuk, felületi töltésük, PDI-jük, kapszulázási hatékonyságuk és betöltési tartalomuk mérésével értékelték. A különböző dehidratálási módszerekkel előállított újraoldott nanorészecskék minőségét az inzulinvédelem, a felszabadulási viselkedés és a sejtfelvételi hatékonyságuk összehasonlításával is értékelték.
A kevert oldat pH-ja, valamint a kitin és az inzulin aránya két kulcsfontosságú tényező, amelyek befolyásolják a végső NP-k részecskeméretét és kapszulázási hatékonyságát (EE), mivel közvetlenül befolyásolják az ionotrop gélesedési folyamatot. A kevert oldat pH-ja szorosan összefügg a részecskemérettel és a kapszulázási hatékonysággal (1a. ábra). Amint az 1a. ábrán látható, a pH 4,0-ről 6,0-ra emelkedésével az átlagos részecskeméret (nm) csökkent, és az EE jelentősen megnőtt, míg amikor a pH 6,5-re emelkedett, az átlagos részecskeméret növekedni kezdett, és az EE változatlan maradt. A kitin és az inzulin arányának növekedésével az átlagos részecskeméret is növekedett. Továbbá az EE-ben nem figyeltek meg változást, amikor a nanorészecskéket 2,5:1 (tömeg/tömeg)-nél nagyobb kitin/inzulin tömegarányban állították elő (1b. ábra). Ezért a vizsgálatban optimális előkészítési körülményeket (pH 6,0, kitin/inzulin tömegarány 2,5:1) alkalmazták az inzulinnal töltött nanorészecskék előállítására. nanorészecskék további vizsgálatok céljából. Ezen előkészítési körülmények között az inzulin nanorészecskék átlagos részecskeméretét 318 nm-re optimalizálták (1c. ábra), a PDI-t 0,18-nak, a beágyazási hatékonyságot 99,4%-nak, a zeta-potenciált 9,8 mV-nak, az inzulinterhelést pedig 25,01%-nak (m/m) mutatták. A transzmissziós elektronmikroszkópos (TEM) eredmények alapján az optimalizált nanorészecskék nagyjából gömb alakúak és diszkrétek voltak, viszonylag egyenletes méretűek (1d. ábra).
Az inzulin nanorészecskék paramétereinek optimalizálása: (a) a pH hatása az inzulin nanorészecskék átlagos átmérőjére és kapszulázási hatékonyságára (EE) (5:1 kitozán és inzulin tömegarány mellett előállítva); (b) a kitin és az inzulin tömegarányának hatása az inzulin NP-k átlagos átmérőjére és kapszulázási hatékonyságára (EE) (pH 6-on előállítva); (c) az optimalizált inzulin nanorészecskék részecskeméret-eloszlása; (d) az optimalizált inzulin NP-k TEM mikrográfja.
Közismert, hogy a kitin egy gyenge polielektrolit, amelynek pKa értéke 6,5. Savas közegben pozitív töltésű, mivel fő aminocsoportját hidrogénionok protonálják15. Ezért gyakran használják hordozóanyagként negatív töltésű makromolekulák kapszulázására. Ebben a vizsgálatban kitinnal kapszulázták az 5,3 izoelektromos pontú inzulint. Mivel a kitin bevonóanyagként használatos, arányának növekedésével a nanorészecskék külső rétegének vastagsága is növekszik, ami nagyobb átlagos részecskeméretet eredményez. Ezenkívül a kitozán magasabb szintje több inzulint képes kapszulázni. Esetünkben az EE (enyhe felszívódási sebesség) akkor volt a legmagasabb, amikor a kitin és az inzulin aránya elérte a 2,5:1 értéket, és az EE-ben nem volt szignifikáns változás, amikor az arány folyamatosan nőtt.
A kitin és az inzulin aránya mellett a pH is kulcsszerepet játszott az NP-k előállításában. Gan és munkatársai17 a pH hatását vizsgálták a kitin nanorészecskék részecskeméretére. Azt tapasztalták, hogy a részecskeméret folyamatosan csökkent, amíg a pH el nem érte a 6,0-as értéket, és a részecskeméret jelentős növekedését figyelték meg 6,0-nál nagyobb pH-értéknél, ami összhangban van a mi megfigyeléseinkkel. Ez a jelenség annak köszönhető, hogy a pH növekedésével az inzulin molekula negatív felületi töltésre tesz szert, ezáltal elősegítve az elektrosztatikus kölcsönhatásokat a kitin/nátrium-tripolifoszfát (TPP) komplexszel, ami kis részecskeméretet és magas EE-t eredményez. Amikor azonban a pH-t 6,5-re állították be, a kitin aminocsoportjai deprotonálódtak, ami kitin feltekeredéshez vezetett. Így a magas pH az aminoionok kisebb mértékű TPP-vel és inzulinnal való érintkezését eredményezi, ami alacsonyabb térhálósodást, nagyobb végső átlagos részecskeméretet és alacsonyabb EE-t eredményez.
A liofilizált és porlasztva szárított NP-k morfológiai tulajdonságainak elemzése segíthet a jobb dehidratálási és porképzési technikák kiválasztásában. Az előnyben részesített módszernek biztosítania kell a gyógyszerstabilitást, az egyenletes részecskealakot, a magas gyógyszerterhelést és a jó oldhatóságot az eredeti oldatban. Ebben a tanulmányban a két technika jobb összehasonlítása érdekében 1% mannitot tartalmazó vagy anélküli inzulin NP-ket használtak a dehidratálás során. A mannitot térfogatnövelő szerként vagy krioprotektánsként használják a liofilizáláshoz és porlasztva szárításhoz használt különféle száraz por készítményekben. A mannitot nem tartalmazó liofilizált inzulin nanorészecskék esetében, amint az a 2a. ábrán látható, pásztázó elektronmikroszkópia (SEM) alatt nagy, szabálytalan és érdes felületű, erősen porózus porszerkezetet figyeltek meg. A dehidratálás után a porban kevés különálló részecskét detektáltak (2e. ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a legtöbb NP lebomlott a krioprotektáns nélküli liofilizálás során. Az 1% mannitot tartalmazó liofilizált és porlasztva szárított inzulin nanorészecskék esetében sima felületű, gömb alakú nanorészecskéket figyeltek meg (2b, d, f, h. ábra). A mannitot nem tartalmazó porlasztva szárított inzulin nanorészecskék gömb alakúak maradtak, de a felületükön gyűröttek voltak. (2c. ábra). A gömb alakú és ráncos felületeket részletesebben tárgyaljuk az alábbi felszabadulási viselkedési és sejtfelvételi tesztekben. A szárított NP-k látható megjelenése alapján mind a mannit nélküli porlasztva szárított NP-k, mind a mannittal fagyasztva szárított és porlasztva szárított NP-k finom NP-porokat eredményeztek (2f., g., h. ábra). Minél nagyobb a részecskefelületek közötti felület, annál nagyobb az oldhatóság, és így annál nagyobb a felszabadulási sebesség.
Különböző dehidratált inzulin NP-k morfológiája: (a) Mannit nélküli liofilizált inzulin NP-k SEM képe; (b) Mannittal dúsított liofilizált inzulin NP-k SEM képe; (c) Mannit nélkül porlasztva szárított inzulin NP-k; (d) Mannittal porlasztva szárított inzulin NP-k SEM képe; (e) Mannit nélkül liofilizált inzulin NP-k por képe; (f) Mannittal dúsított liofilizált inzulin NP-k képe; (g) Mannit nélkül porlasztva szárított inzulin NP-k por képe; (h) Mannittal dúsított porlasztva szárított inzulin NP-k por képe.
Fagyasztva szárítás során a mannit krioprotektánsként működik, amorf formában tartja az NP-ket, és megakadályozza a jégkristályok okozta károsodást19. Ezzel szemben a porlasztva szárítás során nincs fagyasztási lépés. Ezért ebben a módszerben nincs szükség mannitra. Valójában a mannit nélküli porlasztva szárított NP-k finomabb NP-ket eredményeztek, a korábban leírtak szerint. A mannit azonban továbbra is töltőanyagként működhet a porlasztva szárítási folyamatban, így az NP-k gömbszerűbb szerkezetet kapnak20 (2d. ábra), ami segít az ilyen kapszulázott NP-k egyenletes felszabadulási viselkedésének elérésében. Ezenkívül egyértelmű, hogy néhány nagy részecske kimutatható mind a liofilizált, mind a mannitot tartalmazó porlasztva szárított inzulin NP-kben (2b., d. ábra), ami a mannitnak a kapszulázott inzulinnal együtt a részecskemagban való felhalmozódásának tudható be. Kitozán réteg. Érdemes megjegyezni, hogy ebben a tanulmányban a gömb alakú szerkezet dehidratálás utáni épségének biztosítása érdekében a mannit és a kitin arányát 5:1 értéken tartották, így a nagy mennyiségű töltőanyag is növelheti a szárított NP-k részecskeméretét.
Fourier-transzformációs infravörös gyengített teljes reflexiós (FTIR-ATR) spektroszkópiával jellemezték a szabad inzulin, kitozán, kitozán, TPP és inzulin fizikai keverékét. Az összes dehidratált NP-t FTIR-ATR spektroszkópiával jellemezték. Figyelemre méltó, hogy a mannittal liofilizált kapszulázott NP-kben, valamint a mannittal és anélkül porlasztva szárított NP-kben 1641, 1543 és 1412 cm⁻¹ sávintenzitást figyeltek meg (3. ábra). Amint azt korábban közölték, ezek az erősségnövekedések a kitin, a TPP és az inzulin közötti térhálósodással voltak összefüggésben. A kitin és az inzulin közötti kölcsönhatás vizsgálata azt mutatta, hogy az inzulinnal töltött kitin nanorészecskék FTIR spektrumában a kitin sávja átfedésben volt az inzulin sávjával, növelve a karbonil intenzitás (1641 cm⁻¹) és az amin intenzitás (1543 cm⁻¹) sávot. A TPP tripolifoszfát-csoportjai a kitin ammóniumcsoportjaihoz kapcsolódnak, 1412 cm⁻¹-nél egy sávot alkotva.
Szabad inzulin, kitin, kitin/TPP/inzulin fizikai keverékeinek és különböző módszerekkel dehidratált NP-k FTIR-ATR spektrumai.
Továbbá ezek az eredmények összhangban vannak az SEM-en bemutatott eredményekkel, amelyek azt mutatták, hogy a kapszulázott NP-k mind mannitolos permetezés, mind liofilizálás után intakt maradtak, de mannit hiányában csak a porlasztva szárítás eredményezett kapszulázott részecskéket. Ezzel szemben a mannit nélkül liofilizált NP-k FTIR-ATR spektrális eredményei nagyon hasonlóak voltak a kitin, TPP és inzulin fizikai keverékéhez. Ez az eredmény azt jelzi, hogy a kitin, a TPP és az inzulin közötti keresztkötések már nincsenek jelen a mannit nélkül liofilizált NP-kban. Az NP-k szerkezete a krioprotektáns nélküli liofilizálás során megsemmisült, ami az SEM-eredményekben is látható (2a. ábra). A dehidratált inzulin NP-k morfológiája és FTIR-eredményei alapján csak liofilizált, porlasztva szárított és mannitmentes NP-ket használtunk a rekonstitúciós kísérletekhez, és mannitmentes NP-ket a mannitmentes NP-k dehidratálás során történő bomlása miatt. megvitatjuk.
A dehidratációt hosszú távú tárolásra és más készítményekké történő újrafeldolgozásra alkalmazzák. A száraz NP-k tárolás utáni regenerálódási képessége kritikus fontosságú a különböző készítményekben, például tablettákban és filmekben való felhasználásuk szempontjából. Észrevettük, hogy a mannit hiányában porlasztva szárított inzulin NP-k átlagos részecskemérete csak kis mértékben nőtt a feloldás után. Másrészt a mannitot tartalmazó porlasztva szárított és liofilizált inzulin nanorészecskék részecskemérete jelentősen megnőtt (1. táblázat). A PDI és az EE nem változott szignifikánsan (p > 0,05) az összes NP rekombinációja után ebben a vizsgálatban (1. táblázat). Ez az eredmény azt jelzi, hogy a részecskék többsége érintetlen maradt az újrafeloldás után. A mannit hozzáadása azonban a liofilizált és porlasztva szárított mannit nanorészecskék inzulintartalmának nagymértékű csökkenését eredményezte (1. táblázat). Ezzel szemben a mannit nélkül porlasztva szárított NP-k inzulintartalma változatlan maradt, mint korábban (1. táblázat).
Közismert, hogy a nanorészecskék mennyisége kritikus fontosságú gyógyszeradagolási célokra. Alacsony koncentrációjú NP-k esetén nagyon nagy mennyiségű anyagra van szükség a terápiás küszöb eléréséhez. Az ilyen magas NP-koncentrációk magas viszkozitása azonban kényelmetlenségekhez és nehézségekhez vezet az orális adagolás, illetve az injektálható készítmények esetében 22. Ezenkívül az inzulin alapú NP-k tabletták és viszkózus biofilmek előállítására is használhatók 23, 24, ami nagy mennyiségű NP alkalmazását igényli alacsony koncentrációban, ami nagy tablettákat és vastag biofilmeket eredményez, amelyek nem alkalmasak orális alkalmazásra. Ezért a magas inzulintartalmú dehidratált NP-k nagyon kívánatosak. Eredményeink arra utalnak, hogy a mannitmentes, porlasztva szárított NP-k magas inzulintartalma számos vonzó előnyt kínálhat ezeknél az alternatív adagolási módoknál.
Minden dehidratált NP-t három hónapig hűtőszekrényben tároltak. A SEM eredmények azt mutatták, hogy a dehidratált NP-k morfológiája nem változott szignifikánsan a három hónapos tárolás során (4. ábra). Vízben való feloldás után minden NP enyhe EE-csökkenést mutatott, és körülbelül kis mennyiségű (~5%) inzulint szabadított fel a három hónapos tárolási időszak alatt (2. táblázat). Az összes nanorészecskék átlagos részecskemérete azonban nőtt. A mannit nélkül porlasztva szárított NP-k részecskemérete 525 nm-re nőtt, míg a mannittal porlasztva szárított és fagyasztva szárított NP-k mérete 872, illetve 921 nm-re nőtt (2. táblázat).
Különböző, három hónapig tárolt dehidratált inzulin NP-k morfológiája: (a) liofilizált inzulin NP-k pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képe mannittal; (b) porlasztva szárított inzulin nanorészecskék pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képe mannit nélkül; (c) porlasztva szárított inzulin NP-k pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képei mannit nélkül.
Továbbá kicsapódásokat figyeltek meg a mannittal porlasztva szárított és liofilizált, rekonstituált inzulin nanorészecskékben (S2. ábra). Ezt okozhatja, hogy a nagy részecskék nem szuszpendálódnak megfelelően a vízben. A fenti eredmények azt mutatják, hogy a porlasztva szárítási technika megvédi az inzulin nanorészecskéket a kiszáradástól, és hogy nagy mennyiségű inzulin nanorészecskék nyerhetők töltőanyagok vagy krioprotektánsok nélkül.
Az inzulinretenciót pH = 2,5 táptalajban tesztelték pepszinnel, tripszinnel és α-kimotripszinnel, hogy bemutassák az NP-k védőképességét az enzimatikus emésztéssel szemben dehidratálás után. A dehidratált NP-k inzulinretencióját összehasonlították a frissen elkészített NP-kéval, és a szabad inzulint használták negatív kontrollként. Ebben a vizsgálatban a szabad inzulin mindhárom enzimes kezelésben gyors inzulin eliminációt mutatott 4 órán belül (5a-c. ábra). Ezzel szemben a mannittal fagyasztva szárított NP-k és a mannittal vagy anélkül porlasztva szárított NP-k inzulineliminációs vizsgálata szignifikánsan nagyobb védelmet mutatott ezen NP-k enzimatikus emésztéssel szemben, ami hasonló volt a frissen elkészített inzulin NP-kéhez (1. ábra). 5a-c). A pepszinben, tripszinben és α-kimotripszinben lévő nanorészecskék segítségével az inzulin több mint 50%, 60% és 75%-a védhető meg 4 órán belül (5a-c. ábra). Ez az inzulinvédő képesség növelheti az inzulin véráramba jutásának nagyobb esélyét25. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a porlasztva szárítás vagy mannit nélkül, és a mannittal történő liofilizálás megőrizheti az NP-k inzulinvédő képességét dehidratáció után.
Dehidratált inzulin NP-k védelme és felszabadulása: (a) inzulin védelme pepszinoldatban; (b) inzulin védelme tripszinoldatban; (c) inzulin védelme α-kimotripszin oldattal; (d) Dehidratált NP-k felszabadulásának viselkedése pH = 2,5 oldatban; (e) Dehidratált NP-k felszabadulásának viselkedése pH = 6,6 oldatban; (f) Dehidratált NP-k felszabadulásának viselkedése pH = 7,0 oldatban.
Frissen elkészített és feloldott száraz inzulin NP-ket inkubáltunk különböző pufferekben (pH = 2,5, 6,6, 7,0) 37 °C-on, szimulálva a gyomor, a nyombél és a vékonybél felső részének pH-környezetét, hogy megvizsgáljuk az inzulin hatását az inzulinrezisztenciára. Felszabadulási viselkedés különböző környezetekben. A gyomor-bél traktus töredéke. pH = 2,5 értéken az inzulinnal töltött NP-k és az újraoldott száraz inzulin NP-k kezdeti robbanásszerű felszabadulást mutattak az első egy órán belül, majd a következő 5 órában lassú felszabadulást (5d. ábra). Ez a gyors felszabadulás a kezdetben valószínűleg a részecske belső szerkezetében nem teljesen immobilizált fehérjemolekulák gyors felületi deszorpciójának eredménye. pH = 6,5 értéken az inzulinnal töltött NP-k és az újraoldott száraz inzulin NP-k sima és lassú felszabadulást mutattak 6 óra alatt, mivel a tesztoldat pH-ja hasonló volt az NP-kkel készített oldat pH-jához (5e. ábra). pH = 7 értéken az NP-k instabilak voltak, és az első két órán belül szinte teljesen lebomlottak (5f. ábra). Ez azért van, mert a kitin deprotonációja magasabb pH-n történik, ami kevésbé kompakt polimer hálózatot és töltött inzulin felszabadulását eredményezi.
Továbbá a mannit nélkül porlasztva szárított inzulin NP-k gyorsabb felszabadulási profilt mutattak, mint a többi dehidratált NP (5d–f. ábra). Amint azt korábban leírtuk, a mannit nélkül szárított, rekonstituált inzulin NP-k mutatták a legkisebb részecskeméretet. A kis részecskék nagyobb felületet biztosítanak, így a releváns gyógyszer nagy része a részecske felületén vagy annak közelében lesz, ami gyors gyógyszerfelszabadulást eredményez26.
Az NP-k citotoxicitását MTT assay-vel vizsgálták. Amint az S4. ábrán látható, az összes dehidratált NP-nek nem volt szignifikáns hatása a sejtek életképességére 50–500 μg/ml koncentrációban, ami arra utal, hogy minden dehidratált NP biztonságosan használható a terápiás ablak eléréséhez.
A máj a fő szerv, amelyen keresztül az inzulin kifejti fiziológiai funkcióit. A HepG2 sejtek egy humán hepatóma sejtvonal, amelyet gyakran használnak in vitro hepatocita felvételi modellként. Itt HepG2 sejteket használtak a fagyasztva szárítási és porlasztva szárítási módszerekkel dehidratált NP-k sejtfelvételének felmérésére. A sejtfelvételt konfokális lézerszkenneléssel, áramlási citometriával és látásvizsgálattal mérték, több órás inkubációt követően szabad FITC inzulinnal 25 μg/ml koncentrációban, frissen elkészített FITC inzulinnal töltött NP-kkel és dehidratált FITC inzulinnal töltött NP-kkel azonos inzulinkoncentrációk mellett. Kvantitatív mikroszkópos (CLSM) megfigyeléseket végeztek. A mannit nélküli liofilizált NP-k a dehidratáció során elpusztultak, és ebben a tesztben nem értékelték őket. A frissen elkészített inzulinnal töltött NP-k, a mannittal ellátott liofilizált NP-k és a mannittal és anélküli porlasztva szárított NP-k (6a. ábra) intracelluláris fluoreszcencia-intenzitása 4,3-szor, 2,6-szor, 2,4-szer és 4,1-szer magasabb volt, mint a szabad NP-k esetében. A FITC-inzulin csoportban (6b. ábra) Az eredmények arra utalnak, hogy a kapszulázott inzulin hatékonyabb a sejtek felvételében, mint a szabad inzulin, főként a vizsgálatban előállított, inzulinnal töltött nanorészecskék kisebb mérete miatt.
HepG2 sejtek felvétele 4 órás inkubáció után frissen elkészített NP-kkel és dehidratált NP-kkel: (a) A FITC-inzulin felvételének eloszlása ​​HepG2 sejtek által. (b) A fluoreszcencia intenzitások geometriai átlaga áramlási citometriával elemezve (n = 3), *P < 0,05 a szabad inzulinhoz képest.
Hasonlóképpen, a CLSM képek azt mutatták, hogy a frissen elkészített, FITC-inzulinnal töltött NP-k és a FITC-inzulinnal töltött, porlasztva szárított NP-k (mannit nélkül) FITC fluoreszcencia intenzitása sokkal erősebb volt, mint a többi mintáé (6a. ábra). Továbbá, a mannit hozzáadásával az oldat nagyobb viszkozitása növelte a sejtfelvétellel szembeni ellenállást, ami az inzulin proliferáció csökkenéséhez vezetett. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a mannitmentes, porlasztva szárított NP-k mutatták a legnagyobb sejtfelvételi hatékonyságot, mivel részecskeméretük kisebb volt, mint a fagyasztva szárított NP-ké az újraoldás után.
A kitin (átlagos molekulatömeg 100 kDa, 75–85%-ban dezacetilezett) a Sigma-Aldrich-tól (Oakville, Ontario, Kanada) származott. A nátrium-tripolifoszfátot (TPP) a VWR-től (Radnor, Pennsylvania, USA) szereztük be. A vizsgálatban használt rekombináns humán inzulin a Fisher Scientific-től (Waltham, MA, USA) származott. A fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC) jelölt humán inzulint és a 4',6-diamidino-2-fenilindol-dihidrokloridot (DAPI) a Sigma-Aldrich-tól (Oakville, Ontario, Kanada) szereztük be. A HepG2 sejtvonalat az ATCC-től (Manassas, Virginia, USA) szereztük be. Minden más reagens analitikai vagy kromatográfiás minőségű volt.
Készítsen 1 mg/ml koncentrációjú CS-oldatot úgy, hogy kétszer desztillált vízben (DD víz) oldja fel, amely 0,1% ecetsavat tartalmaz. Készítsen 1 mg/ml koncentrációjú TPP- és inzulinoldatot úgy, hogy ezeket DD vízben, illetve 0,1% ecetsavban oldja fel. Az előemulziót egy polytron PCU-2-110 nagy sebességű homogenizátorral (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA) készítette el. Az előállítási folyamat a következő: először 2 ml TPP-oldatot adnak 4 ml inzulinoldathoz, és az elegyet 30 percig keverik, majd teljesen összekeverik. Ezután az összekevert oldatot fecskendőn keresztül, nagy sebességű keverés (10 000 fordulat/perc) közben cseppenként adják a CS-oldathoz. Az elegyeket nagy sebességű keverés (15 000 fordulat/perc) alatt tartották jégfürdőben 30 percig, majd egy bizonyos pH-értékre állították be, hogy térhálósított inzulin NP-ket kapjanak. Az inzulin NP-k további homogenizálása és részecskeméretének csökkentése érdekében további 30 percig ultrahanggal kezelték őket... jégfürdő szonda típusú ultrahangos készülékkel (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Németország).
Az inzulin NPS-eket Z-átlag átmérő, polidiszperzitási index (PDI) és zeta potenciál szempontjából teszteltük dinamikus fényszórás (DLS) mérésekkel, Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Ausztria) készülékkel, DD vízben hígítva 25°C-on. A morfológiát és a méreteloszlást Hitachi H7600 transzmissziós elektronmikroszkóppal (TEM) (Hitachi, Tokió, Japán) jellemeztük, majd a képeket Hitachi képalkotó szoftverrel (Hitachi, Tokió, Japán) elemeztük. Az inzulin NP-k kapszulázási hatékonyságának (EE) és betöltési kapacitásának (LC) felméréséhez az NP-ket 100 kDa molekulatömeg-határértékű ultrafiltrációs csövekbe pipettáztuk, és 500 xg-vel centrifugáltuk 30 percig. A szűrletben lévő nem kapszulázott inzulin mennyiségét Agilent 1100 sorozatú HPLC rendszerrel (Agilent, Santa Clara, Kalifornia, USA) határoztuk meg, amely kvaterner pumpából, automata mintavevőből, oszlopmelegítőből és DAD detektorból állt. Az inzulint C18 oszlopon elemeztük. (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) és 214 nm-en detektálva. A mozgófázis acetonitril és víz volt, 0,1% TFA-t tartalmazva, gradiensarányok 10/90-től 100/0-ig, és 10 percig futtatva. A mozgófázist 1,0 ml/perc áramlási sebességgel pumpálták. Az oszlop hőmérsékletét 20 °C-ra állították be. Az EE és LC százalékos arányát az (1) és (2) egyenletek segítségével számították ki.
Az inzulin NP optimalizálása érdekében különböző, 2,0 és 4,0 közötti CS/inzulin arányokat teszteltek. Az elkészítés során különböző mennyiségű CS-oldatot adtak hozzá, miközben az inzulin/TPP keveréket állandó értéken tartották. Az inzulin NP-ket 4,0 és 6,5 közötti pH-tartományban állították elő, az összes oldat (inzulin, TPP és CS) hozzáadása után gondosan szabályozva a keverék pH-ját. Az inzulin nanorészecskék EE-jét és részecskeméretét különböző pH-értékek és CS/inzulin tömegarányok mellett értékelték az inzulin NP-k képződésének optimalizálása érdekében.
Az optimalizált inzulin NP-ket alumínium tartályra helyezték, és szövettel fedték le, majd ragasztószalaggal rögzítették. Ezt követően a csavaros tartályokat egy tálcás szárítóval felszerelt Labconco FreeZone fagyasztva szárítóba (Labconco, Kansas City, MO, USA) helyezték. A hőmérsékletet és a vákuumnyomást az első 2 órában -10 °C-ra és 0,350 Torr-ra, a fennmaradó 22 órában pedig 0 °C-ra és 0,120 Torr-ra állították be a száraz inzulin NP-k előállításához.
A kapszulázott inzulin előállításához Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Svájc) készüléket használtunk. A kiválasztott szárítási paraméterek a következők voltak: hőmérséklet 100 °C, betáplálási sebesség 3 l/perc és gázáramlás 4 l/perc.
A dehidratáció előtti és utáni inzulin NP-ket FTIR-ATR spektroszkópiával jellemeztük. A dehidratált nanorészecskéket, valamint a szabad inzulint és a kitint Spectrum 100 FTIR spektrofotométerrel (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) elemeztük, amely univerzális ATR mintavételi tartozékkal (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) volt felszerelve. A jelátlagokat 16 szkennelésből kaptuk 4 cm2 felbontással, 4000-600 cm2 frekvenciatartományban.
A száraz inzulin NP-k morfológiáját liofilizált és porlasztva szárított inzulin NP-k SEM képeivel értékeltük, melyeket Helios NanoLab 650 fókuszált ionsugaras pásztázó elektronmikroszkóppal (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA) rögzítettünk. A fő használt paraméter 5 keV feszültség és 30 mA áramerősség volt.
Minden dehidratált inzulin NP-t újra feloldottak dl vízben. A részecskeméretet, a PDI-t, az EE-t és az LC-t ismét tesztelték a korábban említett módszerrel, hogy felmérjék a dehidratálás utáni minőségüket. Az anhidroinzulin NP-k stabilitását a hosszabb tárolás utáni NP-tulajdonságok tesztelésével is mérték. Ebben a vizsgálatban a dehidratált összes NP-t három hónapig hűtőszekrényben tárolták. Három hónapos tárolás után az NP-ket morfológiai részecskeméret, PDI, EE és LC szempontjából tesztelték.
Oldjon fel 5 ml feloldott NP-t 45 ml szimulált gyomornedvben (pH 1,2, 1% pepszin tartalommal), bélnedvben (pH 6,8, 1% tripszin tartalommal) vagy kimotripszin oldatban (100 g/ml, foszfátpufferben, pH 7,8), hogy kiértékelje az inzulin NP-k védelmében való hatékonyságát dehidratáció után. Az oldatokat 37°C-on, 100 fordulat/perc keverési sebességgel inkubálta. Az oldatból 500 μl-t gyűjtött különböző időpontokban, és az inzulinkoncentrációt HPLC-vel határozta meg.
A frissen elkészített és dehidratált inzulin NP-k in vitro felszabadulási viselkedését dialíziszsákos módszerrel teszteltük (molekulatömeg-határérték 100 kDa, Spectra Por Inc.). A frissen elkészített és feloldott száraz NP-ket pH 2,5, pH 6,6 és pH 7,0 értékű folyadékokban (0,1 M foszfáttal pufferolt sóoldat, PBS) dializáltuk, hogy szimuláljuk a gyomor, a nyombél és a felső vékonybél pH-környezetét. Minden mintát 37 °C-on inkubáltunk folyamatos rázatás mellett 200 fordulat/perc sebességgel. A folyadékot az 5 ml-es dialíziszsákból a következő időpontokban szívjuk ki: 0,5, 1, 2, 3, 4 és 6 óra, majd azonnal töltsük fel a térfogatot friss dializátummal. A folyadék inzulinszennyeződését HPLC-vel elemeztük, és a nanorészecskékből felszabaduló inzulin sebességét a felszabaduló szabad inzulin és a nanorészecskékbe kapszulázott teljes inzulin arányából számítottuk ki (3. egyenlet).
Humán hepatocelluláris karcinóma sejtvonal A HepG2 sejteket 60 mm átmérőjű tenyészetekben tenyésztették Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalajban (DMEM), amely 10% magzati szarvasmarha-szérumot, 100 NE/ml penicillint és 100 μg/ml sztreptomicint29 tartalmazott. A tenyészeteket 37°C-on, 95% relatív páratartalom és 5% CO2 mellett tartották. A felvételi vizsgálatokhoz a HepG2 sejteket 1 × 105 sejt/ml koncentrációban oltották egy 8 lyukú Nunc Lab-Tek kamrás tárgylemezes rendszerre (Thermo Fisher, NY, USA). A citotoxicitási vizsgálatokhoz a sejteket 96 lyukú lemezekre (Corning, NY, USA) oltották 5 × 104 sejt/ml sűrűséggel.
Az MTT assay-t frissen elkészített és dehidratált inzulin NP-k citotoxicitásának értékelésére használták30. A HepG2 sejteket 96-lyukú lemezekre oltották 5 × 104 sejt/ml sűrűséggel, és a vizsgálat előtt 7 napig tenyésztették. Az inzulin NP-ket különböző koncentrációkra (50-500 μg/ml) hígították táptalajban, majd beadták a sejteknek. 24 órás inkubáció után a sejteket háromszor mosták PBS-sel, majd további 4 órán át 0,5 mg/ml MTT-t tartalmazó táptalajban inkubálták. A citotoxicitást a sárga tetrazólium-MTT lila formazánná történő enzimatikus redukciójának mérésével értékelték 570 nm-en, Tecan infinite M200 pro spektrofotométer lemezleolvasóval (Tecan, Männedorf, Svájc).
Az NP-k sejtfelvételi hatékonyságát konfokális lézer pásztázó mikroszkópiával és áramlási citometriás analízissel tesztelték. A Nunc Lab-Tek kamrás tárgylemez-rendszer minden egyes kútját szabad FITC-inzulinnal, FITC-inzulinnal töltött NP-kkel és 25 μg/ml dehidratált FITC-inzulin NP-kkel kezelték azonos koncentrációban, majd 4 órán át inkubálták. A sejteket háromszor mosták PBS-sel, és 4%-os paraformaldehiddel fixálták. A sejtmagokat 4',6-diamidino-2-fenilindollal (DAPI) festették. Az inzulin lokalizációját Olympus FV1000 lézer pásztázó/kétfoton konfokális mikroszkóppal (Olympus, Shinjuku City, Tokió, Japán) figyelték meg. Az áramlási citometriás analízishez azonos koncentrációjú, 10 μg/ml szabad FITC-inzulint, FITC-inzulinnal töltött NP-ket és újraoldott dehidratált FITC-inzulin NP-ket adtak HepG2 sejtekkel beoltott 96 lyukú lemezekhez, és 4 órán át inkubálták. 4 óra elteltével... Az inkubáció után a sejteket eltávolítottuk és háromszor mostuk FBS-sel. Mintánként 5 × 104 sejtet elemeztünk BD LSR II áramlási citométerrel (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Egyesült Államok).
Minden értéket átlag ± szórásként fejeztünk ki. Az összes csoport közötti összehasonlítást egyutas ANOVA-val vagy t-próbával értékeltük IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, New York, USA) szoftverrel, és a p < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.
Ez a tanulmány bemutatja a porlasztva szárítás rugalmasságát és képességét a térhálósított kitin/TPP/inzulin nanorészecskék dehidratálására, jobb rekonstitúcióval, mint a standard fagyasztva szárítási módszerek, amelyek tömegnövelő szereket vagy krioprotektánsokat használnak, valamint nagyobb terhelhetőséget. Az optimalizált inzulin nanorészecskék átlagos részecskemérete 318 nm, kapszulázási hatékonysága pedig 99,4%. A dehidratálás utáni SEM és FTIR eredmények azt mutatták, hogy a gömb alakú szerkezet csak a mannittal és anélkül, valamint a mannittal liofilizált porlasztva szárított NP-kben maradt meg, de a mannit nélkül liofilizált NP-k a dehidratálás során elbomlottak. A rekonstitúciós képességi tesztben a mannit nélkül porlasztva szárított inzulin nanorészecskék mutatták a legkisebb átlagos részecskeméretet és a legnagyobb terhelést rekonstitúció után. Mindezen dehidratált NP-k felszabadulási viselkedése azt mutatta, hogy gyorsan felszabadultak pH = 2,5 és pH = 7 oldatokban, és nagyon stabilak pH = 6,5 oldatban. Más újraoldott dehidratált NP-khoz képest a mannit nélkül porlasztva szárított NP-k mutatták a leggyorsabb felszabadulást. Ez az eredmény összhangban van a sejtekben megfigyelt eredményekkel. felvételi vizsgálat, mivel a mannit hiányában porlasztva szárított NP-k szinte teljesen fenntartották a frissen előállított NP-k sejtfelvételi hatékonyságát. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a mannitmentes porlasztva szárítással előállított száraz inzulin nanorészecskék a legalkalmasabbak más vízmentes gyógyszerformákká, például orális tablettákká vagy bioadhezív filmekké történő további feldolgozásra.
Szellemi tulajdonjogi okokból a jelenlegi tanulmány során keletkezett és/vagy elemzett adatkészletek nem nyilvánosan elérhetők, de ésszerű kérésre a megfelelő szerzőktől beszerezhetők.
Kagan, A. 2-es típusú cukorbetegség: társadalmi és tudományos eredet, orvosi szövődmények, valamint következmények a betegekre és másokra nézve. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. és Jiang, P. Az inzulin kapszulázásának kifejlesztése: lehetséges-e ma már az orális adagolás? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. és Dass, CR A cukorbetegség kezelésében alkalmazott orális inzulinnal töltött liposzómás adagoló rendszerek legújabb eredményei. Értelmezés. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).