A cikk a „Fejlett bioremediációs technológiák és szintetikus szerves vegyületek (SOC) újrahasznosítási folyamatai” kutatási téma része. Tekintse meg mind a 14 cikket.
Az alacsony molekulatömegű policiklusos aromás szénhidrogének (PAH-ok), mint például a naftalin és a szubsztituált naftalinok (metilnaftalin, naftoesav, 1-naftil-N-metilkarbamát stb.), széles körben használatosak a különböző iparágakban, és genotoxikusak, mutagének és/vagy rákkeltőek a szervezetekre. Ezeket a szintetikus szerves vegyületeket (SOC-okat) vagy xenobiotikumokat kiemelt fontosságú szennyező anyagoknak tekintik, és komoly veszélyt jelentenek a globális környezetre és a közegészségügyre. Az emberi tevékenységek intenzitása (pl. széngázosítás, olajfinomítás, járművek kibocsátása és mezőgazdasági alkalmazások) meghatározza ezen mindenütt jelenlévő és perzisztens vegyületek koncentrációját, sorsát és transzportját. A fizikai és kémiai kezelési/eltávolítási módszerek mellett a zöld és környezetbarát technológiák, mint például a bioremediáció, amelyek olyan mikroorganizmusokat használnak, amelyek képesek a POC-k teljes lebontására vagy nem mérgező melléktermékekké alakítására, biztonságos, költséghatékony és ígéretes alternatívaként jelentek meg. A talajmikrobiotában található Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia és Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus és Paenibacillus) és Actinobacteria (Rhodococcus és Arthrobacter) törzsekhez tartozó különféle baktériumfajok bizonyították, hogy képesek lebontani különféle szerves vegyületeket. Az anyagcsere-vizsgálatok, a genomika és a metagenomikai elemzés segítenek megérteni ezekben az egyszerű életformákban jelen lévő katabolikus komplexitást és diverzitást, ami tovább alkalmazható a hatékony biodegradáció érdekében. A PAH-ok hosszú távú létezése új lebontási fenotípusok megjelenéséhez vezetett horizontális génátvitel révén, olyan genetikai elemek felhasználásával, mint a plazmidok, transzpozonok, bakteriofágok, genomiális szigetek és integratív konjugatív elemek. A rendszerbiológia és a specifikus izolátumok vagy modellközösségek (konzorciumok) géntechnológiája szinergikus hatásokon keresztül lehetővé teheti ezen PAH-ok átfogó, gyors és hatékony bioremediációját. Ebben az áttekintésben a naftalint és a szubsztituált naftalint lebontó baktériumok különböző anyagcsere-útvonalaira és diverzitására, genetikai összetételére és diverzitására, valamint sejtválaszaira/adaptációira összpontosítunk. Ez ökológiai információkat nyújt a terepi alkalmazáshoz és a hatékony bioremediáció érdekében a törzsek optimalizálásához.
Az iparágak (petrolkémia, mezőgazdaság, gyógyszeripar, textilfestékek, kozmetikumok stb.) gyors fejlődése hozzájárult a globális gazdasági jóléthez és az életszínvonal javulásához. Ez az exponenciális fejlődés nagyszámú szintetikus szerves vegyület (SOC) termeléséhez vezetett, amelyeket különféle termékek előállítására használnak. Ezek az idegen vegyületek vagy SOC-k közé tartoznak a policiklusos aromás szénhidrogének (PAH-ok), növényvédő szerek, herbicidek, lágyítók, színezékek, gyógyszerek, szerves foszfátok, égésgátlók, illékony szerves oldószerek stb. Ezek a légkörbe, a vízi és szárazföldi ökoszisztémákba kerülnek, ahol többdimenziós hatást fejtenek ki, káros hatásokat okozva a különböző bioformákra a fizikai-kémiai tulajdonságok és a közösségszerkezet megváltoztatásán keresztül (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Számos aromás szennyező anyag erős és romboló hatással van számos ép ökoszisztémára/biodiverzitási gócpontra (pl. korallzátonyok, sarkvidéki/antarktiszi jégtakarók, magashegyi tavak, mélytengeri üledékek stb.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). A legújabb geomikrobiológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a szintetikus szerves anyagok (pl. aromás szennyező anyagok) és származékaik lerakódása mesterséges építmények (épített környezet) felületén (pl. kulturális örökségi helyszínek és gránitból, kőből, fából és fémből készült emlékművek) felgyorsítja azok lebomlását (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Az emberi tevékenységek a légszennyezés és az éghajlatváltozás révén fokozhatják és súlyosbíthatják az emlékművek és épületek biológiai lebomlását (Liu et al. 2020). Ezek a szerves szennyező anyagok reakcióba lépnek a légkörben lévő vízgőzzel, és lerakódnak a szerkezeten, az anyag fizikai és kémiai lebomlását okozva. A biodegradációt széles körben az anyagok megjelenésében és tulajdonságaiban az élő szervezetek által okozott nemkívánatos változásokként ismerik el, amelyek befolyásolják azok megőrzését (Pochon és Jaton, 1967). Ezen vegyületek további mikrobiális hatása (anyagcseréje) csökkentheti a szerkezeti integritást, a konzerválás hatékonyságát és a kulturális értéket (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Másrészt bizonyos esetekben a mikrobiális alkalmazkodás és válasz ezekhez a struktúrákhoz előnyösnek bizonyult, mivel biofilmeket és más védőkéregeket képeznek, amelyek csökkentik a bomlás/bomlás sebességét (Martino, 2016). Ezért a kő-, fém- és faemlékek hatékony, hosszú távú fenntartható konzerválási stratégiáinak kidolgozása megköveteli a folyamatban részt vevő kulcsfontosságú folyamatok alapos megértését. A természetes folyamatokkal (geológiai folyamatok, erdőtüzek, vulkánkitörések, növényi és bakteriális reakciók) összehasonlítva az emberi tevékenységek nagy mennyiségű policiklusos aromás szénhidrogén (PAH) és más szerves szén (OC) kibocsátását eredményezik az ökoszisztémákba. Számos, a mezőgazdaságban (rovarirtó és növényvédő szerek, mint például a DDT, atrazin, karbaril, pentaklórfenol stb.), az iparban (nyersolaj, olajiszap/hulladék, kőolaj eredetű műanyagok, PCB-k, lágyítók, mosószerek, fertőtlenítőszerek, füstölőszerek, illatanyagok és tartósítószerek), a testápolási termékekben (naptej, fertőtlenítőszerek, rovarriasztók és policiklusos pézsmavegyületek) és a lőszerekben (robbanóanyagok, mint például a 2,4,6-TNT) használt PAH potenciális xenobiotikum, amely hatással lehet a bolygó egészségére (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna és Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Ez a lista bővíthető kőolaj eredetű vegyületekkel (üzemanyagolajok, kenőanyagok, aszfaltének), nagy molekulatömegű bioműanyagokkal és ionos folyadékokkal (Amde et al., 2015). Az 1. táblázat felsorolja a különböző aromás szennyező anyagokat és azok alkalmazását a különböző iparágakban. Az utóbbi években az illékony szerves vegyületek, valamint a szén-dioxid és más üvegházhatású gázok antropogén kibocsátása növekedni kezdett (Dvorak et al., 2017). Az antropogén hatások azonban jelentősen meghaladják a természetes hatásokat. Ezenkívül azt tapasztaltuk, hogy számos szerves szerves vegyület (SOC) számos környezeti környezetben fennmarad, és újonnan megjelenő szennyező anyagként azonosították őket, amelyek káros hatással vannak a biomokra (1. ábra). Környezetvédelmi ügynökségek, mint például az Egyesült Államok Környezetvédelmi Ügynöksége (USEPA), számos ilyen szennyező anyagot felvettek prioritási listájukra citotoxikus, genotoxikus, mutagén és rákkeltő tulajdonságaik miatt. Ezért szigorú ártalmatlanítási szabályozásokra és hatékony stratégiákra van szükség a hulladék kezelésére/eltávolítására a szennyezett ökoszisztémákból. Különböző fizikai és kémiai kezelési módszerek, mint például a pirolízis, az oxidatív hőkezelés, a levegőztetés, a hulladéklerakás, az égetés stb., hatástalanok és költségesek, valamint korrozív, mérgező és nehezen kezelhető melléktermékeket termelnek. A globális környezeti tudatosság növekedésével egyre nagyobb figyelmet kapnak azok a mikroorganizmusok, amelyek képesek lebontani ezeket a szennyező anyagokat és származékaikat (például halogénezett, nitro-, alkil- és/vagy metil-csoportokat) (Fennell et al., 2004; Haritash és Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Ezen őshonos mikroorganizmus-jelöltek önmagukban vagy vegyes kultúrákban (kolóniákban) történő alkalmazása aromás szennyező anyagok eltávolítására előnyökkel jár a környezeti biztonság, a költségek, a hatékonyság, az eredményesség és a fenntarthatóság szempontjából. A kutatók a mikrobiális folyamatok elektrokémiai redox módszerekkel, nevezetesen bioelektrokémiai rendszerekkel (BES) való integrációját is vizsgálják, mint ígéretes technológiát a szennyező anyagok kezelésére/eltávolítására (Huang et al., 2011). A BES technológia egyre nagyobb figyelmet kap nagy hatékonysága, alacsony költsége, környezetbiztonsága, szobahőmérsékleten való működése, biokompatibilis anyagai és az értékes melléktermékek (pl. elektromos áram, üzemanyag és vegyszerek) kinyerésének képessége miatt (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). A nagy áteresztőképességű genomszekvenálási és omikai eszközök/módszerek megjelenése rengeteg új információt szolgáltatott a különféle lebontó mikroorganizmusok reakcióinak genetikai szabályozásáról, proteomikájáról és fluxomikájáról. Ezen eszközök rendszerbiológiával való kombinálása tovább bővítette ismereteinket a mikroorganizmusokban a célzott katabolikus útvonalak kiválasztásáról és finomhangolásáról (azaz a metabolikus tervezésről) a hatékony és eredményes biodegradáció elérése érdekében. Ahhoz, hogy hatékony bioremediációs stratégiákat tervezzünk megfelelő mikroorganizmus-jelöltek felhasználásával, meg kell értenünk a mikroorganizmusok biokémiai potenciálját, metabolikus diverzitását, genetikai összetételét és ökológiáját (autoökológia/szinológia).
1. ábra. Az alacsony molekulatömegű PAH-ok forrásai és útvonalai különböző környezeti környezetekben és a biótát befolyásoló különféle tényezőkön keresztül. A szaggatott vonalak az ökoszisztéma-elemek közötti kölcsönhatásokat jelölik.
Ebben az áttekintésben összefoglaljuk az egyszerű PAH-ok, például a naftalin és a szubsztituált naftalinok különböző bakteriális izolátumok általi lebontására vonatkozó adatokat, lefedve az anyagcsere-utakat és a diverzitást, a lebontásban részt vevő enzimeket, a génösszetételt/-tartalmat és -diverzitást, a sejtválaszokat és a bioremediáció különböző aspektusait. A biokémiai és molekuláris szintek megértése segít a megfelelő gazdatörzsek azonosításában és további géntechnológiájukban az ilyen prioritást élvező szennyező anyagok hatékony bioremediációja érdekében. Ez segít a hatékony bioremediációhoz szükséges helyspecifikus bakteriális konzorciumok létrehozására vonatkozó stratégiák kidolgozásában.
A nagyszámú mérgező és veszélyes aromás vegyület jelenléte (amelyek kielégítik a Huckel-szabályt: 4n + 2π elektronok, n = 1, 2, 3, …) komoly veszélyt jelent a különböző környezeti közegekre, mint például a levegőre, a talajra, az üledékekre, valamint a felszíni és talajvizekre (Puglisi et al., 2007). Ezek a vegyületek egyetlen benzolgyűrűvel (monociklusos) vagy több benzolgyűrűvel (policiklusos) rendelkeznek, amelyek lineáris, szögletes vagy klaszter formában rendeződnek el, és stabilitást (stabilitást/instabilitást) mutatnak a környezetben a magas negatív rezonanciaenergia és az inertség (inercitások) miatt, ami hidrofóbicitásukkal és redukált állapotukkal magyarázható. Amikor az aromás gyűrűt tovább helyettesítik metil- (-CH3), karboxil- (-COOH), hidroxil- (-OH) vagy szulfonát- (-HSO3) csoportok, stabilabbá válik, erősebb affinitással rendelkezik a makromolekulákhoz, és bioakkumulatív a biológiai rendszerekben (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Néhány kis molekulatömegű policiklusos aromás szénhidrogén (LMWAH), mint például a naftalin és származékai [metilnaftalin, naftoesav, naftalinszulfonát és 1-naftil-N-metil-karbamát (karbaril)], az Egyesült Államok Környezetvédelmi Ügynöksége által a prioritást élvező szerves szennyező anyagok listájára került genotoxikus, mutagén és/vagy rákkeltő anyagként (Cerniglia, 1984). Az ilyen NM-PAH-ok környezetbe történő kibocsátása a vegyületek bioakkumulációját eredményezheti a tápláléklánc minden szintjén, ezáltal befolyásolva az ökoszisztémák egészségét (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
A PAH-ok forrásai és útjai a biótába elsősorban a különböző ökoszisztéma-összetevők, például a talaj, a talajvíz, a felszíni víz, a növények és a légkör migrációján és kölcsönhatásain keresztül történnek (Arey és Atkinson, 2003). Az 1. ábra a különböző kis molekulatömegű PAH-ok kölcsönhatásait és eloszlását mutatja az ökoszisztémákban, valamint a bióta/emberi expozícióhoz vezető útjaikat. A PAH-ok a levegőszennyezés eredményeként, valamint a járművek kipufogógázainak, ipari kipufogógázainak (széngázosítás, égetés és kokszgyártás) migrációja (elsodródása) és lerakódásának révén rakódnak le a felületeken. Az olyan ipari tevékenységek, mint a szintetikus textíliák, festékek és festékek gyártása; a faanyagvédelem; a gumifeldolgozás; a cementgyártás; a növényvédőszer-gyártás; és a mezőgazdasági alkalmazások a PAH-ok fő forrásai a szárazföldi és vízi rendszerekben (Bamforth és Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Tanulmányok kimutatták, hogy az elővárosi és városi területeken, az autópályák közelében és a nagyvárosokban található talajok érzékenyebbek a policiklusos aromás szénhidrogénekre (PAH-okra) az erőművekből, a lakossági fűtésből, a levegő és a közúti forgalom terheléséből, valamint az építési tevékenységekből származó kibocsátások miatt (Suman et al., 2016). (2008) kimutatták, hogy az egyesült államokbeli Louisiana állambeli New Orleansban az utak közelében lévő talajban a PAH-ok szintje elérte a 7189 μg/kg-ot, míg a nyílt térben mindössze 2404 μg/kg-ot. Hasonlóképpen, több amerikai városban a szénelgázosító telepek közelében található területeken akár 300 μg/kg-os PAH-szintet is jelentettek (Kanaly és Harayama, 2000; Bamforth és Singleton, 2005). Különböző indiai városok, például Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni és Venkataraman, 2000) és Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014) talajaiban magas koncentrációban találhatók PAH-ok. Az aromás vegyületek könnyebben adszorbeálódnak a talajrészecskékhez, a szerves anyagokhoz és az agyagásványokhoz, így az ökoszisztémákban jelentős szén-dioxid-megkötőkké válnak (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). A PAH-ok fő forrásai a vízi ökoszisztémákban a csapadék (nedves/száraz csapadék és vízgőz), a városi lefolyás, a szennyvízkibocsátás, a talajvíz-utánpótlódás stb. (Srogi, 2007). Becslések szerint a tengeri ökoszisztémákban található PAH-ok mintegy 80%-a csapadékból, üledékképződésből és hulladékkibocsátásból származik (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). A felszíni vizekben vagy a szilárdhulladék-lerakókból származó szivárgásban lévő PAH-ok magasabb koncentrációja végül a talajvízbe szivárog, ami jelentős közegészségügyi kockázatot jelent, mivel Dél- és Délkelet-Ázsia lakosságának több mint 70%-a iszik talajvizet (Duttagupta et al., 2019). Duttagupta és munkatársai (2020) nemrégiben, Nyugat-Bengálból (India) származó folyó- (32) és talajvíz- (235) elemzéseket végeztek, és megállapították, hogy a városi lakosok 53%-a és a vidéki lakosok 44%-a (összesen 20 millió lakos) lehet kitéve naftalinnak (4,9–10,6 μg/l) és származékainak. A földhasználat eltérő mintázatait és a fokozott talajvíz-kitermelést tekintik a kis molekulatömegű PAH-ok felszín alatti vertikális transzportját (advekcióját) szabályozó fő tényezőknek. A mezőgazdasági lefolyásokat, a települési és ipari szennyvízkibocsátásokat, valamint a szilárd hulladék/szemét kibocsátását a folyómedencékben és a felszín alatti üledékekben lévő PAH-ok befolyásolják. A légköri csapadék tovább súlyosbítja a PAH-szennyezést. A PAH-ok és alkilszármazékaik magas koncentrációját (összesen 51) jelentették folyókban/vízgyűjtőkben világszerte, például a Fraser folyóban, a Louan folyóban, a Denso folyóban, a Missouri folyóban, az Anacostia folyóban, az Ebro folyóban és a Delaware folyóban (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). A Gangesz folyó vízgyűjtő üledékében a naftalin és a fenantrén volt a legjelentősebb (a minták 70%-ában kimutatható) (Duttagupta et al., 2019). Ezenkívül tanulmányok kimutatták, hogy az ivóvíz klórozása mérgezőbb oxigéntartalmú és klórozott PAH-ok képződéséhez vezethet (Manoli és Samara, 1999). A PAH-ok felhalmozódnak a gabonafélékben, gyümölcsökben és zöldségekben a növények szennyezett talajból, talajvízből és csapadékból történő felvétele következtében (Fismes et al., 2002). Számos vízi élőlény, például a halak, kagylók, csigafélék és garnélák szennyeződnek PAH-okkal szennyezett élelmiszerek és tengervíz fogyasztása, valamint szöveteken és bőrön keresztül (Mackay és Fraser, 2000). Az olyan főzési/feldolgozási módszerek, mint a grillezés, sütés, füstölés, sütés olajban, szárítás, sütés és faszénen főzés szintén jelentős mennyiségű PAH-hoz vezethetnek az élelmiszerekben. Ez nagymértékben függ a füstölőanyag megválasztásától, a fenolos/aromás szénhidrogén-tartalomtól, a főzési eljárástól, a fűtőberendezés típusától, a nedvességtartalomtól, az oxigénellátástól és az égési hőmérséklettől (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Policiklusos aromás szénhidrogéneket (PAH-okat) tejben is kimutatták különböző koncentrációkban (0,75–2,1 mg/l) (Girelli et al., 2014). Ezen PAH-ok élelmiszerekben való felhalmozódása az élelmiszer fizikai-kémiai tulajdonságaitól is függ, míg toxikus hatásuk a fiziológiai funkciókkal, az anyagcsere-aktivitással, a felszívódással, az eloszlással és a szervezetben való eloszlással függ össze (Mechini et al., 2011).
A policiklusos aromás szénhidrogének (PAH-ok) toxicitása és káros hatásai régóta ismertek (Cherniglia, 1984). A kis molekulatömegű policiklusos aromás szénhidrogének (LMW-PAH-ok) (két-három gyűrű) kovalensen kötődhetnek különféle makromolekulákhoz, például DNS-hez, RNS-hez és fehérjékhez, és rákkeltőek (Santarelli et al., 2008). Hidrofób jellegük miatt lipidmembránok választják el őket egymástól. Emberben a citokróm P450 monooxigenázok a PAH-okat epoxidokká oxidálják, amelyek közül néhány nagyon reaktív (pl. a baediol-epoxid), és a normál sejtek rosszindulatúvá válásához vezethet (Marston et al., 2001). Ezenkívül a PAH-ok átalakulási termékei, például a kinonok, fenolok, epoxidok, diolok stb. toxikusabbak, mint az alapvegyületek. Egyes PAH-ok és metabolikus intermedierjeik befolyásolhatják a hormonokat és a különféle anyagcsere-enzimeket, ezáltal hátrányosan befolyásolva a növekedést, a központi idegrendszert, a reproduktív és az immunrendszert (Swetha és Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). A kis molekulatömegű PAH-oknak való rövid távú kitettségről kimutatták, hogy asztmás betegeknél károsodott tüdőfunkciót és trombózist okoz, valamint növeli a bőr-, tüdő-, hólyag- és gyomor-bélrendszeri rákos megbetegedések kockázatát (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Állatkísérletek azt is kimutatták, hogy a PAH-oknak való kitettség káros hatással lehet a reproduktív funkcióra és fejlődésre, és szürkehályogot, vese- és májkárosodást, valamint sárgaságot okozhat. Különböző PAH biotranszformációs termékek, például diolok, epoxidok, kinonok és szabad gyökök (kationok) DNS-adduktumokat képeznek. Kimutatták, hogy a stabil adduktumok megváltoztatják a DNS-replikációs mechanizmust, míg az instabil adduktumok depurinálhatják a DNS-t (főleg adeninné, néha guaninná); mindkettő hibákat generálhat, amelyek mutációkhoz vezetnek (Schweigert et al. 2001). Ezenkívül a kinonok (benzo-/pan-) reaktív oxigénfajtákat (ROS) hozhatnak létre, végzetes károsodást okozva a DNS-ben és más makromolekulákban, ezáltal befolyásolva a szövetek működését/életképességét (Ewa és Danuta 2017). A pirén, bifenil és naftalin alacsony koncentrációjának krónikus kitettsége kísérleti állatoknál rákot okozott (Diggs et al. 2012). Halálos toxicitásuk miatt ezen PAH-ok eltávolítása az érintett/szennyezett helyekről prioritás.
Különböző fizikai és kémiai módszereket alkalmaztak a PAH-ok eltávolítására a szennyezett helyszínekről/környezetből. Az olyan eljárások, mint a hamvasztás, a klórmentesítés, az UV-oxidáció, a fixálás és az oldószeres extrakció számos hátránnyal járnak, beleértve a mérgező melléktermékek képződését, a folyamatok bonyolultságát, a biztonsági és szabályozási kérdéseket, az alacsony hatékonyságot és a magas költségeket. A mikrobiális biodegradáció (más néven bioremediáció) azonban egy ígéretes alternatív megközelítés, amely a mikroorganizmusok tiszta kultúrák vagy telepek formájában történő alkalmazását foglalja magában. A fizikai és kémiai módszerekkel összehasonlítva ez az eljárás környezetbarát, nem invazív, költséghatékony és fenntartható. A bioremediáció elvégezhető az érintett helyszínen (in situ) vagy egy speciálisan előkészített helyszínen (ex situ), ezért fenntarthatóbb kármentesítési módszernek tekinthető, mint a hagyományos fizikai és kémiai módszerek (Juhasz és Naidu, 2000; Andreoni és Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Az aromás szennyező anyagok lebontásában részt vevő mikrobiális anyagcsere-lépések megértése óriási tudományos és gazdasági következményekkel jár az ökológiai és környezeti fenntarthatóság szempontjából. Becslések szerint világszerte 2,1×1018 gramm szén (C) tárolódik üledékekben és szerves vegyületekben (azaz olajban, földgázban és szénben, azaz fosszilis tüzelőanyagokban), ami jelentősen hozzájárul a globális szénciklushoz. A gyors iparosodás, a fosszilis tüzelőanyagok kitermelése és az emberi tevékenységek azonban kimerítik ezeket a litoszférikus szénraktárakat, és évente becslések szerint 5,5×1015 g szerves szenet (szennyező anyagként) juttatnak a légkörbe (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Ennek a szerves szénnek a nagy része üledékképződés, szállítás és lefolyás révén jut be a szárazföldi és tengeri ökoszisztémákba. Ezenkívül a fosszilis tüzelőanyagokból származó új szintetikus szennyező anyagok, mint például a műanyagok, lágyítók és műanyag-stabilizátorok (ftalátok és izomerjeik), súlyosan szennyezik a tengeri, talaj- és vízi ökoszisztémákat és azok élővilágát, ezáltal súlyosbítva a globális éghajlati kockázatokat. Különböző típusú mikroműanyagok, nanoműanyagok, műanyagtöredékek és azok polietilén-tereftalátból (PET) származó mérgező monomer termékei halmozódtak fel a Csendes-óceánban Észak-Amerika és Délkelet-Ázsia között, létrehozva a „Nagy Csendes-óceáni Szemétfoltot”, károsítva a tengeri élővilágot (Newell et al., 2020). Tudományos tanulmányok bebizonyították, hogy az ilyen szennyező anyagokat/hulladékot semmilyen fizikai vagy kémiai módszerrel nem lehet eltávolítani. Ebben az összefüggésben a leghasznosabb mikroorganizmusok azok, amelyek képesek oxidatív úton metabolizálni a szennyező anyagokat szén-dioxiddá, kémiai energiává és más nem mérgező melléktermékekké, amelyek végül más tápanyag-körforgási folyamatokba (H, O, N, S, P, Fe stb.) kerülnek be. Így az aromás szennyező anyagok mineralizációjának mikrobiális ökofiziológiájának és környezeti szabályozásának megértése kulcsfontosságú a mikrobiális szénciklus, a nettó szén-dioxid-kibocsátás és a jövőbeli éghajlati kockázatok felméréséhez. Tekintettel az ilyen vegyületek környezetből való eltávolításának sürgős szükségességére, számos, a tiszta technológiákra összpontosító ökoiparág jelent meg. Alternatív megoldásként az ökoszisztémákban felhalmozódott ipari hulladék/hulladékvegyi anyagok értéknövelése (azaz a „hulladékból vagyonná” megközelítés) a körforgásos gazdaság és a fenntartható fejlődési célok egyik pillérének tekinthető (Close et al., 2012). Ezért ezen potenciális lebomlási jelöltek metabolikus, enzimatikus és genetikai aspektusainak megértése rendkívül fontos az ilyen aromás szennyező anyagok hatékony eltávolítása és bioremediációja szempontjából.
A számos aromás szennyező anyag közül különös figyelmet fordítunk az alacsony molekulatömegű PAH-okra, mint például a naftalin és a szubsztituált naftalinok. Ezek a vegyületek a kőolajszármazékú üzemanyagok, textilfestékek, fogyasztási cikkek, növényvédő szerek (molyirtó szerek és rovarriasztók), lágyítók és tanninok fő alkotóelemei, ezért számos ökoszisztémában elterjedtek (Preuss et al., 2003). A legújabb jelentések kiemelik a naftalin koncentrációjának felhalmozódását a víztartó üledékekben, a talajvízben és a felszín alatti talajokban, a vadose zónákban és a folyómedreknél, ami a környezetben való bioakkumulációjára utal (Duttagupta et al., 2019, 2020). A 2. táblázat összefoglalja a naftalin és származékai fizikai-kémiai tulajdonságait, alkalmazását és egészségügyi hatásait. Más nagy molekulatömegű PAH-okhoz képest a naftalin és származékai kevésbé hidrofóbok, jobban vízoldhatók és széles körben elterjedtek az ökoszisztémákban, ezért gyakran használják modell-szubsztrátként a PAH-ok anyagcseréjének, genetikájának és metabolikus diverzitásának vizsgálatára. Számos mikroorganizmus képes metabolizálni a naftalint és származékait, és átfogó információk állnak rendelkezésre anyagcsere-útvonalaikról, enzimjeikről és szabályozási jellemzőikről (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Ezenkívül a naftalint és származékait prototípus vegyületekként jelölik meg a környezetszennyezés értékeléséhez magas előfordulásuk és biohasznosulásuk miatt. Az Egyesült Államok Környezetvédelmi Ügynöksége becslése szerint a naftalin átlagos szintje 5,19 μg/köbméter a cigarettafüstből, elsősorban a tökéletlen égésből, és 7,8-46 μg a mellékáramú füstből, míg a kreozottal és a naftalinnal való expozíció 100-10 000-szer magasabb (Preuss et al. 2003). Különösen a naftalinról derült ki, hogy faj-, régió- és nemspecifikus légzőszervi toxicitást és rákkeltő hatást mutat. Állatkísérletek alapján a Nemzetközi Rákkutatási Ügynökség (IARC) a naftalint „lehetséges emberi rákkeltő anyagként” (2B csoport)1 osztályozta. A szubsztituált naftalinoknak való kitettség, elsősorban belélegzés vagy parenterális (orális) adagolás útján, tüdőszövet-károsodást okoz és növeli a tüdődaganatok előfordulását patkányokban és egerekben (Nemzeti Toxikológiai Program 2). Az akut hatások közé tartozik a hányinger, hányás, hasi fájdalom, hasmenés, fejfájás, zavartság, erős izzadás, láz, tachycardia stb. Másrészt a széles spektrumú karbamát rovarirtó karbaril (1-naftil-N-metil-karbamát) kimutathatóan mérgező a vízi gerinctelenekre, kétéltűekre, mézelő méhekre és emberekre, és kimutatták, hogy gátolja az acetilkolinészterázt, ami bénulást okoz (Smulders et al., 2003; Bulen és Distel, 2011). Ezért a mikrobiális lebomlás, a genetikai szabályozás, az enzimatikus és sejtes reakciók mechanizmusainak megértése kulcsfontosságú a szennyezett környezetben történő bioremediációs stratégiák kidolgozásához.
2. táblázat. Részletes információk a naftalin és származékai fizikai-kémiai tulajdonságairól, felhasználásáról, azonosítási módszereiről és a kapcsolódó betegségekről.
A szennyezett fülkékben a hidrofób és lipofil aromás szennyező anyagok számos sejtes hatást gyakorolhatnak a környezeti mikrobiomra (közösségre), például a membrán fluiditásának, a membrán permeabilitásának megváltozását, a lipid kettősréteg duzzadását, az energiaátadás megzavarását (elektrontranszportlánc/proton mozgatóerő) és a membránhoz kapcsolódó fehérjék aktivitását (Sikkema et al., 1995). Ezenkívül egyes oldható intermedierek, például a katekolok és a kinonok reaktív oxigénfajokat (ROS) termelnek, és adduktokat képeznek DNS-sel és fehérjékkel (Penning et al., 1999). Így az ilyen vegyületek bősége az ökoszisztémákban szelekciós nyomást gyakorol a mikrobiális közösségekre, hogy hatékony lebontóvá váljanak különböző fiziológiai szinteken, beleértve a felvételt/szállítást, az intracelluláris átalakulást, az asszimilációt/hasznosítást és a kompartmentalizációt.
A Ribosomal Database Project-II (RDP-II) kutatása kimutatta, hogy összesen 926 baktériumfajt izoláltak naftalinnal vagy származékaival szennyezett táptalajokból vagy dúsító tenyészetekből. A Proteobacteria csoportban volt a legtöbb képviselő (n = 755), ezt követték a Firmicutes (52), a Bacteroidetes (43), az Actinobacteria (39), a Tenericutes (10) és az osztályozatlan baktériumok (8) (2. ábra). A γ-Proteobacteriumok (Pseudomonadales és Xanthomonadales) képviselői domináltak az összes Gram-negatív csoportban, magas G+C-tartalommal (54%), míg a Clostridiales és Bacillales (30%) Gram-pozitív csoportok voltak alacsony G+C-tartalommal. A Pseudomonasokról (a legnagyobb számban, 338 fajról) kimutatták, hogy képesek lebontani a naftalint és metilszármazékait különféle szennyezett ökoszisztémákban (kőszénkátrány, kőolaj, nyersolaj, iszap, olajszennyezés, szennyvíz, szerves hulladék és hulladéklerakók), valamint ép ökoszisztémákban (talaj, folyók, üledékek és talajvíz) (2. ábra). Ezenkívül ezen régiók némelyikének dúsulási vizsgálata és metagenomikai elemzése kimutatta, hogy a tenyésztetlen Legionella és Clostridium fajok lebontó képességgel rendelkezhetnek, ami jelzi, hogy ezeket a baktériumokat tenyészteni kell az új útvonalak és az anyagcsere-diverzitás tanulmányozása érdekében.
2. ábra. A baktériumok képviselőinek taxonómiai sokfélesége és ökológiai eloszlása ​​naftalinnal és naftalinszármazékokkal szennyezett környezetben.
A különféle aromás szénhidrogéneket lebontó mikroorganizmusok közül a legtöbb képes a naftalin lebontására, mint egyetlen szén- és energiaforrásra. A naftalin anyagcseréjében szerepet játszó eseménysorozatot a Pseudomonas sp. esetében leírták. (törzsek: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 és CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 és más törzsek (ND6 és AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis és Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Az anyagcserét egy többkomponensű dioxigenáz [naftalin-dioxigenáz (NDO), egy gyűrűhidroxiláló dioxigenáz] indítja el, amely a naftalin egyik aromás gyűrűjének oxidációját katalizálja molekuláris oxigént használva másik szubsztrátként, a naftalint cisz-naftalindiollá alakítva (3. ábra). A cisz-dihidrodiolt egy dehidrogenáz 1,2-dihidroxi-naftalinná alakítja. A A gyűrűhasító dioxigenáz, az 1,2-dihidroxinaftalin-dioxigenáz (12DHNDO) az 1,2-dihidroxinaftalint 2-hidroxikromén-2-karbonsavvá alakítja. Az enzimatikus cisz-transz izomerizáció transz-o-hidroxibenzilidénpiruvátot eredményez, amelyet a hidratáz-aldoláz szalicilaldehiddé és piruváttá hasít. A szerves savpiruvát volt az első C3 vegyület, amely a naftalin szénvázából származott, és a központi szén útvonalba irányult. Ezenkívül a NAD+-függő szalicilaldehid-dehidrogenáz a szalicilaldehidet szalicilsavvá alakítja. Az anyagcserét ebben a szakaszban a naftalin lebontásának „felső útvonalának” nevezik. Ez az útvonal nagyon gyakori a legtöbb naftalint lebontó baktériumban. Van azonban néhány kivétel; például a termofil Bacillus hamburgii 2-ben a naftalin lebontását a naftalin-2,3-dioxigenáz indítja el, 2,3-dihidroxinaftalint képezve (Annweiler et al., 2000).
3. ábra. A naftalin, metilnaftalin, naftalin és karbaril lebontásának útvonalai. A bekarikázott számok a naftalin és származékainak egymást követő termékekké történő átalakulásáért felelős enzimeket jelölik. 1 — naftalin-dioxigenáz (NDO); 2, cisz-dihidrodiol-dehidrogenáz; 3, 1,2-dihidroxinaftalin-dioxigenáz; 4, 2-hidroxi-kromén-2-karbonsav-izomeráz; 5, transz-O-hidroxibenzilidénpiruvát-hidratáz aldoláz; 6, szalicilaldehid-dehidrogenáz; 7, szalicilát-1-hidroxiláz; 8, katekol-2,3-dioxigenáz (C23DO); 9, 2-hidroximukonát-szemialdehid-dehidrogenáz; 10, 2-oxopent-4-enoát-hidratáz; 11, 4-hidroxi-2-oxopentanoát-aldoláz; 12, acetaldehid-dehidrogenáz; 13, katekol-1,2-dioxigenáz (C12DO); 14, mukonát cikloizomeráz; 15, mukonolakton delta-izomeráz; 16, β-ketoadipatenollakton hidroláz; 17, β-ketoadipát szukcinil-CoA transzferáz; 18, β-ketoadipát-CoA tioláz; 19, szukcinil-CoA: acetil-CoA szukciniltranszferáz; 20, szalicilát-5-hidroxiláz; 21 – gentizát 1,2-dioxigenáz (GDO); 22, maleilpiruvát izomeráz; 23, fumarilpiruvát hidroláz; 24, metilnaftalin-hidroxiláz (NDO); 25, hidroximetilnaftalin-dehidrogenáz; 26, naftaldehid-dehidrogenáz; 27, 3-formilszalicilsav-oxidáz; 28, hidroxiizoftalát-dekarboxiláz; 29, karbaril-hidroláz (CH); 30, 1-naftol-2-hidroxiláz.
A szervezettől és genetikai felépítésétől függően a keletkező szalicilsav tovább metabolizálódik vagy a katekol útvonalon keresztül szalicilát-1-hidroxiláz (S1H) segítségével, vagy a gentisát útvonalon keresztül szalicilát-5-hidroxiláz (S5H) segítségével (3. ábra). Mivel a szalicilsav a naftalin anyagcseréjének fő köztiterméke (felső útvonal), a szalicilsavtól a TCA köztitermékig tartó lépéseket gyakran alsó útvonalnak nevezik, és a gének egyetlen operonba szerveződnek. Gyakori, hogy a felső útvonal operonjában (nah) és az alsó útvonal operonjában (sal) lévő géneket közös szabályozó tényezők szabályozzák; például a NahR és a szalicilsav induktorként működik, lehetővé téve mindkét operon számára a naftalin teljes metabolizálását (Phale et al., 2019, 2020).
Ezenkívül a katekol ciklikusan hasad 2-hidroximukonát-szemialdehiddé a meta-útvonalon keresztül a katekol-2,3-dioxigenáz (C23DO) segítségével (Yen és munkatársai, 1988), majd tovább hidrolizál 2-hidroximukonát-szemialdehid hidrolázzal, így 2-hidroxipent-2,4-diénsav keletkezik. A 2-hidroxipent-2,4-dienoátot ezután egy hidratáz (2-oxopent-4-enoát-hidratáz) és egy aldoláz (4-hidroxi-2-oxopentanoát-aldoláz) piruváttá és acetaldehiddé alakítja, majd belép a központi szén útvonalba (3. ábra). Alternatív megoldásként a katekol ciklikusan hasad cisz,cisz-mukonáttá az orto-útvonalon keresztül a katekol-1,2-oxigenáz (C12DO) segítségével. A mukonát cikloizomeráz, a mukonolakton izomeráz és a β-ketoadipát-nollakton hidroláz a cisz,cisz-mukonátot 3-oxoadipáttá alakítja, amely szukcinil-CoA-n és acetil-CoA-n keresztül jut be a központi szén útvonalba (Nozaki et al., 1968) (3. ábra).
A gentizát (2,5-dihidroxi-benzoát) útvonalon az aromás gyűrűt a gentizát-1,2-dioxigenáz (GDO) hasítja, maleil-piruvátot képezve. Ez a termék közvetlenül hidrolizálható piruváttá és maláttá, vagy izomerizálható fumaril-piruváttá, amely ezután piruváttá és fumaráttá hidrolizálható (Larkin és Day, 1986). Az alternatív útvonal választását mind Gram-negatív, mind Gram-pozitív baktériumoknál megfigyelték biokémiai és genetikai szinten (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). A Gram-negatív baktériumok (Pseudomonas) előszeretettel használnak szalicilsavat, amely a naftalin anyagcseréjének induktora, és szalicilát-1-hidroxiláz segítségével katekollá dekarboxilezik azt (Gibson és Subramanian, 1984). Másrészt viszont Gram-pozitív baktériumokban (Rhodococcus) a szalicilát-5-hidroxiláz a szalicilsavat gentizinsavvá alakítja, míg a szalicilsavnak nincs induktív hatása a naftalin gének transzkripciójára (Grund et al., 1992) (3. ábra).
Jelentések szerint olyan fajok, mint a Pseudomonas CSV86, az Oceanobacterium NCE312, a Marinhomonas naphthotrophicus, a Sphingomonas paucimobilis 2322, a Vibrio cyclotrophus, a Pseudomonas fluorescens LP6a, a Pseudomonas és a Mycobacterium fajok képesek lebontani a monometilnaftalint vagy a dimetilnaftalint (Dean-Raymond és Bartha, 1975; Cane és Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Ezek közül a Pseudomonas sp. CSV86 1-metilnaftalin és 2-metilnaftalin lebontási útvonalát egyértelműen tanulmányozták biokémiai és enzimatikus szinten (Mahajan et al., 1994). Az 1-metilnaftalin két útvonalon metabolizálódik. Először az aromás gyűrű hidroxileződik (a metilnaftalin szubsztituálatlan gyűrűje), így cisz-1,2-dihidroxi-1,2-dihidro-8-metilnaftalin keletkezik, amely tovább oxidálódik metil-szaliciláttá és metilkatechinné, majd a gyűrűhasadás után belép a központi szén útvonalba (3. ábra). Ezt az útvonalat „szénforrás útvonalnak” nevezik. A második „méregtelenítő útvonalban” a metilcsoportot NDO hidroxilezheti, így 1-hidroximetilnaftalin keletkezik, amely tovább oxidálódik 1-naftalinsavvá, és végtermékként kiválasztódik a táptalajba. Tanulmányok kimutatták, hogy a CSV86 törzs nem képes növekedni 1- és 2-naftalinsavon, mint kizárólagos szén- és energiaforráson, ami megerősíti méregtelenítő útvonalát (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). A 2-metilnaftalinban a metilcsoport hidroxilázzal hidroxileződik, így 2-hidroximetilnaftalin keletkezik. Ezenkívül a naftalingyűrű szubsztituálatlan gyűrűje gyűrűhidroxiláción megy keresztül, dihidrodiolt képezve, amely enzimkatalizált reakciók sorozatában 4-hidroximetil-pirokatechinná oxidálódik, és a meta-gyűrű hasítási útvonalon keresztül belép a központi szén útvonalba. Hasonlóképpen, az S. paucimobilis 2322-ről kimutatták, hogy NDO-t használ a 2-metil-naftalin hidroxilezésére, amely tovább oxidálódik metil-szaliciláttá és metil-pirokatechinná (Dutta et al., 1998).
A naftoesavak (szubsztituált/szubsztituálatlan) méregtelenítési/biotranszformációs melléktermékek, amelyek a metilnaftalin, a fenantrén és az antracén lebomlása során keletkeznek, és a használt táptalajba kerülnek. A beszámolók szerint a Stenotrophomonas maltophilia CSV89 talajból izolált baktérium képes az 1-naftoesavat szénforrásként metabolizálni (Phale et al., 1995). Az anyagcsere az aromás gyűrű dihidroxilezésével kezdődik, amely 1,2-dihidroxi-8-karboxi-naftalint képez. A kapott diol 2-hidroxi-3-karboxibenzilidénpiruváton, 3-formilszalicilsavon, 2-hidroxiizoftálsavon és szalicilsavon keresztül katekollá oxidálódik, és a metagyűrű hasítási útvonalon keresztül belép a központi szén útvonalba (3. ábra).
A karbaril egy naftil-karbamát növényvédő szer. Az 1970-es évekbeli indiai zöld forradalom óta a kémiai műtrágyák és növényvédő szerek használata a mezőgazdasági, nem pontszerű forrásokból származó policiklusos aromás szénhidrogének (PAH) kibocsátásának növekedéséhez vezetett (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Becslések szerint India teljes termőterületének 55%-át (85 722 000 hektár) kezelik kémiai növényvédő szerekkel. Az elmúlt öt évben (2015–2020) az indiai mezőgazdasági ágazat átlagosan évente 55 000–60 000 tonna növényvédő szert használt fel (Szövetkezeti és Gazdálkodói Jóléti Minisztérium, Mezőgazdasági Minisztérium, Indiai Kormány, 2020. augusztus). Az északi és középső Gangesz-síkságon (a legnagyobb népességű és népsűrűségű államokban) a növényvédő szerek használata széles körben elterjedt, a rovarirtók dominálnak. A karbaril (1-naftil-N-metilkarbamát) egy széles spektrumú, közepesen vagy erősen mérgező karbamát rovarirtó szer, amelyet az indiai mezőgazdaságban átlagosan 100–110 tonna mennyiségben használnak. Általában Sevin márkanéven forgalmazzák, és különféle növényeket (kukorica, szójabab, gyapot, gyümölcsök és zöldségek) érintő rovarok (levéltetvek, tűzhangyák, bolhák, atkák, pókok és sok más kültéri kártevő) irtására használják. Egyes mikroorganizmusok, mint például a Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus és Arthrobacter, más kártevők irtására is használhatók. Jelentések szerint az RC100 képes lebontani a karbarilt (Larkin és Day, 1986; Chapalamadugu és Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha és Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). A karbaril lebontási útvonalát széles körben tanulmányozták biokémiai, enzimatikus és genetikai szinten a Pseudomonas sp. C4, C5 és C6 törzsek talajizolátumaiban (Swetha és Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (3. ábra). Az anyagcsereút az észterkötés karbaril-hidroláz (CH) általi hidrolízisével kezdődik, amely 1-naftollá, metil-aminná és szén-dioxiddá alakul. Az 1-naftolt ezután az 1-naftol-hidroxiláz (1-NH) 1,2-dihidroxi-naftalinná alakítja, amely tovább metabolizálódik a központi szén útvonalon szaliciláton és gentisáton keresztül. Néhány karbaril-bontó baktériumról kimutatták, hogy a katekol orto gyűrűjének hasításával szalicilsavvá metabolizálja azt (Larkin és Day, 1986; Chapalamadugu és Chaudhry, 1991). Figyelemre méltó, hogy a naftalin-bontó baktériumok elsősorban katekol útján metabolizálják a szalicilsavat, míg a karbaril-bontó baktériumok előnyben részesítik a szalicilsavat a gentisát útvonalon keresztül.
A naftalinszulfonsav/diszulfonsav és a naftilaminszulfonsav származékok intermedierként használhatók azoszínezékek, nedvesítőszerek, diszpergálószerek stb. előállításában. Bár ezek a vegyületek alacsony toxicitásúak az emberre nézve, a citotoxicitási vizsgálatok kimutatták, hogy halálosak a halakra, a daphniákra és az algákra nézve (Greim et al., 1994). A Pseudomonas nemzetség képviselőiről (A3, C22 törzsek) kimutatták, hogy az anyagcserét a szulfonsavcsoportot tartalmazó aromás gyűrű kettős hidroxilezésével indítják el, így dihidrodiolt képeznek, amely a szulfitcsoport spontán hasításával tovább alakul 1,2-dihidroxi-naftalinná (Brilon et al., 1981). A kapott 1,2-dihidroxi-naftalin a klasszikus naftalin útvonalon, azaz a katekol- vagy gentisát-útvonalon katabolizálódik (4. ábra). Kimutatták, hogy az aminonaftalinszulfonsav és a hidroxinaftalinszulfonsav teljesen lebontható vegyes bakteriális konzorciumokkal, amelyek kiegészítő katabolikus útvonalakon működnek (Nortemann et al., 1986). Kimutatták, hogy a konzorcium egyik tagja 1,2-dioxigénezéssel deszulfurálja az aminonaftalinszulfonsavat vagy a hidroxinaftalinszulfonsavat, míg az aminoszalicilát vagy a hidroxiszalicilát holtpontként szabadul fel a táptalajba, majd a konzorcium többi tagja felveszi. A naftalindiszulfonsav viszonylag poláris, de biológiailag rosszul lebomló, ezért különböző útvonalakon metabolizálható. Az első deszulfurizáció az aromás gyűrű és a szulfonsavcsoport regioszelektív dihidroxilációja során történik; a második deszulfurizáció az 5-szulfoszalicilsav szalicilsav-5-hidroxiláz általi hidroxilációja során történik, így gentizinsav keletkezik, amely a központi szén útvonalba kerül (Brilon et al., 1981) (4. ábra). A naftalin lebontásáért felelős enzimek a naftalinszulfonát anyagcseréjéért is felelősek (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
4. ábra. A naftalinszulfonát lebontásának metabolikus útvonalai. A körökben lévő számok a naftilszulfonát anyagcseréjéért felelős enzimeket jelölik, amelyek hasonlóak/azonosak a 3. ábrán leírt enzimekkel.
A kis molekulatömegű PAH-ok (LMW-PAH-ok) redukálhatók, hidrofóbok és rosszul oldódnak, ezért nem érzékenyek a természetes lebomlásra/degradációra. Az aerob mikroorganizmusok azonban képesek oxidálni őket molekuláris oxigén (O2) elnyelésével. Ezek az enzimek főként az oxidoreduktázok osztályába tartoznak, és különféle reakciókat képesek végrehajtani, például aromás gyűrű hidroxilációját (mono- vagy dihidroxiláció), dehidrogénezést és aromás gyűrű hasítását. Az ezekből a reakciókból származó termékek magasabb oxidációs állapotban vannak, és könnyebben metabolizálódnak a központi szén útvonalon keresztül (Phale et al., 2020). A lebontási útvonal enzimjeiről kimutatták, hogy indukálhatók. Ezen enzimek aktivitása nagyon alacsony vagy elhanyagolható, ha a sejteket egyszerű szénforrásokon, például glükózon vagy szerves savakon tenyésztik. A 3. táblázat összefoglalja a naftalin és származékainak anyagcseréjében részt vevő különböző enzimeket (oxigenázok, hidrolázok, dehidrogenázok, oxidázok stb.).
3. táblázat. A naftalin és származékainak lebontásáért felelős enzimek biokémiai jellemzői.
Radioizotópos vizsgálatok (18O2) kimutatták, hogy a molekuláris O2 aromás gyűrűkbe történő beépülése oxigenázok által a legfontosabb lépés egy vegyület további biodegradációjának aktiválásában (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Egy oxigénatom (O) beépülését a molekuláris oxigénből (O2) a szubsztrátba endogén vagy exogén monooxigenázok (más néven hidroxilázok) indítják el. Egy másik oxigénatom vízzé redukálódik. Az exogén monooxigenázok NADH-val vagy NADPH-val redukálják a flavint, míg az endomonooxigenázokban a flavint a szubsztrát redukálja. A hidroxiláció helyzete a termékképződés diverzitását eredményezi. Például a szalicilát-1-hidroxiláz a szalicilsavat a C1-es pozícióban hidroxilezi, katekol keletkezése közben. Másrészt a többkomponensű szalicilát-5-hidroxiláz (amely reduktáz, ferredoxin és oxigenáz alegységeket tartalmaz) a C5-ös pozícióban hidroxilezi a szalicilsavat, gentisavat képezve (Yamamoto et al., 1965).
A dioxigenázok két O2 atomot építenek be a szubsztrátba. A képződött termékektől függően gyűrűs hidroxiláló dioxigenázokra és gyűrűhasító dioxigenázokra oszthatók. A gyűrűs hidroxiláló dioxigenázok az aromás szubsztrátokat cisz-dihidrodiolokká (pl. naftalin) alakítják, és széles körben elterjedtek a baktériumok körében. A mai napig kimutatták, hogy a gyűrűs hidroxiláló dioxigenázokat tartalmazó organizmusok képesek különféle aromás szénforrásokon növekedni, és ezeket az enzimeket NDO-ként (naftalin), toluol-dioxigenázként (TDO, toluol) és bifenil-dioxigenázként (BPDO, bifenil) osztályozzák. Mind az NDO, mind a BPDO képes katalizálni különféle policiklusos aromás szénhidrogének (toluol, nitrotoluol, xilol, etilbenzol, naftalin, bifenil, fluorén, indol, metilnaftalin, naftalinszulfonát, fenantrén, antracén, acetofenon stb.) kettős oxidációját és oldallánc-hidroxilációját (Boyd és Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). Az NDO egy többkomponensű rendszer, amely egy oxidoreduktázból, egy ferredoxinból és egy aktív helyet tartalmazó oxigenáz komponensből áll (Gibson és Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Az NDO katalitikus egysége egy nagy α alegységből és egy kis β alegységből áll, amelyek α3β3 konfigurációban helyezkednek el. Az NDO az oxigenázok egy nagy családjába tartozik, és α-alegysége egy Rieske-helyet [2Fe-2S] és egy mononukleáris, nem hem vasat tartalmaz, amely meghatározza az NDO szubsztrátspecificitását (Parales et al., 1998). Jellemzően egy katalitikus ciklusban a piridin-nukleotid redukciójából származó két elektron egy reduktázon, egy ferredoxinon és egy Rieske-helyen keresztül átkerül az aktív helyen lévő Fe(II) ionra. A redukáló ekvivalensek aktiválják a molekuláris oxigént, ami a szubsztrát dihidroxilációjának előfeltétele (Ferraro et al., 2005). A mai napig csak néhány NDO-t tisztítottak és jellemeztek részletesen különböző törzsekből, és a naftalin lebontásában részt vevő útvonalak genetikai szabályozását is részletesen tanulmányozták (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). A gyűrűhasító dioxigenázok (endo- vagy orto-gyűrűhasító enzimek és exodiol- vagy meta-gyűrűhasító enzimek) hidroxilezett aromás vegyületekre hatnak. Például az orto-gyűrűhasító dioxigenáz a katekol-1,2-dioxigenáz, míg a meta-gyűrűhasító dioxigenáz a katekol-2,3-dioxigenáz (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). A különféle oxigenázok mellett számos dehidrogenáz is felelős az aromás dihidrodiolok, alkoholok és aldehidek dehidrogénezéséért, és NAD+/NADP+ elektron akceptorként való felhasználásáért, amelyek az anyagcserében részt vevő fontos enzimek közé tartoznak (Gibson és Subramanian, 1984; Shaw és Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Az olyan enzimek, mint a hidrolázok (észterázok, amidázok), a második fontos enzimosztályt alkotják, amelyek vizet használnak a kovalens kötések hasítására, és széles szubsztrátspecificitást mutatnak. A karbaril-hidrolázt és más hidrolázokat a Gram-negatív baktériumok periplazmájának (transzmembrán) komponenseinek tekintik (Kamini et al., 2018). A karbaril amid- és észterkötéssel is rendelkezik; ezért észteráz vagy amidáz hidrolizálhatja 1-naftol előállítására. A Rhizobium rhizobium AC10023 törzsben és az Arthrobacter RC100 törzsben található karbarilról kimutatták, hogy észterázként, illetve amidázként működik. Az Arthrobacter RC100 törzsben található karbaril szintén amidázként funkcionál. Kimutatták, hogy az RC100 négy N-metilkarbamát osztályú rovarirtó szert hidrolizál, például a karbarilt, a metomilt, a mefenaminsavat és az XMC-t (Hayaatsu et al., 2001). A Pseudomonas sp.-ben található CH-ról kimutatták, hogy... A C5pp képes hatni a karbarilra (100%-os aktivitás) és az 1-naftil-acetátra (36%-os aktivitás), de nem az 1-naftil-acetamidra, ami arra utal, hogy észteráz (Trivedi et al., 2016).
Biokémiai vizsgálatok, enzimszabályozási mintázatok és genetikai elemzések kimutatták, hogy a naftalin lebontását szabályozó gének két indukálható szabályozó egységből vagy „operonból” állnak: nah-ból (az „upstream útvonal”, amely a naftalint szalicilsavvá alakítja) és sal-ból (a „downstream útvonal”, amely a szalicilsavat katekol útján a központi szén útvonallá alakítja). A szalicilsav és analógjai induktorként működhetnek (Shamsuzzaman és Barnsley, 1974). Glükóz vagy szerves savak jelenlétében az operon represszálódik. Az 5. ábra a naftalin lebontásának teljes genetikai szerveződését mutatja (operon formájában). A nah gén számos elnevezett variánsát/formáját (ndo/pah/dox) leírták, és megállapították, hogy magas szekvenciahomológiát (90%) mutatnak az összes Pseudomonas faj között (Abbasian et al., 2016). A naftalin upstream útvonal génjei általában konszenzus sorrendben rendeződtek el, ahogy az az 5A. ábrán látható. Egy másik génről, a nahQ-ról is kimutatták, hogy részt vesz a naftalin anyagcseréjében, és általában a nahC és a nahE között helyezkedik el, de tényleges funkciója még tisztázásra vár. Hasonlóképpen, a naftalin-érzékeny kemotaxisért felelős nahY gént a nah operon disztális végén találták meg egyes tagokban. A Ralstonia fajban a glutation S-transzferázt (gsh) kódoló U2 gént a nahAa és a nahAb között találták, de nem befolyásolta a naftalin hasznosítási jellemzőit (Zylstra et al., 1997).
5. ábra. A naftalin lebontása során megfigyelt genetikai szerveződés és diverzitás a baktériumfajok között; (A) Felső naftalin útvonal, a naftalin szalicilsavvá történő metabolizmusa; (B) Alsó naftalin útvonal, szalicilsav katekolon keresztül a központi szén útvonalhoz; (C) szalicilsav gentisáton keresztül a központi szén útvonalhoz.
Az „alsó útvonal” (sal operon) jellemzően a nahGTHINLMOKJ-ből áll, és a katekol metaring hasítási útvonalon keresztül a szalicilátot piruváttá és acetaldehiddé alakítja. A nahG gén (amely a szalicilát-hidroxilázt kódolja) az operon proximális végén konzerváltnak bizonyult (5B. ábra). Más naftalint lebontó törzsekkel összehasonlítva a P. putida CSV86-ban a nah és a sal operonok tandem formában helyezkednek el és nagyon közeli rokonságban állnak egymással (kb. 7,5 kb). Néhány Gram-negatív baktériumban, például a Ralstonia sp. U2-ben, a Polaromonas naphthalenivorans CJ2-ben és a P. putida AK5-ben a naftalin központi szén metabolitként metabolizálódik a gentisát útvonalon keresztül (sgp/nag operon formájában). A génkazetta jellemzően nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI formában jelenik meg, ahol a nagR (amely egy LysR típusú szabályozót kódol) a felső végén található (5C. ábra).
A karbaril az 1-naftol, az 1,2-dihidroxi-naftalin, a szalicilsav és a gentizinsav metabolizmusán keresztül jut be a központi szénciklusba (3. ábra). Genetikai és metabolikus vizsgálatok alapján javasolták ennek az útvonalnak a felosztását „upstream” (karbaril átalakulása szalicilsavvá), „middle” (szalicilsav átalakulása gentizinsavvá) és „downstream” (gentizinsav átalakulása központi szén útvonal intermedierjeivé) (Singh et al., 2013). A C5pp (supercontig A, 76,3 kb) genomikai elemzése kimutatta, hogy az mcbACBDEF gén vesz részt a karbaril szalicilsavvá alakításában, ezt követi az mcbIJKL a szalicilsav gentizinsavvá alakításában, és az mcbOQP a gentizinsav központi szén intermedierjeivé (fumarát és piruvát, Trivedi et al., 2016) alakításában (6. ábra).
Jelentések szerint az aromás szénhidrogének (beleértve a naftalint és a szalicilsavat) lebontásában részt vevő enzimeket a megfelelő vegyületek indukálhatják, és egyszerű szénforrások, például glükóz vagy szerves savak gátolhatják (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). A naftalin és származékai különböző metabolikus útvonalai közül a naftalin és a karbaril szabályozási jellemzőit bizonyos mértékig vizsgálták. A naftalin esetében mind az upstream, mind a downstream útvonalak génjeit a NahR, egy LysR-típusú transz-ható pozitív szabályozó szabályozza. Ez szükséges a nah gén szalicilsav általi indukciójához és annak későbbi magas szintű expressziójához (Yen és Gunsalus, 1982). Továbbá, tanulmányok kimutatták, hogy az integratív host faktor (IHF) és a XylR (szigma 54-függő transzkripciós szabályozó) szintén kritikus fontosságú a naftalin anyagcseréjében részt vevő gének transzkripciós aktiválásához (Ramos et al., 1997). Tanulmányok kimutatták, hogy a katekol meta-gyűrű felnyílásának enzimjei, nevezetesen a katekol 2,3-dioxigenáz, naftalin és/vagy szalicilsav jelenlétében indukálódnak (Basu et al., 2006). Tanulmányok kimutatták, hogy a katekol orto-gyűrű felnyílásának enzimjei, nevezetesen a katekol 1,2-dioxigenáz, benzoesav és cisz,cisz-mukonát jelenlétében indukálódnak (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
A C5pp törzsben öt gén, az mcbG, mcbH, mcbN, mcbR és mcbS kódolja a karbaril lebontásáért felelős LysR/TetR transzkripciós szabályozók családjába tartozó szabályozókat. A homológ mcbG génről kiderült, hogy legközelebbi rokonságban áll a LysR-típusú PhnS szabályozóval (58%-os aminosav-azonosság), amely a Burkholderia RP00725 törzsben a fenantrén anyagcseréjében vesz részt (Trivedi et al., 2016). Az mcbH génről kiderült, hogy a köztes útvonalban (szalicilsav átalakulása gentizinsavvá) vesz részt, és a Pseudomonas és Burkholderia LysR-típusú NagR/DntR/NahR transzkripciós szabályozójához tartozik. E család tagjairól kimutatták, hogy a szalicilsavat a lebontási gének indukciójának specifikus effektor molekulájaként ismerik fel. Másrészt a downstream útvonalban (gentisát-központi szén útvonal metabolitjai) három gént, az mcbN-t, az mcbR-t és az mcbS-t azonosították, amelyek a LysR és TetR típusú transzkripciós szabályozókhoz tartoznak.
Prokariótákban a horizontális génátviteli folyamatok (szerzés, csere vagy transzfer) plazmidokon, transzpozonokon, profágokon, genomiális szigeteken és integratív konjugatív elemeken (ICE) keresztül a bakteriális genomok plaszticitásának fő okai, amelyek specifikus funkciók/tulajdonságok megszerzéséhez vagy elvesztéséhez vezetnek. Lehetővé teszi a baktériumok számára, hogy gyorsan alkalmazkodjanak a különböző környezeti feltételekhez, potenciális adaptív metabolikus előnyöket biztosítva a gazdaszervezet számára, például az aromás vegyületek lebontását. A metabolikus változásokat gyakran a lebontási operonok, azok szabályozási mechanizmusainak és enzimspecificitásának finomhangolásával érik el, ami elősegíti az aromás vegyületek szélesebb körének lebontását (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). A naftalin lebontásához szükséges génkazettákat számos mobil elemen, például plazmidokon (konjugatív és nem konjugatív), transzpozonokon, genomokon, ICE-ken és különböző baktériumfajok kombinációin találták (5. ábra). A Pseudomonas G7 törzsben az NAH7 plazmid nah és sal operonjai azonos orientációban íródnak át, és egy hibás transzpozon részét képezik, amelynek mobilizációjához a Tn4653 transzpozáz szükséges (Sota et al., 2006). A Pseudomonas NCIB9816-4 törzsben a gént a pDTG1 konjugatív plazmidon találták meg két operonként (körülbelül 15 kb távolságra egymástól), amelyek ellentétes irányokban íródtak át (Dennis és Zylstra, 2004). A Pseudomonas putida AK5 törzsben a nem konjugatív pAK5 plazmid kódolja a naftalin gentisát útvonalon keresztüli lebontásáért felelős enzimet (Izmalkova et al., 2013). A Pseudomonas PMD-1 törzsben a nah operon a kromoszómán, míg a sal operon a pMWD-1 konjugatív plazmidon található (Zuniga et al., 1981). A Pseudomonas stutzeri AN10 törzsben azonban az összes naftalin lebontásáért felelős gén (a nah és a sal operonok) a kromoszómán található, és feltehetően transzpozíciós, rekombinációs és átrendeződési események révén kötődnek (Bosch et al., 2000). A Pseudomonas sp. CSV86 törzsben a nah és a sal operonok ICE (ICECSV86) formájában helyezkednek el a genomban. A szerkezetet a tRNAGly védi, amelyet a rekombinációs/kapcsolódási helyeket jelző közvetlen ismétlődések (attR és attL) és a tRNAGly mindkét végén elhelyezkedő fágszerű integráz követ, így szerkezetileg hasonló az ICEclc elemhez (ICEclcB13 a Pseudomonas knackmusii-ben a klórkatekol lebontásáért). Jelentések szerint az ICE-n lévő gének rendkívül alacsony átviteli gyakorisággal (10-8) konjugációval vihetők át, ezáltal lebontási tulajdonságokat átvive a recipiensbe (Basu és Phale, 2008; Phale et al., 2019).
A karbaril lebontásáért felelős gének többsége plazmidokon található. Az Arthrobacter sp. RC100 három plazmidot tartalmaz (pRC1, pRC2 és pRC300), amelyek közül két konjugatív plazmid, a pRC1 és a pRC2, azokat az enzimeket kódolja, amelyek a karbarilt gentizáttá alakítják. Másrészt a gentizát központi szén metabolitokká történő átalakításában részt vevő enzimek a kromoszómán helyezkednek el (Hayaatsu et al., 1999). A Rhizobium nemzetség baktériumai. Az AC100 törzs, amelyet a karbaril 1-naftollá alakítására használnak, a pAC200 plazmidot tartalmazza, amely a CH-t kódoló cehA gént hordozza a Tnceh transzpozon részeként, inszerciós elemszerű szekvenciákkal (istA és istB) körülvéve (Hashimoto et al., 2002). A Sphingomonas CF06 törzsben a karbaril-lebontó gént feltehetően öt plazmidban találják meg: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 és pCF05. Ezen plazmidok DNS-homológiája magas, ami génduplikációs esemény létezésére utal (Feng et al., 1997). Két Pseudomonas fajból álló karbaril-lebontó szimbiontában az 50581 törzs egy pCD1 (50 kb) konjugatív plazmidot tartalmaz, amely az mcd karbaril-hidroláz gént kódolja, míg az 50552 törzs konjugatív plazmidja egy 1-naftol-lebontó enzimet kódol (Chapalamadugu és Chaudhry, 1991). Az Achromobacter WM111 törzsben az mcd furadan hidroláz gén egy 100 kb-os plazmidon (pPDL11) található. Kimutatták, hogy ez a gén különböző plazmidokon (100, 105, 115 vagy 124 kb) van jelen különböző földrajzi régiókból származó különböző baktériumokban (Parekh et al., 1995). A Pseudomonas sp. C5pp esetében a karbaril-lebontásért felelős összes gén egy 76,3 kb hosszúságú genomban található (Trivedi et al., 2016). A genomelemzés (6,15 Mb) 42 MGE és 36 GEI jelenlétét tárta fel, amelyek közül 17 MGE a szuperkontig A-ban (76,3 kb) helyezkedett el, átlagos aszimmetrikus G+C-tartalommal (54–60 mol%), ami lehetséges horizontális génátviteli eseményekre utal (Trivedi et al., 2016). A P. putida XWY-1 a karbaril-lebontó gének hasonló elrendeződését mutatja, de ezek a gének egy plazmidon találhatók (Zhu et al., 2019).
A biokémiai és genomiális szintű metabolikus hatékonyság mellett a mikroorganizmusok más tulajdonságokat vagy válaszokat is mutatnak, mint például a kemotaxis, a sejtfelszín módosítási tulajdonságai, a kompartmentalizáció, a preferenciális hasznosítás, a biosurfaktánsok termelése stb., amelyek segítik őket az aromás szennyező anyagok hatékonyabb metabolizálásában a szennyezett környezetben (7. ábra).
7. ábra. Az ideális aromás szénhidrogéneket lebontó baktériumok különböző sejtes válaszstratégiái az idegen szennyező vegyületek hatékony biodegradációjára.
A kemotaktikus válaszokat a heterogén módon szennyezett ökoszisztémákban a szerves szennyező anyagok lebomlását fokozó tényezőknek tekintik. (2002) kimutatták, hogy a Pseudomonas sp. G7 naftalinra adott kemotaxisa növelte a naftalin lebontásának sebességét a vízi rendszerekben. A vad típusú G7 törzs sokkal gyorsabban bontotta le a naftalint, mint egy kemotaxis-hiányos mutáns törzs. Megállapították, hogy a NahY fehérje (538 aminosav membrán topológiával) ko-transzkripciót mutat a metacleavage útvonal génjeivel az NAH7 plazmidon, és a kemotaxis-átvivőkhöz hasonlóan ez a fehérje is kemoreceptorként működik a naftalin lebontásában (Grimm és Harwood 1997). Hansel és munkatársai (2009) egy másik tanulmánya kimutatta, hogy a fehérje kemotaktikus, de a lebontási sebessége magas. (2011) kimutatták a Pseudomonas (P. putida) kemotaktikus válaszát gáznemű naftalinra, ahol a gázfázisú diffúzió a naftalin állandó áramlását eredményezte a sejtekhez, ami szabályozta a sejtek kemotaktikus válaszát. A kutatók ezt a kemotaktikus viselkedést kihasználva olyan mikrobákat hoztak létre, amelyek fokozzák a lebomlás sebességét. Tanulmányok kimutatták, hogy a kemoszenzoros útvonalak más sejtfunkciókat is szabályoznak, például a sejtosztódást, a sejtciklus szabályozását és a biofilmképződést, ezáltal segítve a lebomlás sebességének szabályozását. Azonban ennek a tulajdonságnak (kemotaxisnak) a hatékony lebontáshoz való kihasználását számos szűk keresztmetszet akadályozza. A fő akadályok a következők: (a) a különböző paralóg receptorok ugyanazokat a vegyületeket/ligandumokat ismerik fel; (b) alternatív receptorok létezése, azaz energetikai tropizmus; (c) jelentős szekvenciakülönbségek ugyanazon receptorcsalád érzékszervi doménjeiben; és (d) információk hiánya a fő bakteriális szenzorfehérjékről (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Az aromás szénhidrogének biodegradációja néha több metabolitot/intermediert termel, amelyek kemotaktikusak lehetnek az egyik baktériumcsoport számára, de taszítóak mások számára, ami tovább bonyolítja a folyamatot. A ligandumok (aromás szénhidrogének) és a kémiai receptorok kölcsönhatásainak azonosításához hibrid szenzorfehérjéket (PcaY, McfR és NahY) állítottunk elő a Pseudomonas putida és az Escherichia coli szenzor- és jelátviteli doménjeinek fúziójával, amelyek az aromás savak, a TCA intermedierek és a naftalin receptorait célozzák meg (Luu et al., 2019).
A naftalin és más policiklusos aromás szénhidrogének (PAH-ok) hatására a baktériummembrán szerkezete és a mikroorganizmusok integritása jelentős változásokon megy keresztül. Tanulmányok kimutatták, hogy a naftalin hidrofób kölcsönhatásokon keresztül zavarja az acillánc kölcsönhatását, ezáltal növeli a membrán duzzadását és fluiditását (Sikkema et al., 1995). Ennek a káros hatásnak az ellensúlyozására a baktériumok az izo/anteizo elágazó láncú zsírsavak arányának és zsírsavösszetételének megváltoztatásával, valamint a cisz-telítetlen zsírsavak megfelelő transz-izomerekre történő izomerizálásával szabályozzák a membrán fluiditását (Heipieper és de Bont, 1994). A naftalinkezelésen termesztett Pseudomonas stutzeriben a telített és telítetlen zsírsavak aránya 1,1-ről 2,1-re nőtt, míg a Pseudomonas JS150-ben ez az arány 7,5-ről 12,0-ra nőtt (Mrozik et al., 2004). Naftalinon tenyésztve az Achromobacter KAs 3–5 sejtek sejtaggregációt mutattak a naftalinkristályok körül, valamint a sejtfelszíni töltés csökkenését (-22,5 mV-ról -2,5 mV-ra), amit citoplazmatikus kondenzáció és vakuolizáció kísért, ami a sejtszerkezet és a sejtfelszíni tulajdonságok változásait jelzi (Mohapatra et al., 2019). Bár a sejtes/felszíni változások közvetlenül összefüggenek az aromás szennyező anyagok jobb felvételével, a vonatkozó biomérnöki stratégiákat még nem optimalizálták teljes mértékben. A sejtforma manipulálását ritkán alkalmazták a biológiai folyamatok optimalizálására (Volke és Nikel, 2018). A sejtosztódást befolyásoló gének deléciója változásokat okoz a sejtmorfológiában. A sejtosztódást befolyásoló gének deléciója változásokat okoz a sejtmorfológiában. A Bacillus subtilisben kimutatták, hogy a SepF sejtszeptumfehérje részt vesz a szeptumképződésben, és szükséges a sejtosztódás későbbi lépéseihez, de nem esszenciális gén. A Bacillus subtilis peptidglikán-hidrolázokat kódoló gének deléciója a sejtek megnyúlását, a specifikus növekedési sebesség növekedését és az enzimtermelési kapacitás javulását eredményezte (Cui et al., 2018).
A karbaril lebontási útvonal kompartmentalizációját javasolták a Pseudomonas C5pp és C7 törzsek hatékony lebontása érdekében (Kamini et al., 2018). Feltételezések szerint a karbaril a külső membrán szeptumon és/vagy diffúz porinokon keresztül jut a periplazmatikus térbe. A CH egy periplazmatikus enzim, amely katalizálja a karbaril hidrolízisét 1-naftollá, amely stabilabb, hidrofóbabb és toxikusabb. A CH a periplazmában lokalizálódik, és alacsony affinitással rendelkezik a karbaril iránt, így szabályozza az 1-naftol képződését, megakadályozva annak felhalmozódását a sejtekben és csökkentve a sejtekre gyakorolt ​​toxicitását (Kamini et al., 2018). A kapott 1-naftolt a belső membránon keresztül partícióval és/vagy diffúzióval a citoplazmába szállítják, majd a nagy affinitású 1NH enzim hidroxilezi 1,2-dihidroxi-naftalinná a további metabolizmushoz a központi szén útvonalon.
Bár a mikroorganizmusok genetikai és metabolikus képességekkel rendelkeznek a xenobiotikus szénforrások lebontására, hasznosításuk hierarchikus struktúrája (azaz az egyszerű szénforrások előnyben részesítése a komplex szénforrásokkal szemben) a biodegradáció egyik fő akadálya. Az egyszerű szénforrások jelenléte és hasznosítása csökkenti az összetett/nem előnyben részesített szénforrásokat, például a PAH-okat lebontó enzimeket kódoló géneket. Egy jól tanulmányozott példa erre, amikor a glükózt és a laktózt együttesen etetik az Escherichia colival, a glükóz hatékonyabban hasznosul, mint a laktóz (Jacob és Monod, 1965). A Pseudomonasról kimutatták, hogy számos PAH-ot és xenobiotikus vegyületet bont le szénforrásként. A Pseudomonas szénforrás-hasznosításának hierarchiája a következő: szerves savak > glükóz > aromás vegyületek (Hylemon és Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Van azonban egy kivétel. Érdekes módon a Pseudomonas sp. A CSV86 egyedi hierarchikus struktúrát mutat, amely előnyben részesíti az aromás szénhidrogéneket (benzoesav, naftalin stb.) a glükóz helyett, és az aromás szénhidrogéneket szerves savakkal együtt metabolizálja (Basu et al., 2006). Ebben a baktériumban az aromás szénhidrogének lebontásáért és transzportjáért felelős gének nem szabályozódnak le még egy második szénforrás, például glükóz vagy szerves savak jelenlétében sem. Glükóz és aromás szénhidrogének táptalajon tenyésztve azt figyelték meg, hogy a glükóz transzportjáért és metabolizmusáért felelős gének leszabályozódtak, az aromás szénhidrogének az első log fázisban, a glükóz pedig a második log fázisban hasznosultak (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Másrészt a szerves savak jelenléte nem befolyásolta az aromás szénhidrogén-anyagcsere expresszióját, így ez a baktérium várhatóan jelölt törzs lesz a biodegradációs vizsgálatokhoz (Phale et al., 2020).
Közismert, hogy a szénhidrogének biotranszformációja oxidatív stresszt és az antioxidáns enzimek felregulációját okozhatja a mikroorganizmusokban. A naftalin nem hatékony biodegradációja mind az állófázisú sejtekben, mind toxikus vegyületek jelenlétében reaktív oxigénfajták (ROS) képződéséhez vezet (Kang et al. 2006). Mivel a naftalint lebontó enzimek vas-kén klasztereket tartalmaznak, oxidatív stressz hatására a hem és a vas-kén fehérjékben lévő vas oxidálódik, ami a fehérjék inaktiválódásához vezet. A ferredoxin-NADP+ reduktáz (Fpr) a szuperoxid-diszmutázzal (SOD) együtt közvetíti a NADP+/NADPH és két ferredoxin vagy flavodoxin molekula közötti reverzibilis redox reakciót, ezáltal megköti a ROS-t és helyreállítja a vas-kén központot oxidatív stressz alatt (Li et al. 2006). Jelentések szerint mind az Fpr, mind a SodA (SOD) expresszióját a Pseudomonas baktériumokban oxidatív stressz indukálhatja, és négy Pseudomonas törzsben (O1, W1, As1 és G1) fokozott SOD és kataláz aktivitást figyeltek meg naftalin hozzáadása melletti növekedés során (Kang et al., 2006). Tanulmányok kimutatták, hogy antioxidánsok, például aszkorbinsav vagy vas(II)-ion (Fe2+) hozzáadása növelheti a naftalin növekedési ütemét. Amikor a Rhodococcus erythropolis naftalin táptalajban növekedett, az oxidatív stresszel kapcsolatos citokróm P450 gének, köztük a sodA (Fe/Mn szuperoxid-diszmutáz), a sodC (Cu/Zn szuperoxid-diszmutáz) és a recA transzkripciója megnőtt (Sazykin et al., 2019). A naftalinban tenyésztett Pseudomonas sejtek összehasonlító kvantitatív proteomikai elemzése kimutatta, hogy az oxidatív stresszválaszhoz kapcsolódó különböző fehérjék felregulációja a stresszkezelési stratégia része (Herbst et al., 2013).
Mikroorganizmusokról kimutatták, hogy hidrofób szénforrások hatására biosurfaktánsokat termelnek. Ezek a felületaktív anyagok amfifil felületaktív vegyületek, amelyek aggregátumokat képezhetnek az olaj-víz vagy a levegő-víz határfelületeken. Ez elősegíti a pszeudo-szolubilizációt és megkönnyíti az aromás szénhidrogének adszorpcióját, ami hatékony biodegradációt eredményez (Rahman et al., 2002). Ezen tulajdonságoknak köszönhetően a biosurfaktánsokat széles körben használják különböző iparágakban. A kémiai felületaktív anyagok vagy biosurfaktánsok hozzáadása a baktériumkultúrákhoz növelheti a szénhidrogének lebontásának hatékonyságát és sebességét. A biosurfaktánsok közül a Pseudomonas aeruginosa által termelt ramnolipideket széles körben tanulmányozták és jellemezték (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Ezenkívül más típusú biofelületaktív anyagok közé tartoznak a lipopeptidek (mucinok a Pseudomonas fluorescens-ből), az emulgeálószer 378 (a Pseudomonas fluorescens-ből) (Rosenberg és Ron, 1999), a trehalóz-diszacharid lipidek a Rhodococcus-ból (Ramdahl, 1985), a lichenin a Bacillusból (Saraswathy és Hallberg, 2002), valamint a felületaktív anyag a Bacillus subtilisből (Siegmund és Wagner, 1991) és a Bacillus amyloliquefaciensből (Zhi et al., 2017). Kimutatták, hogy ezek a hatékony felületaktív anyagok a felületi feszültséget 72 dyn/cm-ről 30 dyn/cm alá csökkentik, ami jobb szénhidrogén-abszorpciót tesz lehetővé. Jelentések szerint a Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia és más baktériumfajok különféle ramnolipid és glikolipid alapú biosurfaktánsokat képesek termelni, ha naftalin és metilnaftalin táptalajon tenyésztik őket (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). A Pseudomonas maltophilia CSV89 képes extracelluláris Biosur-Pm biosurfaktánst termelni, ha aromás vegyületeken, például naftoesavon tenyésztik őket (Phale et al., 1995). A Biosur-Pm képződésének kinetikája azt mutatta, hogy szintézise növekedés- és pH-függő folyamat. Megállapították, hogy a sejtek által semleges pH-n termelt Biosur-Pm mennyisége nagyobb volt, mint 8,5 pH-n. A 8,5 pH-n termesztett sejtek hidrofóbabbak voltak, és nagyobb affinitást mutattak az aromás és alifás vegyületek iránt, mint a 7,0 pH-n termesztett sejtek. A Rhodococcus spp. esetében... Az N6, a magasabb szén-nitrogén (C:N) arány és a vaskorlátozás optimális feltételek az extracelluláris biosurfaktánsok előállításához (Mutalik et al., 2008). Kísérletet tettek a biosurfaktánsok (surfactinok) bioszintézisének javítására a törzsek és a fermentáció optimalizálásával. A táptalajban lévő felületaktív anyag titere azonban alacsony (1,0 g/L), ami kihívást jelent a nagyméretű termelés szempontjából (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Ezért géntechnológiai módszereket alkalmaztak a bioszintézisének javítására. Mesterséges módosítása azonban nehézkes az operon nagy mérete (∼25 kb) és a quorum sensing rendszer komplex bioszintetikus szabályozása miatt (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Számos géntechnológiai módosítást hajtottak végre Bacillus baktériumokban, főként a surfactin termelés fokozása érdekében a promóter (srfA operon) cseréjével, a YerP surfactin exportfehérje, valamint a ComX és PhrC szabályozó faktorok túltermelésével (Jiao et al., 2017). Ezek a géntechnológiai módszerek azonban csak egy vagy néhány genetikai módosítást valósítottak meg, és még nem érték el a kereskedelmi forgalomba hozatalt. Ezért a tudásalapú optimalizálási módszerek további tanulmányozása szükséges.
A PAH biodegradációs vizsgálatokat főként standard laboratóriumi körülmények között végzik. Szennyezett helyszíneken vagy környezetben azonban számos abiotikus és biotikus tényező (hőmérséklet, pH, oxigén, tápanyagok elérhetősége, szubsztrát biohasznosulása, egyéb xenobiotikumok, végtermék-gátlás stb.) kimutathatóan megváltoztatja és befolyásolja a mikroorganizmusok lebontó képességét.
A hőmérséklet jelentős hatással van a PAH biodegradációjára. A hőmérséklet emelkedésével az oldott oxigén koncentrációja csökken, ami befolyásolja az aerob mikroorganizmusok anyagcseréjét, mivel molekuláris oxigénre van szükségük az oxigenázok egyik szubsztrátjaként, amelyek hidroxilezési vagy gyűrűhasadási reakciókat végeznek. Gyakran megjegyzik, hogy a magasabb hőmérséklet a kiindulási PAH-okat toxikusabb vegyületekké alakítja, ezáltal gátolja a biodegradációt (Muller et al., 1998).
Megfigyelték, hogy számos PAH-szennyezett helyszínen szélsőséges pH-értékek vannak, például a savas bányavízzel szennyezett területeken (pH 1–4) és a lúgos csurgalékvízzel szennyezett földgáz-/széngázosító helyszíneken (pH 8–12). Ezek a körülmények komolyan befolyásolhatják a biodegradációs folyamatot. Ezért a mikroorganizmusok bioremediációhoz való felhasználása előtt ajánlott a pH-értéket megfelelő (közepes vagy nagyon alacsony oxidációs-redukciós potenciállal rendelkező) vegyszerek, például ammónium-szulfát vagy ammónium-nitrát hozzáadásával lúgos talajok esetén, vagy kalcium-karbonáttal vagy magnézium-karbonáttal történő meszezéssel savas helyszínek esetén (Bowlen et al. 1995; Gupta és Sar 2020).
Az érintett terület oxigénellátása a PAH biodegradációjának sebességkorlátozó tényezője. A környezet redox viszonyai miatt az in situ bioremediációs folyamatok általában külső forrásokból (talajművelés, levegőbefúvás és vegyi anyagok hozzáadása) történő oxigénbevitelt igényelnek (Pardieck et al., 1992). Odenkranz és munkatársai (1996) kimutatták, hogy a magnézium-peroxid (egy oxigént felszabadító vegyület) hozzáadása egy szennyezett víztartó réteghez hatékonyan bioremediálhatja a BTEX vegyületeket. Egy másik tanulmány a fenol és a BTEX in situ lebomlását vizsgálta egy szennyezett víztartó rétegben nátrium-nitrát injektálásával és extrakciós kutak építésével a hatékony bioremediáció elérése érdekében (Bewley és Webb, 2001).