Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik. A legjobb eredmény elérése érdekében javasoljuk, hogy a böngésző újabb verzióját használja (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Időközben a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílus és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
A propionsavat (PPA) a mitokondriális diszfunkció szerepének vizsgálatára használják olyan neurofejlődési rendellenességekben, mint az autizmus spektrumzavar. A PPA-ról ismert, hogy megzavarja a mitokondriális biogenezist, anyagcserét és turnover-t. A PPA mitokondriális dinamikájára, hasadásra és fúzióra gyakorolt ​​hatása azonban továbbra is problematikus ezen mechanizmusok komplex időbeli jellege miatt. Jelen tanulmányban kiegészítő kvantitatív képalkotó technikákat alkalmazunk annak vizsgálatára, hogy a PPA hogyan befolyásolja a mitokondriális ultrastruktúrát, morfológiát és dinamikát neuronszerű SH-SY5Y sejtekben. A PPA (5 mM) szignifikáns csökkenést okozott a mitokondriális területen (p < 0,01), a Feret-átmérőben és kerületben (p < 0,05), valamint a 2-es területen (p < 0,01). A mitokondriális eseménylokátor-analízis a hasadási és fúziós események szignifikáns növekedését (p < 0,05) mutatta ki, ezáltal fenntartva a mitokondriális hálózat integritását stressz körülmények között. Ezenkívül a cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) és OPA1 (p < 0,05) mRNS expressziója szignifikánsan csökkent. 01). Ez a mitokondriális morfológia, biogenezis és dinamika átalakulását szemlélteti a funkció fenntartása érdekében stressz körülmények között. Adataink új betekintést nyújtanak a PPA mitokondriális dinamikájára gyakorolt ​​hatásaiba, és rávilágítanak a képalkotó technikák hasznosságára a mitokondriális stresszválaszokban szerepet játszó komplex szabályozási mechanizmusok vizsgálatában.
A mitokondriumok a tipikus energiatermelési és bioszintézisbeli szerepükön túl számos sejtműködés szerves részét képezik. A mitokondriális anyagcsere kulcsfontosságú szabályozója a kalciumjelátvitelnek, a metabolikus és redox homeosztázisnak, a gyulladásos jelátvitelnek, az epigenetikai módosulásoknak, a sejtszaporodásnak, a differenciálódásnak és a programozott sejthalálnak1. A mitokondriális anyagcsere különösen kritikus fontosságú a neuronális fejlődés, túlélés és működés szempontjából, és széles körben szerepet játszik a neuropatológia különböző megnyilvánulásaiban2,3,4.
Az elmúlt évtizedben az anyagcsere-állapot a neurogenezis, a differenciálódás, az érés és a plaszticitás központi szabályozójává vált5,6. Az utóbbi időben a mitokondriális morfológia és dinamika különösen fontos összetevőjévé vált a mitózisnak, egy dinamikus folyamatnak, amely fenntartja az egészséges mitokondriumok készletét a sejteken belül. A mitokondriális dinamikát komplex, egymástól függő útvonalak szabályozzák, a mitokondriális biogenezistől és bioenergetikától a mitokondriális hasadásig, fúzióig, transzportig és clearance-ig7,8. Ezen integratív mechanizmusok bármelyikének megzavarása rontja az egészséges mitokondriális hálózatok fenntartását, és mélyreható funkcionális következményekkel jár a neurofejlődésre nézve9,10. Valójában a mitokondriális dinamika szabályozási zavara számos pszichiátriai, neurodegeneratív és neurofejlődési rendellenességben megfigyelhető, beleértve az autizmus spektrumzavarokat (ASD)11,12.
Az autizmus spektrumzavar (ASD) egy heterogén neurofejlődési rendellenesség, komplex genetikai és epigenetikai architektúrával. Az ASD örökölhetősége vitathatatlan, de a mögöttes molekuláris etiológia továbbra sem teljesen ismert. A preklinikai modellekből, klinikai vizsgálatokból és multi-omikális molekuláris adatkészletekből származó adatok egyre több bizonyítékot szolgáltatnak az ASD-ben előforduló mitokondriális diszfunkcióra13,14. Korábban egy genomszintű DNS-metilációs szűrést végeztünk egy ASD-s betegek csoportjában, és azonosítottunk a mitokondriális metabolikus útvonalak mentén csoportosuló, eltérően metilált géneket15. Ezt követően beszámoltunk a mitokondriális biogenezis és dinamika központi szabályozóinak differenciális metilációjáról, amely az mtDNS kópiaszámának növekedésével és a megváltozott vizelet-metabolikus profillal társult ASD-ben16. Adataink egyre több bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a mitokondriális dinamika és a homeosztázis központi szerepet játszik az ASD patofiziológiájában. Ezért a mitokondriális dinamika, a morfológia és a funkció közötti kapcsolat mechanisztikus megértésének javítása a másodlagos mitokondriális diszfunkcióval jellemzett neurológiai betegségek folyamatos kutatásának egyik fő célja.
A molekuláris technikákat gyakran alkalmazzák specifikus gének mitokondriális stresszválaszokban betöltött szerepének vizsgálatára. Ezt a megközelítést azonban korlátozhatja a mitotikus kontrollmechanizmusok sokrétű és időbeli jellege. Ezenkívül a mitokondriális gének differenciális expressziója a funkcionális változások közvetett mutatója, különösen mivel jellemzően csak korlátozott számú gént elemeznek. Ezért a mitokondriális funkció és a bioenergetika vizsgálatára közvetlenebb módszereket javasoltak17. A mitokondriális morfológia szorosan összefügg a mitokondriális dinamikával. A mitokondriális alak, összekapcsolódás és szerkezet kritikus fontosságú az energiatermelés, valamint a mitokondriális és sejttúlélés szempontjából5,18. Ezenkívül a mitózis különböző komponensei a mitokondriális morfológia változásaira összpontosítanak, amelyek hasznos végpontjai lehetnek a mitokondriális diszfunkciónak, és alapot adhatnak a későbbi mechanisztikus vizsgálatokhoz.
A mitokondriális morfológia közvetlenül megfigyelhető transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) segítségével, lehetővé téve a sejtek ultrastruktúrájának részletes tanulmányozását. A TEM közvetlenül vizualizálja a mitokondriális kriszták morfológiáját, alakját és szerkezetét az egyes mitokondriumok felbontásában, ahelyett, hogy kizárólag a géntranszkripcióra, a fehérjeexpresszióra vagy a mitokondriális funkcionális paraméterekre támaszkodna a sejtpopulációkban17,19,20. Ezenkívül a TEM megkönnyíti a mitokondriumok és más organellumok, például az endoplazmatikus retikulum és az autofagoszómák közötti kölcsönhatások vizsgálatát, amelyek kulcsszerepet játszanak a mitokondriális funkcióban és homeosztázisban21,22. Így a TEM jó kiindulópont a mitokondriális diszfunkció tanulmányozásához, mielőtt a specifikus útvonalakra vagy génekre összpontosítanánk. Ahogy a mitokondriális funkció egyre relevánsabbá válik a neuropatológiában, egyértelműen szükség van arra, hogy a mitokondriális morfológiát és dinamikát közvetlenül és kvantitatívan lehessen vizsgálni in vitro neuronális modellekben.
Ebben a cikkben a mitokondriális dinamikát vizsgáljuk az autizmus spektrumzavarban szenvedő betegek mitokondriális diszfunkciójának neuronális modelljében. Korábban beszámoltunk a propionil-CoA karboxiláz béta (PCCB) differenciális metilációjáról az ASD15-ben, a mitokondriális propionil-CoA karboxiláz enzim PCC alegységében. A PCC szabályozási zavara ismerten a propionil-származékok, köztük a propionsav (PPA) toxikus felhalmozódását okozza23,24,25. Kimutatták, hogy a PPA megzavarja a neuronális anyagcserét és megváltoztatja a viselkedést in vivo, és bevált állatmodell az ASD-ben szerepet játszó neurofejlődési mechanizmusok tanulmányozására26,27,28. Ezenkívül a PPA-ról kimutatták, hogy in vitro megzavarja a mitokondriális membránpotenciált, a biogenezist és a légzést, és széles körben alkalmazzák neuronok mitokondriális diszfunkciójának modellezésére29,30. A PPA által kiváltott mitokondriális diszfunkció mitokondriális morfológiára és dinamikára gyakorolt ​​hatása azonban továbbra sem teljesen ismert.
Ez a tanulmány kiegészítő képalkotó technikákat alkalmaz a PPA mitokondriális morfológiára, dinamikájára és funkciójára gyakorolt ​​hatásainak számszerűsítésére SH-SY5Y sejtekben. Először egy TEM módszert fejlesztettünk ki a mitokondriális morfológia és ultrastruktúra változásainak vizualizálására17,31,32. A mitokondriumok dinamikus természete miatt33 mitokondriális eseménylokalizáló (MEL) analízist is alkalmaztunk a hasadási és fúziós események közötti egyensúly, a mitokondriumok számának és térfogatának változásainak számszerűsítésére PPA stressz alatt. Végül megvizsgáltuk, hogy a mitokondriális morfológia és dinamika összefügg-e a biogenezisben, a hasadásban és a fúzióban részt vevő gének expressziójának változásaival. Összefoglalva, adataink jól illusztrálják a mitokondriális dinamikát szabályozó mechanizmusok összetettségének megvilágításának kihívását. Kiemeljük a TEM hasznosságát a mitokondriális morfológia vizsgálatában, mint az SH-SY5Y sejtek mitózisának mérhető konvergens végpontját. Ezenkívül kiemeljük, hogy a TEM adatok akkor nyújtják a leggazdagabb információkat, ha olyan képalkotó technikákkal kombináljuk őket, amelyek a metabolikus stresszre adott dinamikus eseményeket is rögzítik. A neuronális sejtek mitózisát támogató molekuláris szabályozó mechanizmusok további jellemzése fontos betekintést nyújthat az idegrendszer és a neurodegeneratív betegségek mitokondriális komponensébe.
A mitokondriális stressz kiváltása érdekében az SH-SY5Y sejteket 3 mM és 5 mM nátrium-propionát (NaP) oldattal kezeltük PPA-val. A TEM előtt a mintákat kriogén minta-előkészítésnek vetettük alá nagynyomású fagyasztással és fagyasztás segítségével (1a. ábra). Kifejlesztettünk egy automatizált mitokondriális képelemző folyamatot a mitokondriális populációk nyolc morfológiai paraméterének mérésére három biológiai replikátumban. Azt tapasztaltuk, hogy a PPA-kezelés négy paramétert változtatott meg szignifikánsan: a 2. területet, a területet, a kerületet és a Feret-átmérőt (1b–e. ábra). A 2. terület mind a 3 mM, mind az 5 mM PPA-kezeléssel szignifikánsan csökkent (p = 0,0183, illetve p = 0,002) (1b. ábra), míg a terület (p = 0,003), a kerület (p = 0,0106) és a Feret-átmérő mind szignifikánsan csökkent. Az 5 mM-os kezelési csoportban szignifikáns csökkenés (p = 0,0172) volt megfigyelhető a kontrollcsoporthoz képest (1c–e. ábra). A terület és a kerület jelentős csökkenése azt mutatta, hogy az 5 mM PPA-val kezelt sejtek kisebb, kerekdedebb mitokondriumokkal rendelkeztek, és ezek a mitokondriumok kevésbé voltak megnyúltak, mint a kontrollsejtekben. Ez összhangban van a Feret-átmérő jelentős csökkenésével is, amely egy független paraméter, amely a részecskeszélek közötti legnagyobb távolság csökkenését jelzi. A kriszták ultrastruktúrájában változásokat figyeltünk meg: a kriszták kevésbé hangsúlyosak lettek a PPA-stressz hatására (1a. ábra, B panel). Azonban nem minden kép tükrözte egyértelműen a kriszták ultrastruktúráját, ezért ezen változások kvantitatív elemzését nem végeztük el. Ezek a TEM-adatok három lehetséges forgatókönyvet tükrözhetnek: (1) a PPA fokozza a hasadást vagy gátolja a fúziót, ami a meglévő mitokondriumok méretének csökkenését okozza; (2) a fokozott biogenezis új, kisebb mitokondriumokat hoz létre, vagy (3) mindkét mechanizmust egyszerre indukálja. Bár ezeket az állapotokat a TEM nem tudja megkülönböztetni, a jelentős morfológiai változások a mitokondriális homeosztázis és dinamika változásait jelzik PPA-stressz alatt. Ezt követően további paramétereket vizsgáltunk meg, hogy tovább jellemezzük ezeket a dinamikákat és az azok mögött meghúzódó lehetséges mechanizmusokat.
A propionsav (PPA) átalakítja a mitokondriális morfológiát. (a) Reprezentatív transzmissziós elektronmikroszkópos (TEM) képek, amelyek azt mutatják, hogy a mitokondriumok mérete csökken, a mitokondriumok pedig kisebbek és kerekebbek lesznek a PPA-kezelés növekedésével; 0 mM (kezeletlen), 3 mM és 5 mM. A piros nyilak a mitokondriumokat jelzik. (b–e) A 24 órán át PPA-val kezelt SH-SY5Y sejteket TEM-re készítettük elő, és az eredményeket Fiji/ImageJ segítségével elemeztük. A nyolc paraméter közül négy szignifikáns különbséget mutatott a kontroll (kezeletlen, 0 mM PPA) és a kezelt (3 mM és 5 mM PPA) sejtek között. (b) 2. régió, (c) Terület, (d) Kerület, (e) Feret átmérő. A szignifikáns különbségek meghatározásához egyutas varianciaanalízist (kontroll vs. kezelés) és Dunnett-féle többszörös összehasonlító tesztet alkalmaztunk (p < 0,05). Az adatpontok az egyes sejtek átlagos mitokondriális értékét jelentik, a hibasávok pedig az átlagot ± SEM-et jelentik. A bemutatott adatok n = 3-at jelentenek, legalább 24 sejtet replikátumonként; összesen 266 képet elemeztünk; * p < 0,05, ** p < 0,01 értéket jelöl.
A mitokondriális dinamika PPA-ra adott válaszának további jellemzésére a mitokondriumokat tetrametil-rodamin-etil-észterrel (TMRE) festettük, majd időzített mikroszkópiát és MEL-analízist alkalmaztunk a mitokondriumok lokalizálására és mennyiségi meghatározására 24 óra elteltével 3 és 5 mM PPA-nál. Hasadási és fúziós események kezelése. (2a. ábra). A MEL-analízis után a mitokondriumokat tovább elemeztük a mitokondriális struktúrák számának és átlagos térfogatának meghatározása érdekében. A hasadási események számának kismértékű, de szignifikáns növekedését figyeltük meg 3 mM koncentrációnál [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] a hasadási [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] és a fúziós [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)], valamint a fúziós [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] (0,05)] (<0,05)] események számához képest, amelyek szignifikánsan megnőttek 5 mM koncentrációnál a kontrollhoz képest (3b. ábra). A mitokondriumok száma szignifikánsan nőtt mind 3 mM [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)], mind 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] koncentrációnál (3c. ábra), míg az egyes mitokondriális struktúrák átlagos térfogata változatlan maradt (3c. ábra). 3d. Összefoglalva, ez arra utal, hogy a mitokondriális dinamika átalakulása kompenzációs válaszként szolgál, amely sikeresen fenntartja a mitokondriális hálózat integritását. A hasadási események számának növekedése 3 mM PPA mellett arra utal, hogy a mitokondriális szám növekedése részben a mitokondriális hasadásnak köszönhető, de mivel az átlagos mitokondriális térfogat lényegében változatlan marad, a biogenezis nem zárható ki további kompenzációs válaszként. Ezek az adatok azonban összhangban vannak a TEM által megfigyelt kisebb, kerek mitokondriális struktúrákkal, és a PPA által kiváltott mitokondriális dinamika jelentős változásait is mutatják.
A propionsav (PPA) dinamikus mitokondriális átrendeződést indukál a hálózat integritásának fenntartása érdekében. Az SH-SY5Y sejteket tenyésztettük, 24 órán át 3 és 5 mM PPA-val kezeltük, majd TMRE-vel és Hoechst 33342-vel festettük, majd MEL-analízist végeztünk. (a) Reprezentatív időzített mikroszkópos képek, amelyek a színes és binarizált maximális intenzitás-vetületeket ábrázolják a 2. időpontban (t2) minden feltételhez. Az egyes bináris képeken jelölt kiválasztott régiókat három különböző időkeretben (t1-t3) kiemeltük és 3D-ben megjelenítettük, hogy szemléltessük az időbeli dinamikát; a fúziós eseményeket zölddel, a hasadási eseményeket zölddel jelöltük. Pirossal jelölve. (b) A dinamikus események átlagos száma feltételenként. (c) A mitokondriális struktúrák átlagos száma sejtenként. (d) Az egyes mitokondriális struktúrák átlagos térfogata (µm3) sejtenként. A bemutatott adatok n = 15 sejtet reprezentálnak kezelési csoportonként. A feltüntetett hibasávok az átlagot ± SEM-et jelentik, a skálasáv = 10 μm, * p < 0,05.
A propionsav (PPA) transzkripciós szupressziót okoz a mitokondriális dinamikával kapcsolatos génekben. Az SH-SY5Y sejteket 3 és 5 mM PPA-val kezeltük 24 órán át. A relatív génkvantifikációt RT-qPCR segítségével végeztük, és B2M-re normalizáltuk. Mitokondriális biogenezis gének (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 és (d) NFE2L2. Mitokondriális fúziós és hasadási gének (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 és (i) DRP1. A szignifikáns különbségeket (p < 0,05) egyutas ANOVA-val (kontroll vs. kezelés) és Dunnett-féle többszörös összehasonlító teszttel teszteltük: * p < 0,05, ** p < 0,01, **** pedig p < 0,0001 értéket jelöl. Az oszlopok az átlagos expressziót ± SEM-et jelölik. A bemutatott adatok n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) és n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) biológiai replikátumot jelentenek.
A TEM és MEL elemzésekből származó adatok együttesen azt mutatják, hogy a PPA megváltoztatja a mitokondriális morfológiát és dinamikát. Ezek a képalkotó technikák azonban nem adnak betekintést az ezeket a folyamatokat mozgató mögöttes mechanizmusokba. Ezért megvizsgáltuk a mitokondriális dinamika, a biogenezis és a mitózis kilenc kulcsfontosságú szabályozójának mRNS expresszióját a PPA-kezelésre adott válaszként. 24 órás 3 mM és 5 mM PPA-val történő kezelés után meghatároztuk a sejtes mielóma onkogén (cMYC), a nukleáris légzési faktor (NRF1), a mitokondriális transzkripciós faktor 1 (TFAM), az NFE2-szerű transzkripciós faktor BZIP (NFE2L2), a gasztrin-szerű fehérje 2 (STOML2), a látóideg-atrófia 1 (OPA1), a mitofuzin 1 (MFN1), a mitofuzin 2 (MFN2) és a dinaminnal kapcsolatos fehérje 1 (DRP1) szintjét. 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 és p < 0,0001) és 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA kezelést figyeltünk meg. (3a–c. ábra). Az mRNS expressziójának csökkenése dózisfüggő volt: a cMYC, NRF1 és TFAM expressziója 3 mM koncentrációnál 5,7-szeresére, 2,6-szorosára és 1,9-szeresére, 5 mM koncentrációnál pedig 11,2-szeresére, 3-szorosára és 2,2-szeresére csökkent. Ezzel szemben a központi redox biogenezis gén, az NFE2L2 nem változott semmilyen PPA koncentrációnál, bár hasonló dózisfüggő csökkenő expresszió tendenciát figyeltünk meg (3d. ábra).
Vizsgáltuk a hasadás és fúzió szabályozásában részt vevő klasszikus gének expresszióját is. A STOML2-ről úgy gondolják, hogy részt vesz a fúzióban, a mitofágiában és a biogenezisben, és expressziója szignifikánsan csökkent (p < 0,0001) 3 mM (2,4-szeres változás) és 5 mM (2,8-szoros változás) PPA mellett (1. ábra). 3d). Hasonlóképpen, az OPA1 fúziós gén expressziója csökkent 3 mM (1,6-szoros változás) és 5 mM (1,9-szeres változás) PPA mellett (p = 0,006, illetve p = 0,0024) (3f. ábra). Azonban nem találtunk szignifikáns különbséget az MFN1, MFN2 fúziós gének vagy a DRP1 hasadási gén expressziójában 24 órás PPA stressz alatt (3g–i. ábra). Ezenkívül azt találtuk, hogy négy fúziós és hasadási fehérje (OPA1, MFN1, MFN2 és DRP1) szintje nem változott azonos körülmények között (4a–d. ábra). Fontos megjegyezni, hogy ezek az adatok egyetlen időpontot tükröznek, és nem feltétlenül tükrözik a fehérjeexpresszió vagy az aktivitási szintek változásait a PPA-stressz korai szakaszában. A cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 és OPA1 expressziójának jelentős csökkenése azonban a mitokondriális anyagcsere, biogenezis és dinamika jelentős transzkripciós szabályozási zavarára utal. Ezenkívül ezek az adatok rávilágítanak a képalkotó technikák hasznosságára a mitokondriális funkció végállapot-változásainak közvetlen vizsgálatában.
A fúziós és hasadási faktor fehérjeszintjei nem változtak a propionsav (PPA) kezelés után. Az SH-SY5Y sejteket 3 és 5 mM PPA-val kezeltük 24 órán át. A fehérjeszinteket Western blot analízissel számszerűsítettük, és az expressziós szinteket a teljes fehérjéhez normalizáltuk. Az átlagos fehérjeexpressziót és a célfehérje és a teljes fehérje reprezentatív Western blotjait mutatjuk be. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Az oszlopok az átlagot ± SEM-et jelölik, és a bemutatott adatok n = 3 biológiai replikátumot reprezentálnak. Többszörös összehasonlításokat (p < 0,05) végeztünk egyutas varianciaanalízissel és Dunnett-teszttel. Az eredeti gélt és blotot az S1. ábra mutatja.
A mitokondriális diszfunkció több szisztémát érintő betegségekkel társul, az anyagcsere-, szív- és érrendszeri és izombetegségektől kezdve a neurológiai betegségekig1,10. Számos neurodegeneratív és neurodegeneratív betegség társul mitokondriális diszfunkcióval, ami kiemeli ezen organellumok fontosságát az agy teljes élettartama alatt. Ezek a betegségek közé tartozik a Parkinson-kór, az Alzheimer-kór és az autizmus spektrumzavar (ASD)3,4,18. Azonban az agyszövethez való hozzáférés ezen betegségek tanulmányozása céljából nehézkes, különösen a mechanisztikus szinten, így a sejtes modellrendszerek szükséges alternatívát jelentenek. Ebben a tanulmányban egy PPA-val kezelt SH-SY5Y sejteket használó sejtes modellrendszert használunk a neuronális betegségekben, különösen az autizmus spektrumzavarokban megfigyelt mitokondriális diszfunkció összefoglalására. Ezen PPA-modell használata a neuronok mitokondriális dinamikájának vizsgálatára betekintést nyújthat az ASD etiológiájába.
Felkutattuk a TEM használatának lehetőségét a mitokondriális morfológia változásainak vizsgálatára. Fontos megjegyezni, hogy a TEM-et helyesen kell használni a hatékonyság maximalizálása érdekében. A kriogén minták előkészítése lehetővé teszi a neuronális struktúrák jobb megőrzését azáltal, hogy egyidejűleg rögzíti a sejtkomponenseket és csökkenti a műtermékek képződését34. Ezzel összhangban megfigyeltük, hogy a neuronszerű SH-SY5Y sejtek ép szubcelluláris organellumokkal és megnyúlt mitokondriumokkal rendelkeznek (1a. ábra). Ez kiemeli a kriogén előkészítési technikák hasznosságát a mitokondriális morfológia vizsgálatában neuronális sejtmodellekben. Bár a kvantitatív mérések kritikus fontosságúak a TEM-adatok objektív elemzéséhez, még mindig nincs konszenzus arról, hogy milyen konkrét paramétereket kell mérni a mitokondriális morfológiai változások megerősítéséhez. A mitokondriális morfológiát kvantitatívan vizsgáló nagyszámú tanulmány17,31,32 alapján kifejlesztettünk egy automatizált mitokondriális képelemző folyamatot, amely nyolc morfológiai paramétert mér, nevezetesen: területet, terület2, oldalarányt, kerületet, körkörösséget, fokszámot, Feret-átmérőt és kerekdedséget.
Ezek közül a PPA jelentősen csökkentette a 2-es területet, a területet, a kerületet és a Feret-átmérőt (1b–e ábra). Ez azt mutatta, hogy a mitokondriumok kisebbek és kerekebbek lettek, ami összhangban van a korábbi vizsgálatokkal, amelyek a mitokondriális terület csökkenését mutatták ki 72 órás PPA30 által kiváltott mitokondriális stressz után. Ezek a morfológiai jellemzők a mitokondriális hasadásra utalhatnak, amely egy szükséges folyamat a sérült komponensek mitokondriális hálózatból történő elkülönítéséhez, hogy elősegítsék azok lebomlását a mitofágia révén35,36,37. Másrészt az átlagos mitokondriális méret csökkenése összefüggésben állhat a fokozott biogenezissel, ami kis naszcens mitokondriumok kialakulásához vezet. A fokozott hasadás vagy biogenezis kompenzációs választ jelent a mitózis fenntartására a mitokondriális stresszel szemben. Azonban a csökkent mitokondriális növekedés, a károsodott fúzió vagy más állapotok nem zárhatók ki.
Bár a TEM által létrehozott nagy felbontású képek lehetővé teszik az egyes mitokondriumok szintjén a morfológiai jellemzők meghatározását, ez a módszer egyetlen időpontban kétdimenziós pillanatképeket készít. A metabolikus stresszre adott dinamikus válaszok tanulmányozásához a mitokondriumokat TMRE-vel festettük, és időzített mikroszkópiát alkalmaztunk MEL-analízissel, amely lehetővé teszi a mitokondriális hálózat változásainak nagy áteresztőképességű 3D-s vizualizációját az idő múlásával33,38. A mitokondriális dinamikában finom, de jelentős változásokat figyeltünk meg PPA-stressz alatt (2. ábra). 3 mM-nál a hasadási események száma jelentősen megnőtt, míg a fúziós események száma megegyezett a kontrollcsoportéval. Mind a hasadási, mind a fúziós események számának növekedését figyeltük meg 5 mM PPA-nál, de ezek a változások megközelítőleg arányosak voltak, ami arra utal, hogy a hasadási és fúziós kinetika magasabb koncentrációknál éri el az egyensúlyt (2b. ábra). Az átlagos mitokondriális térfogat változatlan maradt mind a 3, mind az 5 mM PPA-nál, ami azt jelzi, hogy a mitokondriális hálózat integritása megmaradt (2d. ábra). Ez tükrözi a dinamikus mitokondriális hálózatok azon képességét, hogy enyhe metabolikus stresszre reagálva hatékonyan fenntartsák a homeosztázist anélkül, hogy hálózati fragmentációt okoznának. 3 mM PPA-nál a hasadás növekedése elegendő az új egyensúlyba való átmenet elősegítéséhez, de a magasabb PPA-koncentrációk által kiváltott stresszre válaszul mélyebb kinetikus átalakulásra van szükség.
A mitokondriumok száma mindkét PPA stresszkoncentrációnál megnőtt, de az átlagos mitokondriális térfogat nem változott szignifikánsan (2c. ábra). Ez a fokozott biogenezisnek vagy a fokozott osztódásnak tudható be; azonban az átlagos mitokondriális térfogat jelentős csökkenésének hiányában valószínűbb, hogy a bioszintézis fokozódik. A 2. ábrán látható adatok azonban két kompenzációs mechanizmus létezését támasztják alá: a hasadási események számának növekedését, ami összhangban van a mitokondriális hasadás felregulációjával, és az események számának növekedését, ami összhangban van a mitokondriális biogenezissel. Végső soron az enyhe stressz dinamikus kompenzációja a hasadást, fúziót, biogenezist és mitofágiát magában foglaló egyidejű folyamatokból állhat. Bár korábbi szerzők kimutatták, hogy a PPA fokozza a mitózist30,39 és a mitofágiát29, mi bizonyítékot szolgáltatunk a mitokondriális hasadási és fúziós dinamika PPA-ra adott válaszként történő átalakulására. Ezek az adatok megerősítik a TEM által megfigyelt morfológiai változásokat, és további betekintést nyújtanak a PPA által kiváltott mitokondriális diszfunkcióval kapcsolatos mechanizmusokba.
Mivel sem a TEM, sem a MEL elemzés nem szolgáltatott közvetlen bizonyítékot a megfigyelt morfológiai változások mögött meghúzódó génszabályozó mechanizmusokra, megvizsgáltuk a mitokondriális anyagcserében, biogenezisben és dinamikájában részt vevő gének RNS-expresszióját. A cMYC protoonkogén egy transzkripciós faktor, amely részt vesz a mitokondriumok, a glikolízis, az aminosav- és zsírsav-anyagcsere szabályozásában40. Ezenkívül ismert, hogy a cMYC közel 600 mitokondriális gén expresszióját szabályozza, amelyek részt vesznek a mitokondriális transzkripcióban, transzlációban és komplex összeszerelésben, beleértve az NRF1-et és a TFAM-ot41. Az NRF1 és a TFAM a mitózis két központi szabályozója, amelyek a PGC-1α után hatnak az mtDNS replikációjának aktiválására. Ezt az útvonalat a cAMP és az AMPK jelátvitel aktiválja, és érzékeny az energiafelhasználásra és a metabolikus stresszre. Megvizsgáltuk az NFE2L2-t is, a mitokondriális biogenezis redox szabályozóját, hogy meghatározzuk, a PPA hatásait közvetítheti-e az oxidatív stressz.
Bár az NFE2L2 expressziója változatlan maradt, a cMYC, NRF1 és TFAM expressziójának dózisfüggő csökkenését tapasztaltuk 24 órás 3 mM és 5 mM PPA-val történő kezelés után (3a–c. ábra). A cMYC expressziójának csökkenését korábban már kimutatták a mitokondriális stresszre adott válaszként42, és fordítva, a cMYC expressziójának csökkentése mitokondriális diszfunkciót okozhat a mitokondriális anyagcsere, a hálózati kapcsolatok és a membránpolarizáció átalakításával43. Érdekes módon a cMYC részt vesz a mitokondriális hasadás és fúzió szabályozásában is42,43, és ismert, hogy növeli a DRP1 foszforilációját és a mitokondriális lokalizációt a sejtosztódás során44, valamint közvetíti a mitokondriális morfológiai átalakulást a neuronális őssejtekben45. Valójában a cMYC-hiányos fibroblasztok csökkent mitokondriális méretet mutatnak, ami összhangban van a PPA43 stressz által kiváltott változásokkal. Ezek az adatok egy érdekes, de egyelőre nem tisztázott kapcsolatot illusztrálnak a cMYC és a mitokondriális dinamika között, érdekes célpontot jelentve a PPA stressz által kiváltott átalakulás jövőbeli vizsgálataihoz.
Az NRF1 és a TFAM csökkenése összhangban van a cMYC fontos transzkripciós aktivátor szerepével. Ezek az adatok összhangban vannak a humán vastagbélrák sejteken végzett korábbi vizsgálatokkal is, amelyek kimutatták, hogy a PPA 22 óra elteltével csökkentette az NRF1 mRNS expresszióját, ami az ATP-hiányhoz és a ROS46 növekedéséhez kapcsolódott. Ezek a szerzők azt is beszámolták, hogy a TFAM expresszió 8,5 óra elteltével megnőtt, de 22 óra elteltével visszatért az alapértékre. Ezzel szemben Kim és munkatársai (2019) kimutatták, hogy a TFAM mRNS expressziója szignifikánsan csökkent 4 óra PPA stressz után SH-SY5Y sejtekben; azonban 72 óra elteltével a TFAM fehérje expressziója szignifikánsan megnőtt, és a mtDNS kópiaszáma szignifikánsan megnőtt. Így a mitokondriális biogenezis gének számának 24 óra elteltével megfigyelt csökkenése nem zárja ki annak lehetőségét, hogy a mitokondriumok számának növekedése a biogenezis korábbi időpontokban történő aktiválódásával jár. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a PPA jelentősen felülszabályozza a PGC-1α mRNS és fehérje expresszióját SH-SY5Y sejtekben 4 óra 30 perc elteltével, míg a propionsav a PGC-1α-n keresztül fokozza a mitokondriális biogenezist a borjú hepatocitákban 12 óra 39 perc elteltével. Érdekes módon a PGC-1α nemcsak az NRF1 és a TFAM közvetlen transzkripciós szabályozója, hanem kimutatták, hogy az MFN2 és a DRP1 aktivitását is szabályozza a hasadás és a fúzió szabályozásával47. Összefoglalva, ez rávilágít a PPA által kiváltott mitokondriális kompenzációs válaszokat szabályozó mechanizmusok szoros összekapcsolódására. Ezenkívül adataink a biogenezis és az anyagcsere transzkripciós szabályozásának jelentős diszregulációját tükrözik PPA stressz alatt.
A STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 és DRP1 gének a mitokondriális hasadás, fúzió és dinamika központi szabályozói közé tartoznak37,48,49. Számos más gén is részt vesz a mitokondriális dinamikájában, azonban a STOML2, OPA1 és MFN2 esetében korábban kimutatták, hogy eltérő metilációjúak az ASD kohorszokban,16 és számos független tanulmány számolt be ezen transzkripciós faktorok változásairól a mitokondriális stresszre adott válaszként50,51.52. Mind az OPA1, mind a STOML2 expressziója szignifikánsan csökkent a 3 mM és 5 mM PPA kezeléssel (3e., f. ábra). Az OPA1 a mitokondriális fúzió egyik klasszikus szabályozója az MFN1 és 2-vel való közvetlen kölcsönhatás révén, és szerepet játszik a cristae átalakulásában és a mitokondriális morfológiában53. A STOML2 pontos szerepe a mitokondriális dinamikában továbbra sem tisztázott, de a bizonyítékok arra utalnak, hogy szerepet játszik a mitokondriális fúzióban, a biogenezisben és a mitofágiában.
A STOML2 részt vesz a mitokondriális légzési összekapcsolódás fenntartásában és a légzési lánc komplexek kialakulásában54,55, és kimutatták, hogy mélyrehatóan megváltoztatja a rákos sejtek metabolikus jellemzőit56. Tanulmányok kimutatták, hogy a STOML2 elősegíti a mitokondriális membránpotenciált és biogenezist a BAN-nal és a kardiolipinnel való kölcsönhatás révén 55, 57, 58. Ezenkívül független tanulmányok kimutatták, hogy a STOML2 és a PINK1 közötti kölcsönhatás szabályozza a mitofágiát59,60. Figyelemre méltó, hogy a STOML2-ről kimutatták, hogy közvetlenül kölcsönhatásba lép az MFN2-vel és stabilizálja azt, valamint fontos szerepet játszik a hosszú OPA1 izoformák stabilizálásában azáltal, hogy gátolja az OPA1 lebontásáért felelős proteázt53,61,62. A PPA reakciókban megfigyelt STOML2 expresszió csökkenése fogékonyabbá teheti ezeket a fúziós fehérjéket az ubiquitin- és proteaszóma-függő útvonalakon keresztüli lebontásra48. Bár a STOML2 és az OPA1 pontos szerepe a PPA-ra adott dinamikus válaszban nem világos, ezen fúziós gének csökkent expressziója (3. ábra) felboríthatja a hasadás és a fúzió közötti egyensúlyt, és a mitokondriális méret csökkenéséhez vezethet (3. ábra). 1).
Másrészt az OPA1 fehérje expressziója 24 óra elteltével változatlan maradt, míg az MFN1, MFN2 vagy DRP1 mRNS és fehérje szintje nem változott szignifikánsan a PPA kezelés után (3g-i. ábra, 4. ábra). Ez arra utalhat, hogy a mitokondriális fúzióban és hasadásban részt vevő faktorok szabályozásában nincsenek változások. Érdemes azonban megjegyezni, hogy mind a négy gént poszttranszkripciós módosítások (PTM-ek) is szabályozzák, amelyek a fehérje aktivitását szabályozzák. Az OPA1 nyolc alternatív splice variánssal rendelkezik, amelyek proteolitikusan hasadnak a mitokondriumokban, két különálló izoformát hozva létre63. A hosszú és rövid izoformák közötti egyensúly végső soron meghatározza az OPA1 szerepét a mitokondriális fúzióban és a mitokondriális hálózat fenntartásában64. A DRP1 aktivitását a kalcium/kalmodulin-függő protein kináz II (CaMKII) foszforilációja szabályozza, míg a DRP1 lebontását az ubiquitináció és a SUMOiláció65. Végül, mind a DRP1, mind az MFN1/2 GTPáz, így aktivitásukat befolyásolhatja a GTP-termelés sebessége a mitokondriumokban 66. Ezért, bár ezen fehérjék expressziója állandó marad, ez nem feltétlenül tükrözi a változatlan fehérjeaktivitást vagy lokalizációt 67,68. Valójában a meglévő PTM fehérjerepertoárok gyakran az első védelmi vonalat jelentik, amelyek felelősek az akut stresszválaszok közvetítéséért. Modellünkben mérsékelt metabolikus stressz jelenlétében valószínű, hogy a PTM elősegíti a fúziós és hasadási fehérjék fokozott aktivitását a mitokondriális integritás megfelelő helyreállításához anélkül, hogy ezen gének további aktiválására lenne szükség mRNS vagy fehérje szinten.
Összefoglalva, a fenti adatok rávilágítanak a mitokondriális morfológia összetett és időfüggő szabályozására, valamint ezen mechanizmusok tisztázásának kihívásaira. A génexpresszió tanulmányozásához először azonosítani kell a jelátviteli útvonal specifikus célgénjeit. Adataink azonban azt mutatják, hogy az ugyanazon útvonalon lévő gének nem ugyanúgy reagálnak ugyanarra a stresszre. Valójában korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az ugyanazon útvonalon lévő különböző gének eltérő időbeli válaszprofilokat mutathatnak30,46. Ezenkívül léteznek összetett poszttranszkripciós mechanizmusok, amelyek megzavarják a transzkripció és a génfunkció közötti kapcsolatot. A proteomikai vizsgálatok betekintést nyújthatnak a PTM-ek és a fehérjefunkció hatásába, de kihívásokat is jelentenek, beleértve az alacsony áteresztőképességű módszereket, a magas jel-zaj arányt és a gyenge felbontást.
Ebben az összefüggésben a mitokondriális morfológia TEM és MEL segítségével történő vizsgálata nagy potenciállal rendelkezik a mitokondriális dinamika és funkció közötti kapcsolat alapvető kérdéseinek megválaszolására, valamint arra, hogy ez hogyan befolyásolja a betegségeket. A legfontosabb, hogy a TEM közvetlen módszert biztosít a mitokondriális morfológia mérésére, mint a mitokondriális diszfunkció és dinamika konvergens végpontjára51. A MEL közvetlen módszert kínál a hasadási és fúziós események vizualizálására háromdimenziós sejtes környezetben, lehetővé téve a dinamikus mitokondriális átalakulás számszerűsítését még a génexpresszió változásainak hiányában is33. Itt kiemeljük a mitokondriális képalkotó technikák hasznosságát a másodlagos mitokondriális betegségekben. Ezeket a betegségeket jellemzően krónikus, enyhe metabolikus stressz jellemzi, amelyet a mitokondriális hálózatok finom átalakulása jellemez, nem pedig akut mitokondriális károsodás. A mitózis krónikus stressz alatti fenntartásához szükséges mitokondriális kompenzációnak azonban mélyreható funkcionális következményei vannak. Az idegtudomány kontextusában ezen kompenzációs mechanizmusok jobb megértése fontos információkkal szolgálhat a mitokondriális diszfunkcióval összefüggő pleiotróp neuropatológiáról.
Végső soron adataink rávilágítanak a képalkotó technikák hasznosságára a génexpresszió, a fehérjemódosítások és a fehérjeaktivitás közötti komplex kölcsönhatások funkcionális következményeinek megértésében, amelyek szabályozzák a neuronális mitokondriális dinamikát. PPA-t használtunk a mitokondriális diszfunkció modellezésére egy neuronális sejtmodellben, hogy betekintést nyerjünk az ASD mitokondriális komponensébe. A PPA-val kezelt SH-SY5Y sejtek mitokondriális morfológiai változásokat mutattak: a mitokondriumok kicsivé és kerekdedé váltak, a cristae pedig rosszul definiált volt, amikor a TEM megfigyelte. A MEL-analízis azt mutatja, hogy ezek a változások egyidejűleg jelentkeznek a hasadási és fúziós események növekedésével, hogy fenntartsák a mitokondriális hálózatot enyhe metabolikus stresszre adott válaszként. Ezenkívül a PPA jelentősen megzavarja a mitokondriális anyagcsere és homeosztázis transzkripciós szabályozását. A cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 és OPA1 géneket azonosítottuk a PPA stressz által megzavart kulcsfontosságú mitokondriális szabályozókként, és szerepet játszhatnak a PPA által kiváltott mitokondriális morfológiai és funkcióbeli változások közvetítésében. További vizsgálatokra van szükség a PPA által kiváltott génexpresszió és fehérjeaktivitás, lokalizáció és poszttranszlációs módosítások időbeli változásainak jobb jellemzéséhez. Adataink rávilágítanak a mitokondriális stresszválaszt közvetítő szabályozó mechanizmusok összetettségére és kölcsönös függőségére, és demonstrálják a TEM és más képalkotó technikák hasznosságát a célzottabb mechanisztikus vizsgálatokban.
Az SH-SY5Y sejtvonalat (ECACC, 94030304-1VL) a Sigma-Aldrich-tól vásároltuk. Az SH-SY5Y sejteket Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalaj/F-12 tápanyagkeverékben (DMEM/F-12) és L-glutaminban (SC09411, ScienCell) tenyésztettük 25 cm2-es lombikokban, amelyeket 20% magzati szarvasmarha-szérummal (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) és 1% penicillin-sztreptomicinnel (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) egészítettünk ki 37 °C-on, 5% CO2-atmoszférában. A sejteket 80%-os konfluencia eléréséig szubkultúráztuk 0,05% tripszin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific) felhasználásával, 300 g-vel centrifugáltuk, majd körülbelül 7 × 105 sejt/ml sűrűséggel szélesztettük. Minden kísérletet differenciálatlan SH-SY5Y sejteken végeztek a 19–22. passzázs között. A PPA-t NaP formájában adták be. A NaP port (CAS-szám: 137-40-6, kémiai képlete C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) meleg MilliQ vízben 1 M koncentrációra oldották fel, és 4 °C-on tárolták. A kezelés napján ezt az oldatot 1 M PPA-val 3 mM-ra, majd 5 mM PPA-val szérummentes táptalajban (DMEM/F-12 L-glutaminnal) hígították. Minden kísérletben a kezelési koncentrációk a következők voltak: PPA nélkül (0 mM, kontroll), 3 mM és 5 mM PPA. A kísérleteket legalább három biológiai ismétlésben végezték.
Az SH-SY5Y sejteket 25 cm5-es lombikokba oltottuk 5,5 × 105 sejt/ml koncentrációban, és 24 órán át tenyésztettük. A PPA-kezelést a 24 órás inkubáció előtt adtuk a lombikhoz. A sejtpelleteket a szokásos emlős szövettenyésztési protokollok szerint gyűjtöttük össze (fent leírtak szerint). A sejtpelletet 100 µl 2,5%-os glutaraldehid, 1× PBS oldatban reszuszpendáltuk, és 4 °C-on tároltuk a feldolgozásig. Az SH-SY5Y sejteket röviden centrifugáltuk, hogy a sejteket pelletizáljuk és eltávolítsuk a 2,5%-os glutaraldehid, 1× PBS oldatot. Az üledéket desztillált vízben elkészített 4%-os agaróz gélben reszuszpendáltuk (az agaróz és az üledék térfogataránya 1:1). Az agaróz darabokat lapos lemezeken lévő rácsokra helyeztük, és 1-hexadecénnel vontuk be a nagynyomású fagyasztás előtt. A mintákat 100%-os száraz acetonban fagyasztottuk -90°C-on 24 órán át. A hőmérsékletet ezután -80°C-ra emelték, és 1%-os ozmium-tetroxid és 0,1%-os glutaraldehid oldatot adtak hozzá. A mintákat 24 órán át -80°C-on tárolták. Ezt követően a hőmérsékletet fokozatosan, több nap alatt szobahőmérsékletre emelték: –80°C-ról –50°C-ra 24 órán át, –30°C-ra 24 órán át, –10°C-ra 24 órán át, végül szobahőmérsékletre.
Kriogén előkészítés után a mintákat gyantával impregnáltuk, és ultravékony metszeteket (∼100 nm) készítettünk belőlük Leica Reichert UltracutS ultramikrotómmal (Leica Microsystems). A metszeteket 2%-os uranil-acetáttal és ólom-citráttal festettük. A mintákat 200 kV-on működő FEI Tecnai 20 transzmissziós elektronmikroszkóppal (ThermoFisher (korábban FEI), Eindhoven, Hollandia) (Lab6 adó) és Tridiem energiaszűrővel ellátott Gatan CCD kamerával (Gatan, Egyesült Királyság) vizsgáltuk.
Minden technikai ismétlésben legalább 24 egysejtű képet készítettek, összesen 266 képpel. Minden képet a vizsgált régió (ROI) makró és a mitokondrium makró segítségével elemeztek. A mitokondriális makró publikált módszereken alapul17,31,32, és lehetővé teszi a TEM-képek félautomata kötegelt feldolgozását a Fiji/ImageJ69 programban. Dióhéjban: a képet gördülő golyós háttérkivonással (60 pixeles sugár) és FFT sávszűrővel (60, illetve 8 pixeles felső és alsó határral) és függőleges vonalak elnyomásával invertálták, 5%-os orientációs toleranciával. A feldolgozott képet automatikusan küszöbértéknek vetették alá egy maximális entrópia algoritmus segítségével, és egy bináris maszkot generáltak. A nyers TEM-képekben manuálisan kiválasztott ROI-khoz társított képterületeket kivonták, jellemezve a mitokondriumokat, és kizárva a plazmamembránt és más nagy kontrasztú régiókat. Minden egyes kivont ROI esetében 600 pixelnél nagyobb bináris részecskéket elemeztek, és a részecske területét, kerületét, fő- és melléktengelyeit, Feret-átmérőjét, kerekségét és körkörösségét a Fiji/ImageJ beépített mérési függvényeivel mérték. Merrill, Flippo és Strack (2017) nyomán a 2. területet, a részecske oldalarányát (fő- és melléktengely arány) és az alakfaktort (FF) ezekből az adatokból számították ki, ahol FF = kerület 2/4pi x terület. A paraméteres képlet definíciója Merrill, Flippo és Strack (2017) munkájában található. Az említett makrók elérhetők a GitHubon (lásd az Adatok Elérhetőségi Nyilatkozatát). Átlagosan körülbelül 5600 részecskét elemeztek PPA kezelésenként, összesen körülbelül 17 000 részecskével (az adatokat nem mutatjuk be).
Az SH-SH5Y sejteket 8 kamrás tenyésztőcsészékbe (ThermoFisher, #155411) helyeztük az adhézió elősegítése érdekében egy éjszakán át, majd TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) és Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) festékkel inkubáltuk. A képeket 405 nm-es és 561 nm-es lézerekkel vettük fel 10 perces környezetben, a nyers képeket pedig z-stackként rögzítettük, amelyek 10 képmikrográfot tartalmaztak, 0,2 μm-es az-lépésközzel a képkockák között 12 egymást követő időpontban. A képeket Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 szuperfelbontású platformmal (Carl Zeiss, Oberkochen, Németország) gyűjtöttük LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 lencse használatával. A képeket ImageJ-ben elemeztük egy korábban leírt folyamattal és az ImageJ pluginnal, hogy mérjük a fúziós és hasadási eseményeket, a mitokondriális struktúrák átlagos számát és a sejtenkénti átlagos mitokondriális térfogatot.33 A MEL makrók elérhetők a GitHubon (lásd az Adatok Elérhetőségi Nyilatkozatát).
Az SH-SY5Y sejteket hatlyukú lemezeken tenyésztettük 0,3 × 106 sejt/ml sűrűséggel 24 órán át a kezelés előtt. Az RNS-t a Quick-RNA™ Miniprep protokollal (ZR R1055, Zymo Research) extraháltuk, apró módosításokkal: minden lyukhoz 300 μl RNS lízis puffert adtunk az eltávolítás előtt, és utolsó lépésként minden mintát 30 μl DNáz/RNáz elúciós oldattal lizáltunk. mentes vízzel. Minden minta mennyiségét és minőségét NanoDrop ND-1000 UV-Vis spektrofotométerrel ellenőriztük. A sejtlízisekből származó teljes fehérjét 200 μl RIPA lízispufferrel kaptuk, a fehérjekoncentrációt pedig Bradford protein assay70 segítségével határoztuk meg.
A cDNS szintézist a Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) segítségével végeztük a gyártó utasításai szerint, némi módosítással. A cDNS-t 20 μl-es reakciókban szintetizáltuk 0,7-1 μg teljes RNS felhasználásával. A primereket a korábban publikált 42., 71., 72., 73., 74., 75., 76., 77., 78. cikkekből (S1. táblázat) választottuk ki, a hozzájuk tartozó próbákat pedig az Integrated DNA Technologies PrimerQuest eszközével terveztük. Az összes érdekes gént a nukleáris B2M génhez normalizáltuk. A STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC és OPA1 génexpresszióját RT-qPCR-rel mértük. A master mix LUNA Taq polimerázt (M3003L, New England Biolabs), 10 μM forward és reverz primereket, cDNS-t és PCR-minőségű vizet tartalmazott, így minden reakcióhoz 10 μL végső térfogatot kaptunk. Az osztódási és hasadási gének (DRP1, MFN1/2) expresszióját TaqMan multiplex vizsgálatokkal mértük. A Luna Universal Probe qPCR Master Mix-et (M3004S, New England Biolabs) a gyártó utasításai szerint, kisebb módosításokkal használtuk. A multiplex RT-qPCR master mix 1X LUNA Taq polimerázt, 10 μM forward és reverz primereket, 10 μM próbát, cDNS-t és PCR-minőségű vizet tartalmaz, így minden reakcióhoz 20 μL végső térfogatot kaptunk. Az RT-qPCR-t Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - sorozatszám: R0618110) segítségével végeztük. A cikluskörülményeket az S1. táblázat mutatja. Minden cDNS mintát háromszor amplifikáltunk, és egy standard görbét generáltunk tízszeres hígítások sorozatával. A háromszoros mintákban a 0,5-nél nagyobb ciklusküszöb-szórású (Ct) kiugró értékeket eltávolítottuk az elemzésből az adatok reprodukálhatóságának biztosítása érdekében30,72. A relatív génexpressziót a 2-ΔΔCt79 módszerrel számítottuk ki.
A fehérjemintákat (60 μg) 2:1 arányban Laemmli betöltő pufferrel kevertük össze, majd 12%-os színtelen fehérjegélen (Bio-Rad #1610184) futtattuk. A fehérjéket PVDF (polivinilidén-fluorid) membránra (#170-84156, Bio-Rad) vittük át a Trans-Blot Turbo rendszer (#170-4155, Bio-Rad) segítségével. A membránt blokkoltuk, és a megfelelő primer antitestekkel (OPA1, MFN1, MFN2 és DRP1) (1:1000 hígításban) inkubáltuk 48 órán át, majd szekunder antitestekkel (1:10 000) inkubáltuk 1 órán át. A membránokat ezután Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) segítségével képalkottuk, és Bio-Rad ChemiDoc MP rendszerrel rögzítettük. A Western blot analízishez az ImageLab 6.1-es verzióját használtuk. Az eredeti gél és blot az S1. ábrán látható. Az antitestinformációkat az S2. táblázat tartalmazza.
Az adathalmazokat legalább három független minta átlaga és az átlag standard hibája (SEM) formájában mutatjuk be. Az adathalmazok normalitásvizsgálatát Shapiro-Wilks teszttel végeztük (hacsak másképp nem jelezzük), mielőtt Gauss-eloszlást és egyenlő szórást feltételeztünk volna, és folytattuk volna az elemzéseket. Az adathalmaz elemzése mellett Fisher-féle MEL LSD-t (p < 0,05), egyutas ANOVA-t (kezelés vs. kontroll átlag) és Dunnett-féle többszörös összehasonlító tesztet alkalmaztunk a szignifikancia meghatározásához (p < 0,05). A szignifikáns p-értékeket a grafikonon a következőképpen jelöljük: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Minden statisztikai elemzést és grafikont a GraphPad Prism 9.4.0 programmal végeztünk és generáltunk.
A TEM képelemzéshez használt Fiji/ImageJ makrók nyilvánosan elérhetők a GitHubon: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. A mitokondriális eseménylokátor (MEL) makró nyilvánosan elérhető a GitHubon: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM és Vijaya A. Mitokondriumok: az anyagcsere, a homeosztázis, a stressz, az öregedés és az epigenetika fő szabályozói. Indonesian. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Több aspektusból álló mitokondriális diszfunkció skizofréniában, az I. komplex, mint lehetséges patológiai célpont. Schizophrenia. Resource. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. és Beal, MF Mitokondriális diszfunkció Parkinson-kórban. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG és Mehta V. Stresszes mitokondriumok: az invázió célpontjai Alzheimer-kórban. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF és Ferreira GK Mitokondriumok és az agy: bioenergetika és egyebek. Neurotoxinok. resource. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. és munkatársai. Pleiotróp mitokondriumok: a mitokondriumok hatása a neuronális fejlődésre és a betegségekre. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. és Morais, VA Mitokondriális biogenezis az idegsejtekben: hogyan és hol. Nemzetköziség. J. Mohr. The science. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. és Zhao, J. Az emlősök mitokondriális dinamikájának szabályozása: lehetőségek és kihívások. front. endokrin. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. és Slack, RS Mitokondriális dinamika a neurogenezis szabályozásában: a fejlődő agytól a felnőtt agyig. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).