Jelenlegi *Jelenlegi cím: Köln 50931, Németország, Kölni Kiválósági Klaszter – Sejtszintű Stresszválasz Kutatása Öregedésfüggő Betegségekben (CECAD).
A mitokondriális betegségek neurodegenerációját visszafordíthatatlannak tekintik, mivel a neuronok metabolikus plaszticitása korlátozott, de a mitokondriális diszfunkció hatása a neuronális anyagcsere sejtautonómiájára a szervezetben kevéssé ismert. Ebben a tanulmányban bemutatjuk a Purkinje-neuronok sejtspecifikus proteómját, amelyek progresszív OXPHOS-hiányban szenvednek, amelyet a megzavart mitokondriális fúziós dinamika okoz. Megállapítottuk, hogy a mitokondriális diszfunkció mélyreható változást indított el a proteomika területén, ami végső soron a precíz metabolikus programok szekvenciális aktiválódásához vezetett a sejthalál előtt. Váratlan módon megállapítottuk a piruvát-karboxiláz (PCx) és más öregedésgátló enzimek nyilvánvaló indukcióját, amelyek kiegészítik a TCA-ciklus intermedierjeit. A PCx gátlása súlyosbította az oxidatív stresszt és a neurodegenerációt, ami arra utal, hogy az ateroszklerózis védő hatással van az OXPHOS-hiányos neuronokban. A mitokondriális fúzió helyreállítása a terminálisan degenerált neuronokban teljesen visszafordítja ezeket a metabolikus jellemzőket, ezáltal megelőzve a sejthalált. Eredményeink korábban ismeretlen útvonalakat azonosítanak, amelyek ellenálló képességet biztosítanak a mitokondriális diszfunkcióval szemben, és azt mutatják, hogy a neurodegeneráció még a betegség késői szakaszában is visszafordítható.
A mitokondriumok központi szerepét a neuronális energia-anyagcsere fenntartásában az emberi mitokondriális betegségekkel összefüggő kiterjedt neurológiai tünetek hangsúlyozzák. Ezen betegségek többségét a mitokondriális génexpressziót szabályozó génmutációk (1, 2) vagy a mitokondriális dinamikával kapcsolatos génpusztulás okozza, amely közvetve befolyásolja a mitokondriális DNS (mtDNS) stabilitását (3, 4). Állatmodelleken végzett munka kimutatta, hogy a környező szövetekben a mitokondriális diszfunkcióra adott válaszként konzervatív metabolikus útvonalak (5-7) aktiválódhatnak, ami fontos információkat nyújt ezen összetett betegségek patogenezisének mélyreható megértéséhez. Ezzel éles ellentétben alapvető fontosságú az agyi mitokondriális adenozin-trifoszfát (ATP) termelésének általános kudarca által okozott specifikus sejttípusok metabolikus változásainak ismerete (8), ami hangsúlyozza a betegségek megelőzésére vagy megelőzésére alkalmazható terápiás célpontok azonosításának szükségességét. A neurodegeneráció megelőzése (9). Az információhiány oka az a tény, hogy az idegsejteket széles körben nagyon korlátozott metabolikus rugalmassággal rendelkezőnek tekintik a környező szövetek sejttípusaihoz képest (10). Tekintettel arra, hogy ezek a sejtek központi szerepet játszanak a neuronok metabolitjainak ellátásának koordinálásában a szinaptikus transzmisszió elősegítése és a sérülésekre és betegségekre való reagálás érdekében, a sejtek anyagcseréjének az agyszövet kihívást jelentő körülményeihez való alkalmazkodásának képessége szinte csak a gliasejtekre korlátozódik (11-14). Ezenkívül az agyszövet inherens sejtes heterogenitása nagymértékben akadályozza a specifikus neuronális alcsoportokban bekövetkező metabolikus változások tanulmányozását. Ennek eredményeként keveset tudunk a neuronokban a mitokondriális diszfunkció pontos sejtes és metabolikus következményeiről.
A mitokondriális diszfunkció metabolikus következményeinek megértése érdekében izoláltunk Purkinje-neuronokat (PN-eket) a mitokondriális külső membrán fúziójának (Mfn2) károsodása által okozott neurodegeneráció különböző szakaszaiban. Bár az Mfn2 mutációk emberekben az örökletes motoros szenzoros neuropátia egy formájával, a Charcot-Marie-Tooth 2A típussal (15) társulnak, az Mfn2 feltételes pusztulása egerekben egy jól ismert oxidációs foszforilációs (OXPHOS) diszfunkció indukciós módszer. A különböző neuronális altípusokat (16-19) és az ebből eredő neurodegeneratív fenotípust progresszív neurológiai tünetek, például mozgási zavarok (18, 19) vagy cerebelláris ataxia (16) kísérik. A jelölésmentes kvantitatív (LFQ) proteomika, metabolomika, képalkotó és virológiai módszerek kombinációjának alkalmazásával kimutattuk, hogy a progresszív neurodegeneráció erősen indukálja a piruvát-karboxiláz (PCx) és más, a PN-ek arterioszklerózisában szerepet játszó faktorok enzimexpresszióját in vivo. Ennek a megállapításnak a relevanciájának igazolására specifikusan csökkentettük a PCx expresszióját az Mfn2-hiányos PN-ekben, és azt találtuk, hogy ez a művelet súlyosbította az oxidatív stresszt és felgyorsította a neurodegenerációt, bizonyítva ezzel, hogy az azoospermia metabolikus alkalmazkodóképességet biztosít a sejthalálhoz. Az MFN2 súlyos expressziója teljesen megmentheti a súlyos OXPHOS-hiány, a mitokondriális DNS hatalmas fogyasztása és a látszólag sérült mitokondriális hálózat miatt kialakult terminális degenerációs PN-t, ami tovább hangsúlyozza, hogy a neurodegeneráció ezen formája még a betegség előrehaladott stádiumában, a sejthalál előtt is regenerálódhat.
Az Mfn2 knockout PN-ek mitokondriumainak vizualizálásához egy olyan egértörzset használtunk, amely lehetővé teszi a Cre-függő mitokondriumok számára, hogy a sárga fluoreszcens fehérje (YFP) (mtYFP) (20) Cre expresszióját célozzák meg, és in vivo ellenőriztük a mitokondriális morfológiát. Azt tapasztaltuk, hogy az Mfn2 gén pusztulása a PN-ekben a mitokondriális hálózat fokozatos szétválásához vezet (S1A. ábra), és a legkorábbi változást 3 hetes korban tapasztaltuk. Ezzel szemben a PN sejtréteg jelentős degenerációja, amint azt a Calbindin immunfestés elvesztése is bizonyítja, csak 12 hetes korban kezdődött (1. ábra, A és B). A mitokondriális morfológia legkorábbi változásai és a neuronális halál látható megjelenése közötti időbeli eltérés arra késztetett minket, hogy megvizsgáljuk a mitokondriális diszfunkció által kiváltott metabolikus változásokat a sejthalál előtt. Kifejlesztettünk egy fluoreszcencia-aktivált sejtszortírozáson (FACS) alapuló stratégiát YFP-t (YFP+) expresszáló PN izolálására (1C. ábra), kontroll egerekben (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), a továbbiakban CTRL-ként (S1B. ábra). A kapuzási stratégia optimalizálása az YFP jel relatív intenzitása alapján lehetővé teszi számunkra, hogy megtisztítsuk a PN-ek YFP+ testét (YFPhigh) a nem PN-ekből (YFPneg) (S1B. ábra) vagy feltételezett fluoreszcens axon/dendritikus fragmensekből (YFPlow; S1D. ábra, balra), amit konfokális mikroszkóppal igazoltunk (S1D. ábra, jobbra). Az osztályozott populáció azonosságának ellenőrzése érdekében LFQ proteomikai, majd főkomponens-analízist végeztünk, és azt találtuk, hogy egyértelmű elkülönülés van az YFPhigh és az YFPneg sejtek között (S1C. ábra). Az YFPhigh sejtekben az ismert PN markerek (azaz Calb1, Pcp2, Grid2 és Itpr3) nettó feldúsulását mutatták (21, 22), de a neuronokban vagy más sejttípusokban általánosan expresszált fehérjék feldúsulását nem mutatták (1D. ábra). A független kísérletekben gyűjtött, osztályozott YFPhigh sejtekből származó minták összehasonlítása > 0,9-es korrelációs együtthatót mutatott, ami jó reprodukálhatóságot mutat a biológiai replikátumok között (S1E. ábra). Összefoglalva, ezek az adatok igazolták a megvalósítható PN akut és specifikus izolálására vonatkozó tervünket. Mivel az alkalmazott L7-cre meghajtórendszer mozaikos rekombinációt indukál a szülés utáni első héten (23), elkezdtük az egereket CTRL-ből selejtezni, és feltételesen (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) gyűjteni a neuronokat. A rekombináció befejeződése után 4 hetes korban Mfn2cKO-nak nevezzük. Végpontként 8 hetes kort választottunk, amikor a PN réteg ép volt a nyilvánvaló mitokondriális fragmentáció ellenére (1B. ábra és S1A. ábra). Összesen 3013 fehérjét számszerűsítettünk, amelyek közül körülbelül 22% a mitokondriális proteom mitokondriumként való meghatározásán alapuló MitoCarta 2.0 annotációkon alapult (1E. ábra) (24). A 8. héten elvégzett differenciális génexpressziós analízis azt mutatta, hogy az összes fehérje mindössze 10,5%-ánál mutatkozott szignifikáns változás (1F. ábra és S1F. ábra), amelyek közül 195 fehérje expressziója leértékelődött, 120 fehérje expressziója pedig felértékelődött (1F. ábra). Érdemes megjegyezni, hogy ezen adathalmaz „innovatív útvonalanalízise” azt mutatja, hogy a differenciálisan expresszált gének főként egy korlátozott számú specifikus metabolikus útvonalhoz tartoznak (1G. ábra). Érdekes módon, bár az OXPHOS-hoz és a kalciumjelátvitelhez kapcsolódó útvonalak szabályozásának csökkenése megerősíti a mitokondriális diszfunkció indukcióját a fúzióhiányos PN-ekben, más kategóriák, amelyek főként az aminosav-anyagcserét érintik, jelentősen felértékelődnek, ami összhangban van a mitokondriális PN-ekben zajló anyagcserével. Az áthuzalozás következetes.
(A) CTRL és Mfn2cKO egerek kisagymetszeteinek reprezentatív konfokális fényképei, amelyek a PN-ek progresszív elvesztését mutatják (kalbindin, szürke); a sejtmagokat DAPI-val kontrasztfestettük. (B) Az (A) mennyiségi meghatározása (egyutas varianciaanalízis, ***P<0,001; n = 4-6 kör három egérből). (C) Kísérleti munkafolyamat. (D) Purkinje- (fent) és más sejttípusokra (középen) specifikus markerek hőtérkép-eloszlása. (E) Venn-diagram, amely a besorolt ​​PN-ben azonosított mitokondriális fehérjék számát mutatja. (F) Az Mfn2cKO neuronokban 8 hét elteltével differenciálisan expresszált fehérjék vulkándiagramja (szignifikanciahatárérték 1,3). (G) A kreativitásútvonal-elemzés a 8 hetesként besorolt ​​Mfn2cKO PN öt legfontosabb up-regulációs (piros) és down-regulációs (kék) útvonalát mutatja. Az egyes detektált fehérjék átlagos expressziós szintje látható. Szürkeárnyalatos hőtérkép: korrigált P-érték. ns, nem fontos.
A proteomikai adatok azt mutatták, hogy az I., III. és IV. komplexek fehérjeexpressziója fokozatosan csökkent. Az I., III. és IV. komplexek mindegyike esszenciális mtDNS-kódolású alegységeket tartalmazott, míg a II. komplex, amely csak a magban kódolt, alapvetően nem változott (2A. ábra és S2A. ábra). . A proteomikai eredményekkel összhangban a kisagyi szövetmetszetek immunhisztokémiája azt mutatta, hogy a IV. komplex MTCO1 (mitokondriális citokróm C-oxidáz 1. alegység) alegységének szintje a PN-ben fokozatosan csökkent (2B. ábra). Az mtDNS-kódolású Mtatp8 alegység szignifikánsan csökkent (S2A. ábra), míg a nukleáris ATP-szintáz alegység állandósult szintje változatlan maradt, ami összhangban van az ismert stabil F1 ATP-szintáz alegységgel, amikor a mtDNS expresszió stabil. A képződés konzisztens. Megszakítás (7). A mtDNS-szint valós idejű polimeráz láncreakcióval (qPCR) történő értékelése a rendezett Mfn2cKO PN-ekben megerősítette az mtDNS kópiaszámának fokozatos csökkenését. A kontrollcsoporthoz képest 8 hetes korban az mtDNS-szintnek csak körülbelül 20%-a maradt meg (2C. ábra). Ezekkel az eredményekkel összhangban az Mfn2cKO PN-ek konfokális mikroszkópos festését alkalmaztuk a DNS kimutatására, amely a mitokondriális nukleotidok időfüggő fogyasztását mutatta (2D. ábra). Azt tapasztaltuk, hogy csak néhány, a mitokondriális fehérjelebontásban és a stresszválaszban részt vevő jelölt esetében volt felülszabályozott, beleértve a Lonp1-et, az Afg3l2-t és a Clpx-t, valamint az OXPHOS komplex összeszerelési faktorokat. Az apoptózisban részt vevő fehérjék szintjében nem észleltünk szignifikáns változást (S2B. ábra). Hasonlóképpen azt találtuk, hogy a kalciumtranszportban részt vevő mitokondriumokban és endoplazmatikus retikulum csatornákban csak kisebb változások történtek (S2C. ábra). Ezenkívül az autofágiával kapcsolatos fehérjék értékelése nem talált szignifikáns változásokat, ami összhangban van az autofagoszómák in vivo immunhisztokémiával és elektronmikroszkóppal megfigyelt látható indukciójával (S3. ábra). A PN-ekben azonban a progresszív OXPHOS diszfunkció nyilvánvaló ultrastrukturális mitokondriális változásokkal jár. Mitokondriális klaszterek figyelhetők meg az 5 és 8 hetes Mfn2cKO PN-ek sejttesteiben és dendritfáiban, és a belső membrán szerkezete mélyreható változásokon ment keresztül (S4., A és B ábra). Ezekkel az ultrastrukturális változásokkal és az mtDNS jelentős csökkenésével összhangban az akut agyi kisagyszeletek tetrametil-rodamin-metil-észterrel (TMRM) végzett elemzése kimutatta, hogy az Mfn2cKO PN-ekben a mitokondriális membránpotenciál jelentősen csökkent (S4C ábra).
(A) Az OXPHOS komplex expressziós szintjének időbeli lefolyású elemzése. Csak a 8. héten P<0,05 értékű fehérjéket vesszük figyelembe (kétutas ANOVA). Szaggatott vonal: Nincs korrekció a CTRL-hez képest. (B) Balra: Példa egy anti-MTCO1 antitesttel jelölt kisagymetszetre (skálasáv, 20 μm). A Purkinje-sejtek által elfoglalt területet sárga szín borítja. Jobbra: Az MTCO1 szintek mennyiségi meghatározása (egyutas varianciaanalízis; n = 7-20 sejtet elemezve három egérből). (C) A mtDNS kópiaszám qPCR elemzése a rendezett PN-ben (egyutas varianciaanalízis; n = 3-7 egér). (D) Balra: Példa egy anti-DNS antitesttel jelölt kisagyszeletre (skálasáv, 20 μm). A Purkinje-sejtek által elfoglalt területet sárga szín borítja. Jobbra: Az mtDNS léziók mennyiségi meghatározása (egyutas varianciaanalízis; n = 5-9 sejtet elemezve három egérből). (E) Példa egy akut kisagymetszetre, amelyen mitoYFP + Purkinje-sejtek (nyíl) láthatók teljes sejtes patch clamp felvételben. (F) Az IV görbe mennyiségi meghatározása. (G) A depolarizáló áram injekciójának reprezentatív felvételei CTRL és Mfn2cKO Purkinje sejtekben. Felső görbe: Az első impulzus, amely AP-t váltott ki. Alsó görbe: Maximális AP frekvencia. (H) Posztszinaptikus spontán bemenetek (sPSP-k) mennyiségi meghatározása. A reprezentatív rögzítési görbe és annak zoom aránya az (I) ábrán látható. Egyutas varianciaanalízissel elemeztük n = 5-20 sejtet három egérből. Az adatokat átlag±SEM-ként fejeztük ki; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) A spontán AP reprezentatív görbéi, amelyeket perforált patch clamp móddal rögzítettünk. Felső görbe: Maximális AP frekvencia. Alsó görbe: egyetlen AP zoomolása. (K) Számítsa ki az átlagos és maximális AP frekvenciát a (J) szerint. Mann-Whitney teszt; n = 5 sejtet elemeztünk négy egérből. Az adatokat átlag±SEM-ként fejeztük ki; nem fontos.
Egyenletes OXPHOS károsodást észleltünk a 8 hetes Mfn2cKO PN-ben, ami arra utal, hogy a neuronok fiziológiai funkciója súlyosan kóros. Ezért elemeztük az OXPHOS-hiányos neuronok passzív elektromos jellemzőit 4-5 hetes és 7-8 hetes korban teljes sejtes patch clamp felvételekkel akut kisagyszeletekben (2E. ábra). Váratlan módon az Mfn2cKO neuronok átlagos nyugalmi membránpotenciálja és bemeneti ellenállása hasonló volt a kontrollhoz, bár a sejtek között finom különbségek voltak (1. táblázat). Hasonlóképpen, 4-5 hetes korban nem találtunk szignifikáns változást az áram-feszültség összefüggésben (IV görbe) (2F. ábra). Azonban egyetlen 7-8 hetes Mfn2cKO neuron sem élte túl az IV-es adagolási rendet (hiperpolarizációs lépés), ami arra utal, hogy ebben a késői szakaszban egyértelműen érzékeny a hiperpolarizációs potenciálra. Ezzel szemben az Mfn2cKO neuronokban a depolarizáló áramok, amelyek ismétlődő akciós potenciál (AP) kisüléseket okoznak, jól tolerálhatók, ami azt jelzi, hogy teljes kisülési mintázatuk nem különbözik szignifikánsan a 8 hetes kontrollneuronokétól (1. táblázat és 2G. ábra). Hasonlóképpen, a spontán posztszinaptikus áramok (sPSC-k) frekvenciája és amplitúdója összehasonlítható volt a kontrollcsoportéval, és az események gyakorisága 4 hétről 5 hétre, majd 7 hétre, majd 8 hétre nőtt hasonló növekedéssel (2. ábra, H és I). A szinaptikus érés időtartama a PN-ekben (25). Hasonló eredményeket kaptunk perforált PN-tapaszok után. Ez a konfiguráció megakadályozza a sejtes ATP-hibák esetleges kompenzációját, ami a teljes sejtes patch clamp rögzítés során előfordulhat. Különösen az Mfn2cKO neuronok nyugalmi membránpotenciálja és spontán tüzelési gyakorisága nem változott (2. ábra, J és K). Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatják, hogy a nyilvánvaló OXPHOS-diszfunkcióval rendelkező PN-ek jól megbirkóznak a nagyfrekvenciás kisülési mintázatokkal, ami arra utal, hogy létezik egy kompenzációs mechanizmus, amely lehetővé teszi számukra a közel normális elektrofiziológiai válaszok fenntartását.
Az adatokat átlag ± SEM formában fejezzük ki (egyutas varianciaanalízis, Holm-Sidak-féle többszörös összehasonlító teszt; *P<0,05). Az egységszámot zárójelben jelezzük.
Célunk annak vizsgálata volt, hogy a proteomikai adatkészletben (1G. ábra) található bármely kategória tartalmaz-e olyan útvonalakat, amelyek ellensúlyozhatják a súlyos OXPHOS-hiányt, ezáltal megmagyarázva, hogy az érintett PN miért tarthatja fenn a közel normális elektrofiziológiát (2. ábra, E-től K-ig). A proteomikai elemzés kimutatta, hogy az elágazó láncú aminosavak (BCAA) katabolizmusában részt vevő enzimek szignifikánsan felregulálódtak (3A. ábra és S5A. ábra), és a végtermék, az acetil-CoA (CoA) vagy a szukcinil-CoA kiegészítheti a trikarboxilátokat az arterioszklerózis savciklusában (TCA). Azt tapasztaltuk, hogy a BCAA transzamináz 1 (BCAT1) és a BCAT2 tartalma is megnőtt. Ezek a BCAA katabolizmus első lépését katalizálják glutamát előállításával az α-ketoglutarátból (26). Az elágazó láncú ketosav-dehidrogenáz (BCKD) komplexet alkotó összes alegység felregulálódik (a komplex katalizálja a keletkező BCAA szénváz későbbi és irreverzibilis dekarboxilezését) (3A. ábra és S5A. ábra). Azonban a szortírozott PN-ben nem találtak nyilvánvaló változásokat magában a BCAA-ban, ami esetleg ezen esszenciális aminosavak fokozott sejtes felvételének vagy más források (glükóz vagy tejsav) TCA-ciklus kiegészítésére való felhasználásának tudható be (S5B. ábra). Az OXPHOS-hiányos PN-ek 8 hetes korban fokozott glutamin-lebontást és transzaminációs aktivitást is mutattak, ami a glutamináz (GLS) és a glutamin-piruvát-transzamináz 2 (GPT2) mitokondriális enzimek felszabályozásában tükröződhet (3. ábra, A és C). Érdemes megjegyezni, hogy a GLS felszabályozása a spliced ​​izoform glutamináz C-re (GLS-GAC) korlátozódik (az Mfn2cKO/CTRL változása körülbelül 4,5-szeres, P = 0,05), és specifikus felszabályozása a rákos szövetekben támogathatja a mitokondriális bioenergiát. (27)
(A) A hőtérkép a fehérjeszint változását mutatja a megadott útvonal esetén 8 hét elteltével. (B) Példa egy anti-PCx antitesttel jelölt kisagyszeletre (skálasáv, 20 μm). A sárga nyíl a Purkinje-sejttestre mutat. (C) Időbeli lefolyású fehérjeexpressziós analízis, amelyet az ateroszklerózis fontos jelöltjeként azonosítottak (többszörös t-teszt, *FDR <5%; n = 3-5 egér). (D) Fent: Vázlatos ábra, amely az [1-13C]piruvát nyomjelzőben található jelölt szén bejutásának különböző módjait mutatja (azaz PDH-n vagy transzarteriális úton). Alul: A hegedűdiagram az egyszeresen jelölt szén (M1) aszparaginsavvá, citromsavvá és almasavvá alakulásának százalékos arányát mutatja az akut kisagyszeletek [1-13C]piruváttal történő jelölése után (párosított t-teszt; ** P <0,01). (E) A jelzett útvonal átfogó időbeli lefolyású elemzése. Csak azokat a fehérjéket vegye figyelembe, amelyeknél P<0,05 a 8. héten. Szaggatott vonal: nincs korrekciós érték (kétutas varianciaanalízis; * P <0,05; *** P <0,001). Az adatokat átlag±SEM formában fejezzük ki.
Elemzésünkben a BCAA katabolizmus az egyik kulcsfontosságú upregulációs útvonallá vált. Ez a tény erősen arra utal, hogy a TCA ciklusba belépő ventilációs térfogat megváltozhat OXPHOS-hiányos PN-ben. Ez a neuronális metabolikus átrendeződés egyik fő formáját képviselheti, amely közvetlen hatással lehet a neuronális fiziológiára és a túlélésre a súlyos OXPHOS diszfunkció fenntartása során. Ezzel a hipotézissel összhangban azt találtuk, hogy a fő anti-ateroszklerotikus enzim, a PCx fel van szabályozva (Mfn2cKO/CTRL körülbelül 1,5-szeresére változik; 3A. ábra), amely katalizálja a piruvát oxaloacetáttá való átalakulását (28), amelyről feltételezik, hogy az agyszövetben található. Az expresszió az asztrocitákra korlátozódik (29, 30). A proteomikai eredményekkel összhangban a konfokális mikroszkópia kimutatta, hogy a PCx expressziója specifikusan és szignifikánsan megnövekedett az OXPHOS-hiányos PN-ekben, míg a PCx reaktivitása főként a kontroll szomszédos Bergmann gliasejtjeire korlátozódott (3B. ábra). A PCx megfigyelt felregulációjának funkcionális teszteléséhez akut kisagyszeleteket [1-13C]piruvát nyomjelzővel kezeltünk. Amikor a piruvátot piruvát-dehidrogenáz (PDH) oxidálta, izotóp jelölései eltűntek, viszont beépültek a TCA ciklus intermedierjeibe, amikor a piruvát vaszkuláris reakciók révén metabolizálódott (3D. ábra). Proteomikai adatainkat alátámasztva, nagyszámú markert figyeltünk meg ebből a nyomjelzőből az Mfn2cKO szeletek aszparaginsavában, míg a citromsav és az almasav esetében is mérsékelt, bár nem szignifikáns tendencia volt megfigyelhető (3D. ábra).
A mitokondriális transzkripciós faktor A génjét (Tfam) specifikusan elpusztító dopamin neuronok által okozott mitokondriális diszfunkciójú MitoPark egerek dopamin neuronjaiban (S6B. ábra) a PCx expressziója szintén szignifikánsan megnőtt (31), ami az acetonsavas arterioszklerózisra utal. A betegség előfordulását a szervezetben található neuronális OXPHOS diszfunkciója szabályozza. Érdemes megjegyezni, hogy kimutatták, hogy az arterioszklerózissal összefüggésben álló neuronokban expresszálódó egyedi enzimek (32-34) jelentősen megnőnek az OXPHOS-hiányos PN-ekben, mint például a propionil-CoA karboxiláz (PCC-A), a malonil-CoA a propionil-CoA-t szukcinil-CoA-vá alakítja, valamint a mitokondriális almasav enzim 3 (ME3), amelynek fő szerepe a piruvát kinyerése malátból (3. ábra, A és C) (33, 35). Ezenkívül jelentős növekedést tapasztaltunk a Pdk3 enzimben, amely foszforilálja és ezáltal inaktiválja a PDH-t (36), míg a PDH-t aktiváló Pdp1 enzimben vagy magában a PDH enzimkomplexben nem észleltünk változást (3A. ábra). Ennek megfelelően a Mern2cKO PN-ekben a Ser293-ban található PDH komplex piruvát-dehidrogenáz E1 komponensének α1 alegységének α (PDHE1α) alegységének foszforilációja (ismert, hogy gátolja a PDH enzimaktivitását) fokozódott (S6C. ábra) (S6C. ábra). A piruvátnak nincs érrendszeri hozzáférése.
Végül azt találtuk, hogy a szerin és glicin bioszintézisének szuper útvonala, a kapcsolódó mitokondriális folát (1C) ciklus és a prolin bioszintézis (1G. ábra és S5C. ábra) mind jelentősen felregulálódott a jelentések szerint az aktivációs folyamat során. A környező szövetek mitokondriális diszfunkcióval aktiválódnak (5-7). Az ezeket a proteomikai adatokat alátámasztó konfokális analízis kimutatta, hogy OXPHOS hiányában a PN-ben 8 hetes egerek kisagyszeleteit szerin-hidroximetiltranszferáz 2-nek (SHMT2) vetették alá, amely a mitokondriális folátciklus kulcsenzime. Jelentős immunválaszt tapasztaltunk (S5D. ábra). 13 CU-glükózzal inkubált akut kisagyszeletben a metabolikus nyomkövetési kísérletek tovább megerősítették a szerin és prolin bioszintézisének felregulációját, jelezve, hogy a szén izoformák szerinné és prolinná történő áramlása megnőtt (S5E. ábra). Mivel a GLS és a GPT2 által elősegített reakciók felelősek a glutamin glutaminból történő glutamin szintéziséért, valamint a glutamát és az α-ketoglutarát közötti transzaminációért, ezek felregulációja arra utal, hogy az OXPHOS-hiányos neuronoknak fokozott glutamátigényük van. Ez a prolin fokozott bioszintézisének fenntartását célozhatja (S5C. ábra). Ezzel szemben a PN-specifikus Mfn2cKO egerek cerebelláris asztrocitáinak proteomikai elemzése kimutatta, hogy ezek az útvonalak (beleértve az összes antiperoxidázt) nem változtak szignifikánsan az expresszióban, ami azt mutatja, hogy ez a metabolikus átirányítás szelektív a lebontott PN-re (S6. ábra, D-G).
Összefoglalva, ezek az elemzések a PN-ek specifikus metabolikus útvonalainak időbeli aktivációjának szignifikánsan eltérő mintázatait tárták fel. Bár a kóros neuronális mitokondriális funkció korai ateroszklerózishoz és 1C átalakuláshoz vezethet (3E. ábra és S5C. ábra), sőt, az I és IV komplexek expressziójának kiszámítható változásaihoz is, a szerin de novo szintézisében bekövetkező változások csak az OXPHOS diszfunkciójának tudhatók be (3E. ábra és S5C. ábra). Ezek az eredmények egy szekvenciális folyamatot határoznak meg, amelyben a stressz által kiváltott mitokondriális (1C ciklus) és citoplazmatikus (szerin bioszintézis) szinergikusan reagál az ateroszklerózis TCA ciklusban történő növekedésével, átalakítva a neuronális anyagcserét.
A 8 hetes OXPHOS-hiányos PN-ek képesek fenntartani a nagyfrekvenciás gerjesztési aktivitást, és jelentős metabolikus újrakapcsolódáson mennek keresztül a mitokondriális diszfunkció kompenzálása érdekében. Ez a felfedezés érdekes lehetőséget vet fel, hogy még ebben a pillanatban is ezek a sejtek terápiás beavatkozást kaphatnak a neurodegeneráció késleltetésére vagy megelőzésére. Ezt a lehetőséget két független beavatkozással oldottuk meg. Az első módszerben egy Cre-függő adeno-asszociált vírus (AAV) vektort terveztünk, hogy az MFN2 szelektíven expresszálódhasson az OXPHOS-hiányos PN-ekben in vivo (S7A. ábra). Az MFN2-t kódoló AAV-t és az mCherry (Mfn2-AAV) fluoreszcens riportergént in vitro primer neuronkultúrákban igazoltuk, ami az MFN2 Cre-függő expresszióját okozta, és helyreállította a mitokondriális morfológiát, ezáltal megakadályozva a neuromutációt az Mfn2cKO neuronokban (S7., B, D és E ábra). Ezután in vivo kísérleteket végeztünk 8 hetes Mfn2-AAV sztereotaktikus bejuttatásával Mfn2cKO és kontroll egerek kisagykéregébe, majd 12 hetes egereket elemeztünk (4A. ábra). A kezelt Mfn2cKO egerek elpusztultak (1. ábra, A és B) (16). Az in vivo vírustranszdukció a PN szelektív expresszióját eredményezte egyes kisagyi körökben (S7. ábra, G és H). A csak mCherry-t expresszáló kontroll AAV (Ctrl-AAV) injekciója nem befolyásolta szignifikánsan a neurodegeneráció mértékét az Mfn2cKO állatokban. Ezzel szemben az Mfn2-AAV-val transzdukált Mfn2cKO-k elemzése a PN sejtréteg jelentős védőhatását mutatta (4. ábra, B és C). Különösen a neuronsűrűség tűnik szinte megkülönböztethetetlennek a kontroll állatokétól (4. ábra, B és C, valamint S7. ábra, H és I). Az MFN1, de nem az MFN2 expressziója ugyanolyan hatékony a neuronális halál megmentésében (4C. ábra és S7., C. és F. ábra), ami arra utal, hogy az ektopikus MFN1 expressziója hatékonyan pótolhatja az MFN2 hiányát. Az egyes PN-ek szintjén végzett további elemzés kimutatta, hogy az Mfn2-AAV nagymértékben helyreállította a mitokondriumok ultrastruktúráját, normalizálta az mtDNS-szinteket, és visszafordította az angiogenezis elleni PCx ​​marker ​​magas expresszióját (4. ábra, C-E). A nyugalmi állapotban lévő, helyreállított Mfn2cKO egerek vizuális vizsgálata azt mutatta, hogy testtartásuk és motoros tüneteik (S1-S3 mozgás) javultak. Összefoglalva, ezek a kísérletek azt mutatják, hogy az MFN2 késleltetett visszahelyezése a súlyosan OXPHOS-hiányos PN-ekbe elegendő az mtDNS-fogyasztás visszafordításához és az ateroszklerózis kiváltásához, ezáltal megelőzve az axondegenerációt és a neuronális halált in vivo.
(A) Az MFN2-t kódoló AAV injekciózásának kísérleti ütemtervét bemutató ábra, amikor a jelzett metabolikus útvonal aktiválódik. (B) 12 hetes, 8 hetesen Mfn2cKO egerekbe transzdukált és anti-Calbindin antitesttel jelölt kisagyszeletek reprezentatív konfokális képei. Jobbra: Az axonrostok méretezése. Az axon zoom mérete 450 és 75 μm. (C) Balra: A Purkinje-sejtek sűrűségének mennyiségi meghatározása az AAV transzdukciós hurokban (AAV+) (egyutas varianciaanalízis; n = 3 egér). Jobbra: mtDNS fókuszanalízis transzdukált PN-ben a 12. héten (párosítatlan t-teszt; n = 6 sejt három egérből). * P <0,05; ** P <0,01. (D) A jelzett vírusvektorokkal transzdukált Mfn2cKO kisagymetszetek PN-jeinek reprezentatív transzmissziós elektronmikroszkópos képei. A rózsaszín maszk a dendritek által elfoglalt területet, a sárga pontozott négyzet pedig a jobb oldalon látható zoomot mutatja; Az n a sejtmagot jelöli. A léptéksáv 1 μm. Az (E) a PCx festődés példáját mutatja 12 héttel transzdukált PN-ben. A léptéksáv 20 μm. OE, túltermelés; FC, változás a sejtmagban.
Végül megvizsgáltuk a peroxidáz által indukált sejttúlélés fontosságát OXPHOS diszfunkciót tapasztaló perifériális őssejtekben (PN). Létrehoztunk egy mCherry-t kódoló AAV-shRNS-t (rövid hajtű RNS), amely specifikusan az egér PCx ​​mRNS-ét (AAV-shPCx) célozta meg, és a vírust vagy annak kódolt kontrollját (AAV-scr) Mfn2cKO egerek kisagyába injektáltuk. Az injekciót a negyedik hetekben végeztük (5A. ábra), hogy hatékony PCx leállást érjünk el abban az időszakban, amikor a PCx expressziója fokozódott (3C. ábra), és a PN sejtréteg még ép volt (1A. ábra). Érdemes megjegyezni, hogy a PCx leütése (S8A. ábra) a PN-pusztulás jelentős felgyorsulásához vezet, amely a fertőzött gyűrűre korlátozódik (5., B. és C. ábra). A PCx felregulációja által kiváltott metabolikus hatások mechanizmusának megértése érdekében vizsgáltuk a PN-ek redox állapotát a PCx ​​leütése után, és az AAV-közvetített Grx1-roGFP2 optikai bioszenzor egyidejű expresszióját figyeltük meg (S8. ábra, B-D) a glutation és a peptid redoxpotenciáljának relatív változásának értékelése érdekében (38). Ezután kétfotonos fluoreszcens élettartam képalkotó mikroszkópiát (FLIM) végeztünk 7 hetes Mfn2cKO vagy kontroll alomtársak akut agyszeleteiben, hogy kimutassuk a citoplazmatikus redox állapot esetleges változásait a FLIM körülmények ellenőrzése után (S8. ábra, E-G). Az elemzés kimutatta az oxidációs állapot jelentős növekedését egyetlen, PCx expressziót nem mutató Mfn2cKO PN-nél, ami eltér a kontroll neuronoktól vagy a csak kódolt shRNS-t expresszáló Mfn2cKO PN-ektől (5. ábra, D és E). Amikor a PCx expresszióját csökkentettük, az erősen oxidált állapotot mutató Mfn2cKO PN-ek százalékos aránya több mint háromszorosára nőtt (5E. ábra), ami azt jelzi, hogy a PCx fel-szabályozása fenntartotta a degenerált neuronok redox kapacitását.
(A) Az shPCx-et kódoló AAV injekciózásának kísérleti ütemtervét bemutató ábra, amikor a jelzett metabolikus útvonal aktiválódik. (B) 8 hetes Mfn2cKO egerek 8 hetes kisagymetszeteinek reprezentatív konfokális fényképei, amelyeket 4 héttel később transzdukáltak és anti-kalcineurin antitesttel jelöltek. Lépték, 450 μm. (C) A Purkinje-sejtek sűrűségének mennyiségi meghatározása AAV-transzdukált hurkokban (egyutas varianciaanalízis; n = 3-4 egér). Az adatokat átlag±SEM-ként fejeztük ki; ***P<0,001. (D) A reprezentatív FLIM kép a glutation redox szenzor Grx1-roGFP2-t expresszáló 7 hetes PN átlagos élettartamát mutatja a megadott kísérleti körülmények között. LUT (keresőtábla) arány: túlélési időintervallum (pikozekundumban). Lépték, 25 μm. (E) A hisztogram a (D) pontból származó Grx1-roGFP2 élettartam értékek eloszlását mutatja (n=158-368 sejt két egérben mindkét körülmények között). Az egyes hisztogramok feletti kördiagram a szignifikánsan hosszabb (piros, oxidált) vagy rövidebb (kék, csökkent) élettartam értékekkel rendelkező sejtek számát mutatja, amelyek meghaladják a CTRL-AAV-scr átlagos élettartam értékének 1 SD-jét. (F) A javasolt modell a neuronális PCx felregulációjának védő hatását mutatja.
Összességében az általunk bemutatott adatok azt mutatják, hogy az MFN2 újra-expressziója teljes mértékben megmentheti az előrehaladott, súlyos OXPHOS-hiányos, súlyos mtDNS-hiányos és rendkívül abnormális ista-szerű morfológiájú perifériális nyirokcsomót (PN), ezáltal folyamatos progressziót biztosítva még előrehaladott betegségek esetén is. A neurodegeneráció reverzibilis bizonyítékot szolgáltat a sejthalál előtti stádiumra. Az anyagcsere-rugalmasságnak ezt a fokát tovább hangsúlyozza az idegsejtek ateroszklerózist kiváltó képessége (a TCA-ciklus áthuzalozása), amely gátolja a PCx expresszióját az OXPHOS-hiányos PN-ekben és fokozza a sejthalált, ezáltal védő szerepet játszik (5F. ábra).
Ebben a tanulmányban bizonyítékot szolgáltattunk arra, hogy a PN-ek OXPHOS diszfunkcióra adott válasza az, hogy fokozatosan konvergálnak a TCA ciklusú ateroszklerózishoz a metabolikus programok által aktivált differenciális aktivációs útvonalon keresztül. A proteomikai elemzést számos kiegészítő módszerrel megerősítettük, és kimutattuk, hogy súlyos mitokondriális diszfunkció esetén a neuronok egy korábban ismeretlen metabolikus rugalmassággal rendelkeznek. Meglepetésünkre a teljes áthuzalozási folyamat nem feltétlenül jelzi a neurodegenerációt fokozatosan és visszafordíthatatlanul kísérő terminális metabolikus állapotot, de adataink arra utalnak, hogy még a sejthalál előtti szakaszban is fenntartó neuront alkothat a funkcionális kompenzációs mechanizmusban. Ez a megállapítás arra utal, hogy a neuronok jelentős mértékű metabolikus plaszticitással rendelkeznek a szervezetben. Ez a tény bizonyítja, hogy az MFN2 későbbi újbóli bevezetése visszafordíthatja a kulcsfontosságú metabolikus markerek expresszióját és megelőzheti a PN degenerációját. Épp ellenkezőleg, gátolja az ateroszklerózist és felgyorsítja az idegek működését. transzszexuális.
Kutatásunk egyik legérdekesebb megállapítása, hogy az OXPHOS-hiányos perifériális neuronok módosíthatják a TCA ciklus anyagcseréjét azáltal, hogy felülszabályozzák azokat az enzimeket, amelyek specifikusan stimulálják az érelmeszesedést. A metabolikus átrendeződés a rákos sejtek gyakori jellemzője, amelyek közül néhány glutaminra támaszkodik a TCA ciklus intermedierjeinek kiegészítésére, hogy redukáló ekvivalenseket termeljen, amelyek hajtják a légzési láncot és fenntartják a lipid- és nukleotidbioszintézis prekurzorainak termelését (39, 40). Egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy az OXPHOS diszfunkciót tapasztaló perifériás szövetekben a glutamin/glutamát anyagcsere újrakapcsolódása szintén kiemelkedő jellemző (5, 41), ahol a glutamin TCA ciklusba való belépés iránya az OXPHOS sérülés súlyosságától függ (41). Azonban nincsenek egyértelmű bizonyítékok a neuronális metabolikus plaszticitás hasonlóságára a szervezetben, és annak lehetséges relevanciájára a betegség kontextusában. Egy nemrégiben készült in vitro vizsgálatban kimutatták, hogy az elsődleges kérgi neuronok mobilizálják a glutamát készleteket a neurotranszmisszióhoz, ezáltal elősegítve az oxidatív anyagcserét és az ateroszklerózist metabolikus stressz körülmények között (42). Érdemes megjegyezni, hogy a TCA ciklus enzim szukcinát-dehidrogenáz farmakológiai gátlása alatt a piruvát-karboxiláció feltételezhetően fenntartja az oxaloacetát szintézisét tenyésztett kisagyi szemcseneuronokban (34). Azonban ezeknek a mechanizmusoknak az agyszövetre gyakorolt ​​fiziológiai jelentősége (ahol az ateroszklerózis feltehetően főként az asztrocitákra korlátozódik) továbbra is fontos fiziológiai jelentőséggel bír (43). Ebben az esetben adataink azt mutatják, hogy a szervezetben az OXPHOS által károsított PN-ek átkapcsolhatók BCAA lebontásra és piruvát-karboxilációra, amelyek a TCA-készlet intermedierjeinek kiegészítésének két fő forrása. Bár a BCAA-katabolizmus feltételezett hozzájárulását a neuronális energia-anyagcseréhez felvetették, a glutamát és a GABA neurotranszmisszióban betöltött szerepe mellett (44), in vivo még mindig nincs bizonyíték ezekre a mechanizmusokra. Ezért könnyű feltételezni, hogy a diszfunkcionális PN-ek automatikusan kompenzálhatják az asszimilációs folyamat által vezérelt TCA-intermedierek fogyasztását az ateroszklerózis fokozásával. Különösen a PCx felszabályozása lehet szükséges az aszparaginsav iránti megnövekedett igény fenntartásához, amire a mitokondriális diszfunkcióval rendelkező proliferáló sejtekben lehet példa (45). Metabolomikai elemzésünk azonban nem mutatott ki szignifikáns változást az aszparaginsav állandó állapotú szintjében az Mfn2cKO PN-ekben (S6A. ábra), ami feltehetően az aszparaginsav eltérő metabolikus hasznosulását tükrözi a proliferáló sejtek és a posztmitotikus neuronok között. Bár a PCx felszabályozásának pontos mechanizmusa in vivo a diszfunkcionális neuronokban még jellemzésre vár, kimutattuk, hogy ez a korai válasz fontos szerepet játszik a neuronok redox állapotának fenntartásában, amit kisagyszeleteken végzett FLIM kísérletekben is kimutatták. Különösen a PN-ek PCx felszabályozásának megakadályozása oxidáltabb állapothoz vezethet és felgyorsíthatja a sejthalált. A BCAA lebontásának aktiválása és a piruvát karboxilezése nem jellemzi a mitokondriális diszfunkció perifériás szöveteit (7). Ezért úgy tűnik, hogy ezek az OXPHOS-hiányos neuronok kiemelt jellemzői, még ha nem is az egyetlenek, amelyek fontosak a neurodegeneráció szempontjából.
A kisagybetegség egy heterogén típusú neurodegeneratív betegség, amely általában ataxiaként jelentkezik, és gyakran károsítja a perifériális idegsejteket (PN) (46). Ez a neuronpopuláció különösen érzékeny a mitokondriális diszfunkcióra, mivel egerekben szelektív degenerációjuk elegendő az emberi spinocerebelláris ataxiát jellemző számos motoros tünet reprodukálásához (16, 47, 48). Jelentések szerint egy mutáns génnel rendelkező transzgénikus egérmodellt emberi spinocerebelláris ataxiával hoznak összefüggésbe, és mitokondriális diszfunkcióval rendelkezik (49, 50), ami hangsúlyozza az OXPHOS-hiány következményeinek tanulmányozásának fontosságát a PNPH-ban. Ezért különösen alkalmas ezen egyedülálló neuronpopuláció hatékony izolálására és tanulmányozására. Tekintettel azonban arra, hogy a PN-ek nagyon érzékenyek a nyomásra, és a teljes kisagysejt-populáció alacsony arányát teszik ki, számos omika-alapú vizsgálat esetében a teljes sejtekként való szelektív elválasztása továbbra is kihívást jelent. Bár szinte lehetetlen elérni más sejttípusok (különösen a felnőtt szövetek) szennyeződésének teljes hiányát, egy hatékony disszociációs lépést kombináltunk a FACS-szal, hogy elegendő számú életképes neuront kapjunk a downstream proteomikai elemzéshez, és meglehetősen magas fehérjelefedettséget (körülbelül 3000 fehérje) kapjunk a teljes kisagy meglévő adatkészletéhez képest (51). A teljes sejtek életképességének megőrzésével az általunk bemutatott módszer lehetővé teszi számunkra, hogy ne csak a mitokondriumokban bekövetkező metabolikus útvonalak változásait ellenőrizzük, hanem a citoplazmatikus megfelelőikben bekövetkező változásokat is, ami kiegészíti a mitokondriális membráncímkék használatát a sejttípusok gazdagítására. Az új módszer a mitokondriumok számára komplex szövetekben (52, 53). Az általunk leírt módszer nemcsak a Purkinje-sejtek vizsgálatához kapcsolódik, hanem könnyen alkalmazható bármilyen típusú sejtre a beteg agyak metabolikus változásainak kezelésére, beleértve a mitokondriális diszfunkció más modelljeit is.
Végül azonosítottunk egy terápiás ablakot ezen anyagcsere-átrendeződési folyamat során, amely teljesen visszafordíthatja a sejtes stressz főbb jeleit és megelőzheti a neuronális degenerációt. Ezért az itt leírt áthuzalozás funkcionális következményeinek megértése alapvető betekintést nyújthat a neuronális életképesség fenntartásának lehetséges kezeléseibe mitokondriális diszfunkció esetén. További kutatásokra van szükség, amelyek célja az energia-anyagcsere változásainak elemzése más agysejttípusokban, hogy teljes mértékben feltárhassuk ennek az elvnek az alkalmazhatóságát más neurológiai betegségekre.
A MitoPark egereket korábban már leírták (31). A loxP szegélyező Mfn2 génekkel rendelkező C57BL/6N egereket korábban már leírták (18), és L7-Cre egerekkel keresztezték (23). A kapott dupla heterozigóta utódokat ezután homozigóta Mfn2loxP/Mfn2loxP egerekkel keresztezték, hogy Purkinje-specifikus Mfn2 génkiütéseket hozzanak létre (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). A párosítások egy részében a Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP allélt (stop-mtYFP) további keresztezésekkel vitték be (20). Minden állatkísérletet az európai, nemzeti és intézményi irányelveknek megfelelően végeztek, és a LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Észak-Rajna-Vesztfália, Németország jóváhagyta. Az állatkísérletek az Európai Laboratóriumi Állattudományi Egyesületek irányelveit is követik.
A terhes nő nyaki ficamának érzéstelenítése után az egérembriót izolálták (E13). A kérget Hanks-féle kiegyensúlyozott sóoldatban (HBSS) boncolták, 10 mM Hepes-sel kiegészítve, majd Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalajra vitték át, amely papainot (20 U/ml) és ciszteint (1 μg/ml) tartalmazott. A szövetet DMEM-ben (Ml) inkubálták, majd enzimatikus emésztéssel disszociálták 37°C-on 20 percig, majd mechanikusan őrölték 10% magzati szarvasmarha-szérummal kiegészített DMEM-ben. A sejteket polilizinnel bevont üveg fedőlemezekre helyezték 2×106/6 cm-es tenyésztőedény sűrűséggel, vagy 0,5×105 sejt/cm2 sűrűséggel képalkotó elemzéshez. 4 óra elteltével a táptalajt Neurobasal szérummentes táptalajra cserélték, amely 1% B27-kiegészítést és 0,5 mM GlutaMax-ot tartalmazott. A neuronokat ezután a kísérlet során végig 37°C-on és 5% CO2-atmoszférában tartottuk, és hetente egyszer etettük. Az in vitro rekombináció kiváltása érdekében a második napon a következő AAV9 vírusvektor 3 μl-ét (24-lyukú tenyésztőcsésze) vagy 0,5 μl-ét (24-lyukú lemez) használtuk a neuronok in vitro kezelésére: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, katalógusszám: 105530-AAV9) és AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, katalógusszám: 105545-AAV9).
Az egér Mfn1 és Mfn2 komplementer DNS-ét (az Addgene #23212 és #23213 plazmidokból nyerve) a C-terminálison a V5 szekvenciával (GKPIPNPLLGLDST) jelöltük, és a T2A szekvencián keresztül keretben fuzionáltunk az mCherry-vel. A Grx1-roGFP2 a Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) ajándéka. A tdTomato kazetta hagyományos klónozási módszerekkel történő cseréjével a kazettát a pAAV-CAG-FLEX-tdTomato gerincbe (Addgene referenciaszám: 28306) szubklónoztuk, így létrehozva a pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 és pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vektorokat. Hasonló stratégiát alkalmaztunk a pAAV-CAG-FLEX-mCherry kontrollvektor előállítására. Az AAV-shPCx konstrukció létrehozásához egy AAV plazmid vektor (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) szükséges, amely tartalmazza az egér PCx-et célzó shRNS-t kódoló DNS-szekvenciát (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Az U6 promoter szabályozása alatt az mCherry-t a CMV promoter szabályozása alatt használtuk. A kiegészítő AAV vektorok előállítását a gyártó (Cell Biolabs) utasításai szerint végeztük. Röviden, használjon egy mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) kódoló gént, valamint az AAV1 kapszidfehérjét és a járulékos fehérjét kódoló csomagoló plazmid plazmidot tartalmazó transzfer plazmidot kalcium-foszfát módszerrel. A nyers vírus felülúszót fagyasztás-olvadás ciklusokkal nyerték szárazjég/etanol fürdőben, és a sejteket foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) lizálták. Az AAV vektort szakaszos jodixanol gradiens ultracentrifugálással tisztítottuk (24 óra 32 000 fordulat/perc sebességgel és 4°C-on), majd Amicon ultra-15 centrifugális szűrőn koncentráltuk. Az AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 genomkópia (GC)/ml], az AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), az AAV1-CAG-FLEX genom titerét a korábban leírtak szerint (54) mértük valós idejű kvantitatív PCR-rel (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) és AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml) segítségével.
Az elsődleges neuronokat jéghideg 1x PBS-ben kapartuk le, pelletáltuk, majd 0,5%-os Triton X-100 / 0,5%-os nátrium-dezoxikolát/PBS lízispufferben homogenizáltuk, amely foszfatázt és proteázgátlót (Roche) tartalmazott. A fehérjemennyiségi meghatározást bicinkoninsav assay-vel (Thermo Fisher Scientific) végeztük. A fehérjéket ezután SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel választottuk szét, majd polivinilidén-fluorid membránra (GE Healthcare) blottoltuk. A nem specifikus helyeket blokkoltuk, és az elsődleges antitesttel (részletekért lásd az S1. táblázatot) inkubáltuk 5%-os tejben TBST-ben (Tris-pufferolt sóoldat Tween-nel), mosási lépésekkel és másodlagos antitesttel TBST-ben inkubáltuk. Inkubáltuk az elsődleges antitesttel egy éjszakán át +4°C-on. Mosás után a másodlagos antitestet 2 órán át szobahőmérsékleten vittük fel. Ezt követően, ugyanazon blot anti-β-aktin antitesttel történő inkubálásával megerősítettük ugyanazt a terhelést. A detektálás kemilumineszcenciává konvertálással és kemilumineszcencia fokozásával történt (GE Healthcare).
Az üveg fedőlemezekre előzőleg beoltott neuronokat 4%-os paraformaldehiddel (PFA)/PBS-sel fixáltuk a megadott időpontban, szobahőmérsékleten 10 percig. A fedőlemezeket először 0,1%-os Triton X-100/PBS-sel permeáltuk 5 percig szobahőmérsékleten, majd blokkoló pufferben [3% marhaszérum albumin (BSA)/PBS]. A második napon a fedőlemezeket blokkoló pufferrel mostuk, és a megfelelő fluoroforral konjugált szekunder antitesttel inkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten; végül a mintákat alaposan mostuk PBS-ben 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) jelenlétében, kontrasztfestéssel, majd Aqua-Poly/Mount festékkel fixáltuk a mikroszkóp tárgylemezére.
Hím és nőstény egereket intraperitoneálisan ketamin (130 mg/kg) és xilazin (10 mg/kg) injekcióval altattak, majd szubkután karprofen fájdalomcsillapítót (5 mg/kg) adtak be nekik. Ezután egy meleg párnával ellátott sztereotaktikus eszközbe (Kopf) helyezték. A koponyát szabaddá tették, és fogászati ​​fúróval elvékonyították a kisagykéreg azon részét, amely a mis csontnak felel meg (lambda-ból: 1,8-as farok, 1-es laterális, ami a IV. és V. lebenykéknek felel meg). Ívelt fecskendőtűvel óvatosan egy kis lyukat fúrtak a koponyába, hogy elkerüljék az alatta lévő érrendszer károsodását. Ezután a vékonyra húzott üvegkapillárist lassan behelyezték a mikrolyukba (-1,3-tól -1-ig a dura mater ventrális oldalán), és 200-300 nl AAV-t injektáltak a mikroinjektorba (Narishige) kézi fecskendőkkel (Narishige) többször alacsony nyomáson, 10-20 perces időablakban. Az infúzió után a kapillárist további 10 percre helyezzük a helyére, hogy a vírus teljesen szétterjedhessen. A kapillárisok kihúzása után a bőrt gondosan összevarrjuk, hogy minimalizáljuk a sebgyulladást és lehetővé tegyük az állat felépülését. Az állatokat a műtét után több napig fájdalomcsillapítókkal (kaszpofen) kezeltük, ez idő alatt fizikai állapotukat gondosan ellenőriztük, majd a megadott időpontban elaltattuk őket. Minden beavatkozást az európai, nemzeti és intézményi irányelveknek megfelelően végeztünk, és azokat a LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Észak-Rajna-Vesztfália, Németország hagyta jóvá.
Az állatokat ketaminnal (100 mg/kg) és xilazinnal (10 mg/kg) altatták, majd a szívet először 0,1 M PBS-sel, majd 4%-os PFA-val PBS-ben perfundálták. A szövetet boncolták, és 4%-os PFA/PBS-ben fixálták 4°C-on egy éjszakán át. A PBS-ben fixált agyból vibrációs kést (Leica Microsystems GmbH, Bécs, Ausztria) használtak sagittális metszetek (50 μm vastag) készítéséhez. Hacsak másképp nem jelezzük, a szabadon úszó metszetek festését a fent leírtak szerint (13) végezték szobahőmérsékleten, keverés mellett. Röviden, először a kapott szeleteket 0,5%-os Triton X-100/PBS-sel permeabilizálták 15 percig szobahőmérsékleten; egyes epitópok (Pcx és Shmt2) esetében 80°C-on tris-EDTA pufferben (pH 9) a szeleteket 25 percig melegítették e lépés helyett. Ezután a metszeteket primer antitesttel (lásd az S1. táblázatot) inkubáltuk blokkoló pufferben (3% BSA/PBS) 4°C-on, egy éjszakán át, keverés közben. Másnap a metszeteket blokkoló pufferrel mostuk, majd a megfelelő fluoroforral konjugált szekunder antitesttel inkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten; végül a metszeteket alaposan mostuk PBS-ben, DAPI-val kontrasztfestettük, majd AquaPolymount-tal fixáltuk egy tárgylemezen.
A minta képalkotásához egy fehér fényű lézerrel és egy 405-ös diódás ultraibolya lézerrel felszerelt lézeres pásztázó konfokális mikroszkópot (TCS SP8-X vagy TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) használtunk. A fluorofor gerjesztésével és a jel hibrid detektorral (HyDs) történő gyűjtésével LAS-X szoftvert használtunk a Nyquist-mintavételezésnek megfelelő, egymásra rakott képek szekvenciális módban történő gyűjtésére: nem kvantitatív panelek esetén nagyon dinamikus jeleket (például szomatikus sejtekben és dendritekben) használunk (mtYFP). A HyD segítségével detektáljuk a PN-ek számát BrightR módban. A háttér csökkentése érdekében 0,3-6 ns-os kapuzást alkalmazunk.
A szétválogatott sejtek valós idejű képalkotása. Az 1% B27-kiegészítőt és 0,5 mM GlutaMax-ot tartalmazó Neurobasal-A táptalajban történő válogatást követően a sejteket azonnal poli-L-lizinnel bevont üveg tárgylemezekre (μ-Slide8 Well, Ibidi, katalógusszám: 80826) helyeztük, majd 1 órán át 37°C-on és 5% CO2-atmoszférában tartottuk, hogy a sejtek leülepedhessenek. A valós idejű képalkotást egy Leica SP8 lézeres pásztázó konfokális mikroszkópon végeztük, amely fehér lézerrel, HyD-vel, 63×[1,4 numerikus apertúrájú (NA)] olajobjektívvel és fűtőállvánnyal volt felszerelve.
Az egeret gyorsan szén-dioxiddal altatták és lefejezték, az agyat gyorsan eltávolították a koponyáról, és 200 μm vastag (13C-jelölési kísérlethez) vagy 275 μm vastag (két fotonkísérlethez) szagittális metszetekre vágták, amelyeket a következő anyagokkal töltöttek fel. A fagylaltot (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Németország) a következő anyagokkal töltötték fel: 125 mM jéghideg, szénnel telített (95% O2 és 5% CO2), alacsony Ca2-tartalmú + mesterséges agy-gerincvelői folyadék (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nátrium-foszfát puffer, 25 mM NaHCO3, 25 mM glükóz, 0,5 mM CaCl2 és 3,5 mM MgCl2 (ozmotikus nyomás 310-330 mmol). A kapott agyszeleteket magasabb Ca2+ ACSF-et (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nátrium-foszfát puffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM D-glükóz, 1,0 mM CaCl2 és 2,0 mM MgCl2) tartalmazó előinkubációs kamrába helyezzük (pH 7,4 és 310-320 mmol).
A képalkotási folyamat során a szeleteket egy erre a célra kijelölt képalkotó szobába helyezték, és a kísérletet folyamatos ACSF perfúzió mellett, 32°C és 33°C közötti állandó hőmérsékleten végezték. A szeletképalkotáshoz egy Leica 25x objektívvel (NA 0,95, víz) és Ti:Zafír lézerrel (Chameleon Vision II, Coherent) felszerelt multifoton lézer pásztázó mikroszkópot (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) és FLIM modult (PicoHarp300, PicoQuant) használtak.
Grx1-roGFP2 FLIM vizsgálata. A PN-ek citoplazmatikus redox állapotában bekövetkező változásokat kétfotonos FLIM-mel mértük sagittális agyszeletekben, ahol a Grx1-roGFP2 bioszenzor a PN-eket célozta meg. A PN rétegben a képalkotó mezőt a szelet felszíne alatt körülbelül 50-80 μm-rel választottuk ki, hogy biztosítsuk az életképes PN jelenlétét (azaz a dendritek mentén látható neuronális morfológiai változások hiányát), valamint a dupla pozitív roGFP2 szenzort és az AAV-t kódoló shRNA PCx-et vagy annak kontroll szekvenciáját (mindegyik együtt expresszálja az mCherry-t). Egyszeres képminőségű képek gyűjtése 2x digitális zoommal [gerjesztési hullámhossz: 890 nm; 512 nm 512 pixel]. Detektálás: belső HyD, fluoreszcein-izotiocianát (FITC) szűrőcsoport], és 2-3 percen belüli képátlagolást alkalmaztunk annak biztosítására, hogy elegendő foton gyűljön össze (összesen 1000 foton) a görbeillesztéshez. A Grx1-roGFP2 próba érzékenységét és a FLIM feltételek ellenőrzését a roGFP2 élettartamának monitorozásával végeztük, amikor exogén 10 mM H2O2-t adtunk a perfúziós ACSF-hez (az oxidáció maximalizálása, ami megnövekedett élettartamot eredményezett), majd 2 mM ditiotreitolt adtunk hozzá (minimalizáltuk a redukció mértékét, ami az élettartam csökkenését eredményezte) (S8. ábra, D-G). A FLIMfit 5.1.1 szoftverrel elemeztük a kapott eredményeket, a teljes kép egyetlen exponenciális bomlási görbéjét illesztettük a mért IRF-hez (műszer válaszfüggvény), és a χ2 értéke körülbelül 1 volt. Egyetlen PN élettartamának kiszámításához manuálisan megrajzoltuk az idegtest körüli maszkot, és az egyes maszkokban az átlagos élettartamot használtuk a számszerűsítéshez.
Mitokondriális potenciálanalízis. Miután az akut metszetet 30 percig inkubáltuk a perfundált ACSF-hez közvetlenül adott 100 nM TMRM-mel, a PN-ek mitokondriális potenciálváltozásait kétfoton mikroszkóppal mértük. A TMRM képalkotást úgy végeztük, hogy a szondát 920 nm-en gerjesztettük, és belső HyD-t (tetrametil-rodamin-izotiocianát: 585/40 nm) használtunk a jelek gyűjtésére; ugyanazt a gerjesztési hullámhosszt, de egy másik belső HyD-t (FITC: 525/50) használtunk az mtYFP képalkotásához. Az ImageJ Image Calculator plug-injét használtuk a mitokondriális potenciál egysejtszintű értékeléséhez. Röviden, a plug-in egyenlete: signal = min (mtYFP, TMRM) használjuk a mitokondriális régió azonosítására, amely a TMRM jelet mutatja a Purkinje Szomáliaiban a megfelelő csatorna egyrétegű konfokális képén. Ezután a kapott maszk pixelterületét számszerűsítettük, majd normalizáltuk az mtYFP csatorna megfelelő küszöbértékű egyrétegű képén, hogy megkapjuk a mitokondriális potenciált mutató mitokondriális frakciót.
A képet Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) szoftverrel dekonvolutálták. A csempék szkennelt képei esetében egyetlen csempe montázsát a LAS-X szoftver által biztosított automatikus összeillesztési algoritmussal készítették el. A képkalibrálás után az ImageJ és az Adobe Photoshop programot használták a kép további feldolgozásához, valamint a fényerő és a kontraszt egyenletes beállításához. A grafikai előkészítéshez az Adobe Illustrator programot használták.
mtDNS fókuszanalízis. A mtDNS léziók számát DNS elleni antitestekkel jelölt kisagymetszeteken, konfokális mikroszkóppal számszerűsítettük. Minden célterületet létrehoztunk az egyes sejtek sejtmagjához és magjához, és a megfelelő területet a Multi Measure plug-in (ImageJ szoftver) segítségével számítottuk ki. A sejtmag területéből vonjuk ki a nukleáris területet, hogy megkapjuk a citoplazmatikus területet. Végül az Analyze Particles plug-int (ImageJ szoftver) használtuk a mtDNS-t jelző citoplazmatikus DNS-pontok automatikus számszerűsítésére a küszöbérték képen, és a kapott eredményeket a CTRL egerek PN-átlagához normalizáltuk. Az eredményeket a sejtenkénti átlagos nukleozidszámként fejeztük ki.
Fehérjeexpressziós analízis. Az ImageJ Image Calculator pluginjével értékelhető a fehérjeexpresszió a PN-ben egysejtszinten. Röviden, a megfelelő csatorna egyrétegű konfokális képén a jel = min (mtYFP, antitest) egyenlet segítségével azonosítható az a mitokondriális régió, amely immunreaktivitást mutat egy adott Purkina antitesttel szemben. Ezután a kapott maszk pixelterületét számszerűsítik, majd normalizálják az mtYFP csatorna megfelelő küszöbértékű egyrétegű képén, hogy megkapják a megjelenített fehérje mitokondriális frakcióját.
Purkinje-sejtek sűrűségének elemzése. Az ImageJ Cell Counter plug-injét használtuk a Purkinje-sűrűség értékeléséhez, a megszámlált Purkinje-sejtek számát elosztva a megszámlált sejtek által elfoglalt kisagygyűrű hosszával.
Mintaelőkészítés és -gyűjtés. A kontrollcsoport és az Mfn2cKO egerek agyát 2% PFA/2,5% glutaraldehid tartalmú 0,1 M foszfátpufferben (PB) fixáltuk, majd csillósokkal (Leica Mikrosysteme GmbH, Bécs, Ausztria) koronális metszeteket készítettünk róluk (vastagság 50-60 μm). Ezután 1% os-tetraoxidot és 1,5% kálium-ferrocianidot tartalmazó PB pufferben fixáltuk szobahőmérsékleten 1 órán át. A metszeteket háromszor mostuk desztillált vízzel, majd 1% uranil-acetátot tartalmazó 70%-os etanollal festettük 20 percig. A metszeteket ezután gradiens alkoholban dehidratáltuk, és Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxi gyantába (Electron Microscopy Sciences, katalógusszám 14040) ágyaztuk szilikonbevonatú üveglemezek közé, végül 60°C-on polimerizáltuk sütőben 48 órán át. A kisagykéreg területét kiválasztottuk, és Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Bécs, Ausztria) mikroszkóppal 50 nm vastagságú ultravékony metszeteket készítettünk, majd polisztirol fóliával bevont 2×1 mm-es réz résrácsra helyeztük. A metszeteket 4%-os uranil-acetát vizes oldatával 10 percig festettük, majd többször mostuk vízzel, végül 10 percig Reynolds-ólom-citrát vizes oldatával, végül pedig többször mostuk vízzel. A mikroszkópos felvételeket Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) transzmissziós elektronmikroszkóppal készítettük TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digitális kamera (TVIPS GmbH, Gauting, USA, Németország) felhasználásával.
Az AAV-val fertőzött egerek esetében az agyat elválasztották és 1 mm vastag szagittális metszetekre vágták, majd a kisagyat fluoreszcens mikroszkóppal vizsgálták az AAV-fertőzött gyűrű (azaz az mCherry-t expresszáló) azonosítására. Csak azokat a kísérleteket használták, amelyekben az AAV injekciója a Purkinje-sejtréteg (azaz szinte a teljes réteg) nagyon magas transzdukciós hatékonyságát eredményezte legalább két egymást követő kisagygyűrűben. Az AAV-transzdukált hurkot egy éjszakán át mikrodisszekcióval fixálták (4% PFA és 2,5% glutaraldehid 0,1 M kokoát pufferben), majd tovább feldolgozták. EPON beágyazáshoz a fixált szövetet 0,1 M nátrium-kokoát pufferrel (Applichem) mosták, majd 2% OsO4-gyel (os, Science Services; Caco) inkubálták 0,1 M nátrium-kokoát pufferben (Applichem) 4 órán át, majd 2 órán át mosták. Ismételték meg háromszor 0,1 M kokamid pufferrel. Ezt követően az etanolos oldatokat felszálló sorozatban 4°C-on inkubáltuk 15 percig a szövet dehidratálása érdekében. A szövetet propilén-oxidba helyeztük, és egy éjszakán át EPON-ban (Sigma-Aldrich) inkubáltuk 4°C-on. A szövetet friss EPON-ba helyeztük szobahőmérsékleten 2 órán át, majd 62°C-on 72 órán át ágyaztuk be. Ultramikrotómmal (Leica Microsystems, UC6) és gyémántkéssel (Diatome, Biel, Svájc) 70 nm-es ultravékony metszeteket vágtunk, majd 1,5%-os uranil-acetáttal festettük 15 percig 37°C-on, és ólom-citrát oldattal festettük 4 percig. Az elektronmikroszkópos felvételeket JEM-2100 Plus transzmissziós elektronmikroszkóppal (JEOL) készítettük, amely Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) és DigitalMicrograph szoftverrel (Gatan) volt felszerelve. Az elemzéshez az elektronmikroszkópos felvételeket 5000× vagy 10 000× digitális zoommal készítettük.
A mitokondriumok morfológiai elemzése. Minden elemzéshez az egyes mitokondriumok kontúrjait manuálisan rajzoltuk ki digitális képeken az ImageJ szoftver segítségével. Különböző morfológiai paramétereket elemeztünk. A mitokondriumok sűrűségét százalékban fejeztük ki, amelyet úgy kaptunk meg, hogy az egyes sejtek teljes mitokondriális területét elosztottuk a citoplazma területével (citoplazma terület = sejtterület - sejtmag területe) × 100. A mitokondriumok kerekdedségét a [4π∙(terület/kerület 2)] képlettel számítottuk ki. A mitokondriumok morfológiáját elemeztük, és fő alakjuk szerint két kategóriába („csőszerű” és „hólyagszerű”) osztottuk.
Autofagoszóma/lizoszóma szám- és sűrűségelemzés. Az ImageJ szoftver segítségével manuálisan körvonalazzuk az egyes autofagoszómák/lizoszómák kontúrjait a digitális képen. Az autofagoszóma/lizoszóma területét százalékban fejezzük ki, amelyet úgy számítunk ki, hogy az egyes sejtek teljes autofagoszóma/lizoszóma szerkezeti területét elosztjuk a citoplazma területével (citoplazma terület = sejtterület - sejtmag terület) × 100. Az autofagoszómák/lizoszómák sűrűségét úgy számítjuk ki, hogy a teljes számot elosztjuk az autofagoszóma/lizoszóma struktúrák sejtenkénti számával (citoplazmatikus területre vonatkoztatva) (citoplazmatikus terület = sejtterület - sejtmag terület).
Jelölés akut metszetekhez és minta-előkészítéshez. Glükózjelölést igénylő kísérletekhez az akut agyszeleteket egy előinkubációs kamrába kell helyezni, amely telített szenet (95% O2 és 5% CO2), magas Ca2 + tartalmú ACSF-et (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nátrium-foszfát puffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glükóz, 1,0 mM CaCl2 és 2,0 mM MgCl2, pH 7,4-re beállítva és 310-320 mOsm-ra beállítva) tartalmaz, amelyben a glükóz 13C6- glükózszubsztitúciót végez (Eurisotop, katalógusszám: CLM-1396). Piruvát jelölést igénylő kísérletekhez az akut agyszeleteket magasabb Ca2 + ACSF-be (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nátrium-foszfát puffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glükóz, 1,0 mM CaCl2) kell átvinni, majd 2,0 mM MgCl2-t kell hozzáadni, a pH-t 7,4-re és 310-320 mOsm-ra beállítani, végül 1 mM 1-[1-13C]piruvátot (Eurisotop, katalógusszám: CLM-1082) kell hozzáadni. A metszeteket 90 percig 37°C-on kell inkubálni. A kísérlet végén a metszeteket gyorsan lemosni 75 mM ammónium-karbonátot tartalmazó vizes oldattal (pH 7,4), majd 40:40:20 (v:v:v) acetonitril (ACN):metanol:víz elegyben homogenizálni. Miután a metszeteket 30 percig jégen inkubáltuk, a mintákat 21 000 g-vel 10 percig 4°C-on centrifugáltuk, majd a tiszta felülúszót SpeedVac koncentrátorban szárítottuk. A kapott szárított metabolitpelletet -80°C-on tároltuk az elemzésig.
13C-vel jelölt aminosavak folyadékkromatográfiás-tömegspektrometriás analízise. A folyadékkromatográfiás-tömegspektrometriás (LC-MS) analízishez a metabolitpelletet 75 μl LC-MS minőségű vízben (Honeywell) reszuszpendáltuk. 21 000 g-vel 5 percig 4°C-on centrifugáltuk, majd a tisztított felülúszó 20 μl-ét aminosav-fluxus analízishez, míg a kivonat többi részét azonnal anion analízishez használtuk (lásd alább). Az aminosav-analízist a korábban leírt benzoil-klorid derivatizációs protokollal (55, 56) végeztük. Az első lépésben 10 μl 100 mM nátrium-karbonátot (Sigma-Aldrich) adtunk 20 μl metabolit-kivonathoz, majd 10 μl 2%-os benzoil-kloridot (Sigma-Aldrich) adtunk az LC minőségű ACN-hez. A mintát röviden vortexeltük, majd 21 000 g-vel 5 percig 20°C-on centrifugáltuk. A tisztított felülúszót vigyük át egy 2 ml-es, kúpos üvegbetéttel ellátott autosampler fiolába (200 μl térfogat). A mintákat Acquity iClass ultra-nagy teljesítményű LC rendszerrel (Waters) elemeztük, amely egy Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) nagy felbontású precíziós tömegspektrométerhez (Thermo Fisher Scientific) csatlakoztatódott. Az elemzéshez a derivatizált mintából 2 μl-t injektáltunk egy 100×1,0 mm-es nagy szilárdságú szilícium-dioxid T3 oszlopba (Waters), amely 1,8 μm-es részecskéket tartalmazott. Az áramlási sebesség 100 μl/perc, a pufferrendszer pedig A pufferből (10 mM ammónium-formiát és 0,15% hangyasav vízben) és B pufferből (ACN) áll. A gradiens a következő: 0%B 0 percnél; 0%B. 0-15% B 0-0,1 percnél; 15-17% B 0,1-0,5 percnél; B 17–55%-on 0,5–14 percnél; B 55–70%-on 14–14,5 percnél; 14,5–70–100%-on B 18 percnél; 100% B 18–19 percnél; 100–0% B 19–19,1 percnél; 0% B 19,1–28 percnél (55, 56). A QE-HF tömegspektrométer pozitív ionizációs módban működik, 50–750 m/z (tömeg/töltés arány) tömegtartománnyal. Az alkalmazott felbontás 60 000, az erősítésszabályozással (AGC) kapott ioncélpont 3×106, a maximális ionidő pedig 100 milliszekundum. A fűtött elektrospray ionizációs (ESI) forrás 3,5 kV permetezési feszültséggel, 250 °C kapilláris hőmérsékleten, 60 AU (tetszőleges egységek) köpeny légáramlással és 20 AU segéd légáramlással működik. 250 °C. Az S lencse 60 AU-ra van beállítva.
13C-vel jelölt szerves savak anionkromatográfiás-MS analízise. A maradék metabolit csapadékot (55 μl) Dionex ionkromatográfiás rendszerrel (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) elemeztük, amely egy QE-HF tömegspektrométerhez (Thermo Fisher Scientific) volt csatlakoztatva. Röviden, 5 μl metabolit-kivonatot injektáltunk egy Dionex IonPac AS11-HC oszlopba, amely HPLC-vel (2 mm × 250 mm, részecskeméret 4 μm, Thermo Fisher Scientific) volt felszerelve push-in részleges hurok módban, 1-es töltési arányban. Dionex IonPac AG11-HC előoszlop (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific) volt. Az oszlop hőmérsékletét 30 °C-on tartottuk, az automata mintavevőt pedig 6 °C-ra állítottuk be. Ioncserélt vízzel ellátott kálium-hidroxid patront használtunk kálium-hidroxid gradiens előállításához az eluensgenerátoron keresztül. A metabolitok elválasztása 380 μl/perc áramlási sebességgel, a következő gradienst alkalmazva: 0-3 perc, 10 mM KOH; 3-12 perc, 10-50 mM KOH; 12-19 perc, 50-100 mM KOH; 19-21 perc, 100 mM KOH; 21-21,5 perc, 100-10 mM KOH. Az oszlopot 10 mM KOH alatt 8,5 percig újra ekvilibráltuk.
Az eluált metabolitokat az oszlop után 150 μl/perc izopropanol kiegészítő árammal egyesítik, majd egy negatív ionizációs módban működő nagy felbontású tömegspektrométerbe vezetik. Az MS a tömegtartományt m/z 50-től 750-ig figyeli 60 000-es felbontással. Az AGC értéke 1×106, a maximális ionidő pedig 100 ms. A fűtött ESI forrást 3,5 kV permetezési feszültséggel működtették. Az ionforrás egyéb beállításai a következők: kapilláris hőmérséklet 275 °C; védőgáz áramlása, 60 AU; segédgáz áramlása, 20 AU 300 °C-on, és S lencse beállítása 60 AU.
13C-vel jelölt metabolitok adatelemzése. Az izotóparány adatelemzéséhez a TraceFinder szoftvert (4.2-es verzió, Thermo Fisher Scientific) használtuk. Minden vegyület azonosságát megbízható referenciavegyülettel igazoltuk, és függetlenül elemeztük. Az izotópdúsítási analízis elvégzéséhez az egyes 13C izotópok (Mn) extrahált ionkromatogramjának (XIC) területét az [M + H]+-ból, ahol n a célvegyület szénatomszáma, az aminosavak elemzéséhez, vagy az [MH]+-ból az anionok elemzéséhez használtuk. Az XIC tömegpontossága kevesebb, mint öt ppm, az RT pontossága pedig 0,05 perc. A dúsítási analízist úgy végezzük, hogy kiszámítjuk az egyes detektált izotópok és a megfelelő vegyület összes izotópjának összegéhez viszonyított arányát. Ezeket az arányokat százalékos értékként adjuk meg minden egyes izotópra, és az eredményeket moláris százalékos dúsításban (MPE) fejezzük ki, a korábban leírtak szerint (42).
A lefagyasztott neuronpelletet jéghideg 80% metanolban (v/v) homogenizáltuk, vortexeltük, majd -20°C-on 30 percig inkubáltuk. A mintát ismét vortexeltük, majd +4°C-on 30 percig kevertettük. A mintát 21 000 g-vel centrifugáltuk 5 percig 4°C-on, majd a kapott felülúszót összegyűjtöttük és SpeedVac koncentrátorral 25°C-on szárítottuk a későbbi elemzéshez. A fent leírtak szerint LC-MS analízist végeztünk a szétválogatott sejtek aminosavain. A TraceFinder (4.2-es verzió, Thermo Fisher Scientific) segítségével az adatelemzést az egyes vegyületek monoizotópos tömegének felhasználásával végeztük. A metabolitadatok kvantilis normalizálását a preprocessCore szoftvercsomaggal (57) végeztük.
Szeletkészítés. Az egeret gyorsan szén-dioxiddal altattuk és dekapitáltuk, az agyat gyorsan eltávolítottuk a koponyáról, és jéggel töltött vibrációs késsel (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Németország) 300-375 μm-es szagittális metszeteket készítettünk belőle. Hideg széngázosítás (95% O2 és 5% CO2) Alacsony Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nátrium-foszfát puffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glükóz, 1,0 mM CaCl2 és 6,0 mM MgCl2). pH 7,4-re és 310-330 mOsm-ra állítottuk be. A kapott agyszeleteket magasabb Ca2 + ACSF-et (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nátrium-foszfát puffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glükóz, 4,0 mM CaCl2 és mM 3,5 MgCl2) tartalmazó kamrába helyezzük, pH 7,4 és 310-320 mOsm. A szeleteket 20-30 percig tároljuk, hogy a felvétel előtt helyreállíthatók legyenek.
felvétel. Minden felvételhez egy fix rögzítőkamrával és 20x-os nagyítású vízimmerziós objektívvel (Scientifica) felszerelt mikroszkóp tárgyasztalt használtunk. A feltételezett Purkinje-sejteket (i) testméret, (ii) a kisagy anatómiai elhelyezkedése és (iii) a fluoreszcens mtYFP riportergén expressziója alapján azonosítottuk. Az 5-11 megaohm hegyellenállású tapaszpipetta hegyét egy boroszilikát üvegkapilláris (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Németország) és egy vízszintes pipettás Instruments (P-1000, Sutter), Novato, Kalifornia) húztuk ki. Minden felvételt ELC-03XS npi patch clamp erősítővel (npi electronic GmbH, Tam, Németország) végeztünk, amelyet a Signal szoftver (6.0 verzió, Cambridge Electronic, Cambridge, Egyesült Királyság) vezérelt. A kísérletet 12,5 kHz mintavételi frekvencián rögzítettük. A jelet két rövid áteresztő Bessel-szűrővel szűrjük, amelyek határfrekvenciája 1,3, illetve 10 kHz. A membrán és a pipetta kapacitását a kompenzációs áramkör kompenzálja az erősítő segítségével. Minden kísérletet egy Orca-Flash 4.0 kamera (Hamamatsu, Gerden, Németország) vezérlésével végeztünk, amelyet a Hokawo szoftver (2.8-as verzió, Hamamatsu, Gerden, Németország) vezérelt.
Rutin teljes sejtes konfiguráció és elemzés. Közvetlenül a rögzítés előtt töltse fel a pipettát a következő anyagokat tartalmazó belső oldattal: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kálium-glükonát, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg₂), 0,5 mM guanozin-trifoszfát (GTP) (Na₂) és 10,0 mM kreatinin-foszfát, pH-ját 7,25-re állította be, az ozmotikus nyomást pedig 290 mOsm (szacharóz) volt. Közvetlenül a membrán repesztésére 0 pA erő alkalmazásával megmérte a nyugalmi membránpotenciált. A bemeneti ellenállást -40, -30, -20 és -10 pA hiperpolarizált áramok alkalmazásával mérte. Mérje meg a feszültségválasz nagyságát, és Ohm törvénye alapján számítsa ki a bemeneti ellenállást. A spontán aktivitást 5 percig feszültséglakattintóval rögzítettük, az sPSC-t pedig az Igor Pro (32 7.01 verzió, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) programban azonosítottuk és mértük egy félautomata felismerő szkript segítségével. Az IV görbét és az állandósult áramot úgy mértük, hogy az akkumulátort különböző potenciálokon (-110 mV-ról kezdve) fogtuk, és a feszültséget 5 mV-os lépésekben növeltük. Az AP termelését depolarizáló áram alkalmazásával teszteltük. A cellát -70 mV-on fogtuk, miközben depolarizáló áramimpulzust alkalmaztunk. Az egyes rögzítőegységek lépésméretét külön-külön állítottuk be (10-60 pA). A maximális AP frekvenciát a legmagasabb AP frekvenciát okozó impulzuscsúcsok manuális megszámlálásával számítottuk ki. Az AP küszöbértéket az egy vagy több AP-t először kiváltó depolarizációs impulzus második deriváltjának felhasználásával elemeztük.
Perforált patch konfiguráció és elemzés. Végezzen perforált patch felvételt standard protokollok szerint. Használjon ATP- és GTP-mentes pipettát, amely nem tartalmazza a következő összetevőket: 128 mM glükonát K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA és 2 mM MgCl2, és állítsa be a pH-t 7,2-re (KOH segítségével). Az ATP-t és a GTP-t elhagyják az intracelluláris oldatból, hogy megakadályozzák a sejtmembrán ellenőrizetlen permeabilitását. A patch pipettát amfotericint tartalmazó belső oldattal (körülbelül 200-250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) töltik fel, hogy lyukasztott patch felvételt kapjanak. Az amfotericint dimetil-szulfoxidban oldották (végső koncentráció: 0,1-0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). A használt DMSO koncentrációjának nem volt szignifikáns hatása a vizsgált neuronokra. A lyukasztási folyamat során a csatornarezisztenciát (Ra) folyamatosan monitorozták, és a kísérletet a Ra és az AP amplitúdójának stabilizálódása után (20-40 perc) indították el. A spontán aktivitást feszültség- és/vagy áramfogóval mérik 2-5 percig. Az adatelemzést Igor Pro (7.05.2 verzió, WaveMetrics, USA), Excel (2010 verzió, Microsoft Corporation, Redmond, USA) és GraphPad Prism (8.1.2 verzió, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) szoftverekkel végezték. A spontán AP-k azonosításához az IgorPro NeuroMatic v3.0c beépülő modulját használják. Az AP-k automatikus azonosítása egy adott küszöbérték alapján történik, amelyet minden rekordhoz külön-külön állítanak be. A tüskeintervallum felhasználásával határozza meg a tüskefrekvenciát a maximális pillanatnyi tüskefrekvenciával és az átlagos tüskefrekvenciával.
PN izolálás. A korábban publikált protokollhoz igazodva, a PN-eket egér kisagyból tisztították egy meghatározott szakaszban (58). Röviden, a kisagyat boncolták és jéghideg disszociációs táptalajban [HBSS Ca2+ és Mg2+ nélkül, 20 mM glükózzal, penicillinnel (50 U/ml) és sztreptomicinnel (0,05 mg/ml) kiegészítve] felaprították, majd a táptalajt papainnal [HBSS, 1-cisztein·HCl (1 mg/ml), papainnal (16 U/ml) és dezoxiribonukleáz I-gyel (DNáz I; 0,1 mg/ml) kiegészítve] emésztették. 30 percig 30°C-on kezelték. Először mossuk a szöveteket HBSS táptalajban, amely tojásnyálkát (10 mg/ml), BSA-t (10 mg/ml) és DNázt (0,1 mg/ml) tartalmaz szobahőmérsékleten az enzimes emésztés megakadályozása érdekében, majd 20 mM glükózt tartalmazó HBSS táptalajban mossuk. A HBSS-ben, penicillinben (50 U/ml), sztreptomicinben (0,05 mg/ml) és DNázban (0,1 mg/ml) óvatosan őrölve szabadítsuk fel az egyes sejteket. A kapott sejtszuszpenziót 70 μm-es sejtszűrőn szűrjük, majd a sejteket centrifugálással (1110 rpm, 5 perc, 4°C) ülepítjük, és válogató táptalajban [HBSS, 20 mM glükózzal, 20% magzati szarvasmarha-szérummal, penicillinnel (50 U/ml) és sztreptomicinnel (0,05 mg/ml) kiegészítve] reszuszpendáljuk; a sejtek életképességét propidium-jodiddal értékeljük, és a sejtsűrűséget 1×106 - 2×106 sejt/ml értékre állítjuk be. Az áramlási citometria előtt a szuszpenziót 50 μm-es sejtszűrőn szűrtük.
Áramlási citométer. A sejtszortírozást 4°C-on végeztük FACSAria III géppel (BD Biosciences) és FACSDiva szoftverrel (BD Biosciences, 8.0.1 verzió). A sejtszuszpenziót 100 μm-es fúvókával szortíroztuk 20 psi nyomáson, ~2800 esemény/másodperc sebességgel. Mivel a hagyományos kapuzási kritériumok (sejtméret, bimodális megkülönböztetés és szórási jellemzők) nem tudják biztosítani a PN megfelelő izolálását más sejttípusoktól, a kapuzási stratégiát a mitoYFP+ ​​​​és a kontroll mitoYFP− egerek YFP intenzitásának és autofluoreszcenciájának közvetlen összehasonlítása alapján határoztuk meg. Az YFP-t a minta 488 nm-es lézervonallal történő besugárzásával gerjesztjük, és a jelet 530/30 nm-es sávszűrővel detektáljuk. MitoYFP+ ​​​​egerekben a Rosa26-mitoYFP riportergén relatív erősségét is felhasználjuk a neuronális test és az axonfragmensek megkülönböztetésére. A 7-AAD-t 561 nm-es sárga lézerrel gerjesztik, és 675/20 nm-es sávszűrővel detektálják az elhalt sejtek kizárása érdekében. Az asztrociták egyidejű elválasztása érdekében a sejtszuszpenziót ACSA-2-APC-vel festették, majd a mintát 640 nm-es lézervonallal besugározták, és a jel detektálásához 660/20 nm-es sávszűrőt használtak.
Az összegyűjtött sejteket centrifugálással ülepítettük (1110 rpm, 5 perc, 4°C), és felhasználásig -80°C-on tároltuk. Az Mfn2cKO egereket és alomkölykeiket ugyanazon a napon osztályoztuk, hogy minimalizáljuk az eljárásbeli variabilitást. A FACS adatok bemutatását és elemzését FlowJo szoftverrel (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) végeztük.
Amint azt fentebb említettük (59), valós idejű PCR-t alkalmaznak a DNS izolálására a szétválogatott neuronokból a későbbi mtDNS-kvantifikációhoz. A linearitást és a küszöbérzékenységet kezdetben qPCR futtatásával tesztelték különböző sejtszámokon. Röviden, 300 PN-t gyűjtsenek lízispufferbe, amely 50 mM tris-HCl-t (pH 8,5), 1 mM EDTA-t, 0,5% Tween 20-at és proteináz K-t (200 ng/ml) tartalmaz, és inkubálják 55°C-on 120 percig. A sejteket tovább inkubálják 95°C-on 10 percig, hogy biztosítsák a proteináz K teljes inaktiválását. Az mt-Nd1-re specifikus TaqMan próbával (Thermo Fisher) a mtDNS-t fél-kvantitatív PCR-rel mérik a 7900HT Real-Time PCR rendszerben (Thermo Fisher Scientific). Science, katalógusszám: Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, katalógusszám: AIVI3E8) és 18S (Thermo Fisher Scientific, katalógusszám: Hs99999901_s1) gének.
Proteóma minta előkészítése. Az oldat 95°C-on 10 percig tartó melegítésével és ultrahanggal történő kezelésével, lízispufferben [6 M guanidin-klorid, 10 mM trisz(2-karboxietil)-foszfin-hidroklorid, 10 mM klóracetamid és 100 mM trisz-Lízis fagyasztott neuronpelleteket HCl-ben]. Bioruptoron (Diagenode) 10 percig (30 másodperces impulzus / 30 másodperces szünet). A mintát 1:10 arányban hígítottuk 20 mM trisz-HCl-ben (pH 8,0), 300 ng tripszin arannyal (Promega) kevertük, és egy éjszakán át 37°C-on inkubáltuk a teljes emésztés elérése érdekében. A második napon a mintát 20 000 g-vel 20 percig centrifugáltuk. A felülúszót 0,1%-os hangyasavval hígítottuk, és az oldatot saját készítésű StageTips-szel sótalanítottuk. A mintát SpeedVac készülékben (Eppendorf koncentrátor plusz 5305) 45°C-on szárítottuk, majd a peptidet 0,1%-os hangyasavban szuszpendáltuk. Minden mintát ugyanaz a személy készített elő egyidejűleg. Az asztrocita minták elemzéséhez 4 μg sótalanított peptidet jelöltünk tandem tömegcímkével (TMT10plex, katalógusszám: 90110, Thermo Fisher Scientific) 1:20 peptid-TMT reagens arányban. A TMT jelöléshez 0,8 mg TMT reagenst 70 μl vízmentes ACN-ben szuszpendáltunk, és a szárított peptidet 9 μl 0,1 M TEAB-ban (trietilammónium-hidrogén-karbonát) oldottuk fel, amelyhez 7 μl TMT reagenst adtunk ACN-ben. A koncentráció 43,75% volt. 60 perc inkubálás után a reakciót 2 μl 5%-os hidroxil-aminnal leállítottuk. A jelölt peptideket összegyűjtöttük, szárítottuk, 200 μl 0,1%-os hangyasavban (FA) reszuszpendáltuk, kettéosztottuk, majd saját készítésű StageTips segítségével sómentesítettük. UltiMate 3000 ultra nagy teljesítményű folyadékkromatográf (UltiMate 3000 ultra nagy teljesítményű folyadékkromatográf) segítségével a két fél egyikét 1 mm x 150 mm-es Acquity kromatográfiás oszlopon frakcionáltuk, amely 130Å1,7μm C18 részecskékkel volt feltöltve (Waters, katalógusszám: 186006935). Thermo Fisher Scientific). A peptideket 30 μl/perc áramlási sebességgel választottuk szét, 1%-ról 50%-ra, B pufferrel 85 percig, 96 perces lépésenkénti gradienssel elválasztva, 50%-ról 95%-ra, B pufferrel 3 percig, majd 8 percig 95%-os B pufferrel; Az A puffer 5% ACN és 10 mM ammónium-hidrogén-karbonát (ABC), a B puffer pedig 80% ACN és 10 mM ABC. 3 percenként gyűjtsük össze a frakciókat, és vonjuk össze két csoportra (1 + 17, 2 + 18 stb.), majd vákuumcentrifugában szárítsuk meg.
LC-MS/MS analízis. Tömegspektrometriához a peptideket (r119.aq szám) egy 25 cm-es, 75 μm belső átmérőjű PicoFrit analitikai oszlopon (új objektívlencse, cikkszám PF7508250) választottuk el, amely 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ közeggel (Dr. Maisch, mat) volt felszerelve, EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Németország) típusú oszlopon. Az oszlopot 50°C-on tartottuk. Az A és B pufferek 0,1%-os hangyasav vízben, illetve 0,1%-os hangyasav 80%-os ACN-ben. A peptideket 6%-ról 31%-ra terjedő B pufferről 65 percig, illetve 31%-ról 50%-ra terjedő B pufferről 5 percig választottuk el, 200 nl/perc gradienssel. Az eluált peptideket Orbitrap Fusion tömegspektrométeren (Thermo Fisher Scientific) analizáltuk. A peptidprekurzor m/z mérését 120 000 felbontással végezzük 350 és 1500 m/z közötti tartományban. 27%-os normalizált ütközési energia felhasználásával a 2-6 töltésállapotú legerősebb prekurzort választjuk ki a nagy energiájú C-csapda disszociációs (HCD) hasításhoz. A ciklusidőt 1 másodpercre állítjuk be. A peptidfragmentum m/z értékét az ioncsapdában mérjük a legkisebb, 5×104-es AGC célpont és 86 ms-os maximális injektálási idő alkalmazásával. A fragmentáció után a prekurzort 45 másodpercre dinamikus kizárási listára helyezzük. A TMT-vel jelölt peptideket 50 cm-es, 75 μm-es Acclaim PepMap oszlopon (Thermo Fisher Scientific, katalógusszám: 164942) választottuk szét, és a migrációs spektrumokat Orbitrap Lumos Tribrid tömegspektrométeren (Thermo Fisher Scientific) elemeztük, amely nagy térerősségű aszimmetrikus hullámformájú ionokkal (FAIMS) volt felszerelve (Thermo Fisher Scientific), és két kompenzációs feszültségen, -50 és -70 V-on működik. A szinkronizációs prekurzor alapján kiválasztott MS3-at használtuk a TMT jelentési ionjelének méréséhez. A peptidszétválasztást EASY-nLC 1200 készüléken végeztük, 90%-os lineáris gradiens elúcióval, 6% és 31% közötti pufferkoncentrációval; az A puffer 0,1% FA, a B puffer pedig 0,1% FA és 80% ACN volt. Az analitikai oszlopot 50°C-on üzemeltettük. A FreeStyle (1.6-os verzió, Thermo Fisher Scientific) szoftverrel osztottuk fel az eredeti fájlt a FAIMS kompenzációs feszültség szerint.
Fehérjeazonosítás és mennyiségi meghatározás. Az integrált Andromeda keresőmotor segítségével az eredeti adatokat a MaxQuant 1.5.2.8 verziójával elemeztük (https://maxquant.org/). Az Aequorea victoriából származó Cre rekombináz és YFP szekvenciák mellett peptidfragmens spektrumokat kerestünk az egér referencia proteom kanonikus szekvenciájára és izoforma szekvenciájára (Proteome ID UP000000589, letöltve az UniProt-ról 2017 májusában). A metionin oxidációját és a fehérje N-terminális acetilezését változó módosításként, a cisztein-karbamoil metilációját pedig fix módosításként állítottuk be. Az emésztési paraméterek „specificitás” és „tripszin/P” értékre voltak beállítva. A fehérjeazonosításhoz használt peptidek és borotvapeptidek minimális száma 1; az egyedi peptidek minimális száma 0. A peptidtérkép-illesztés feltételei között a fehérjeazonosítási arány 0,01 volt. A „Második peptid” opció engedélyezve van. Használja a „futtatások közötti egyezés” opciót a sikeres azonosítások különböző eredeti fájlok közötti átviteléhez. A jelölésmentes kvantifikációhoz (LFQ) az LFQ minimum arány 1-es számlálóját használja (60). Az LFQ intenzitását minden időpontban legalább két érvényes értékre szűri legalább egy genotípuscsoportban, és egy 0,3 szélességű normális eloszlásból extrapolálja, amely 1,8-cal lefelé halad. Az LFQ eredmények elemzéséhez a Perseus számítási platformot (https://maxquant.net/perseus/) és az R-t (https://r-project.org/) használja. A differenciális expressziós analízishez a limma szoftvercsomag kétutas mérsékelt t-próbáját használta (61). A feltáró adatelemzést ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally és pheatmap segítségével végezte. A TMT-alapú proteomikai adatokat a MaxQuant 1.6.10.43 verziójával elemezte. Nyers proteomikai adatokat kereshet az UniProt humán proteomikai adatbázisában, amelyet 2018 szeptemberében töltöttek le. Az elemzés tartalmazza a gyártó által megadott izotóp tisztasági korrekciós tényezőt. Használja a limma függvényt az R-ben a differenciális expressziós analízishez. Az eredeti adatokat, az adatbázis-keresési eredményeket, valamint az adatelemzési munkafolyamatot és eredményeket mind a ProteomeXchange alliance tárolja a PRIDE partner adattárán keresztül, a PXD019690 adatkészlet-azonosítóval.
A funkcionális annotációk gazdagítják az elemzést. Az Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) eszközt használtuk a 8 hetes adathalmaz funkcionális annotációs tagjainak gazdagságának meghatározására (1. ábra). Röviden, az LC-MS/MS (tandem tömegspektrometria) adatelemzéssel kapott kvantitatív fehérjelistát a következő szűrőkritériumokkal használtuk: Fajként és háttérként a Mus musculus került kiválasztásra, a kategória pedig azt mutatja, hogy a Benjamini által korrigált P-értéket a 0,05-ös vagy annál alacsonyabb dúsítás tekintendő szignifikánsnak. Ezen a grafikonon az egyes klaszterekben a korrigált P-érték alapján az első öt többletkategóriát mutatjuk be. Többszörös t-próbával, Benjamini, Krieger és Yekutieli kétlépcsős lineáris boost programjával (Q = 5%), időbeli fehérjeexpressziós analízist végeztünk az egyes kategóriákban azonosított fontos jelölteken, és minden sort külön elemeztünk. Nincs szükség következetes standard eltérés elfogadására.
Annak érdekében, hogy a tanulmány eredményeit összehasonlíthassuk a publikált adatbázisokkal, és elkészíthessük az 1. ábrán látható Venn-diagramot, a kvantitatív fehérjelistát a MitoCarta 2.0 annotációival (24) kombináltuk. A diagram elkészítéséhez a Draw Venn Diagram online eszközt (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) használtuk.
A proteomikai elemzéshez használt statisztikai eljárások részletes információiért lásd az Anyagok és módszerek megfelelő szakaszát. Minden más kísérlet esetében a részletes információk a megfelelő jelmagyarázatban találhatók. Hacsak másképp nem jelezzük, minden adat átlag ± SEM formában van kifejezve, és minden statisztikai elemzést a GraphPad Prism 8.1.2 szoftverrel végeztünk.
A cikkhez tartozó kiegészítő anyagokért kérjük, látogassa meg a http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 weboldalt.
Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, amely a Creative Commons Nevezd meg! – Ne add el! Licenc feltételei szerint kerül terjesztésre, amely lehetővé teszi a felhasználást, terjesztést és sokszorosítást bármilyen médiumban, feltéve, hogy a végső felhasználás nem kereskedelmi célú, és a feltétel az, hogy az eredeti mű helyes. Hivatkozás.
Megjegyzés: Csak azért kérjük az e-mail címed megadását, hogy az oldalra ajánlott személy tudja, hogy szeretnéd, ha látná az e-mailt, és hogy az nem spam. Nem fogunk rögzíteni semmilyen e-mail címet.
Ez a kérdés arra szolgál, hogy teszteljük, látogató-e, és megakadályozzuk az automatikus spamküldést.
Szerző: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
A diszfunkcionális neuronok proteomikai elemzése kimutatta, hogy az anyagcsere-programok aktiválódnak a neurodegeneráció ellensúlyozására.
Szerző: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
A diszfunkcionális neuronok proteomikai elemzése kimutatta, hogy az anyagcsere-programok aktiválódnak a neurodegeneráció ellensúlyozására.
©2020 American Association for the Advanced of Science. minden jog fenntartva. Az AAAS a HINARI, az AGORA, az OARE, a CHORUS, a CLOCKSS, a CrossRef és a COUNTER partnere. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.