Jelenlegi†Jelenlegi cím: OX11 0DE, Egyesült Királyság, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Egyesült Királyság, Diamond Light Source Co., Ltd., Elektronikus Biológiai Képalkotó Központ.
A reakcióközpont fénygyűjtő komplexe 1 (RC-LH1) a bíbor fototróf baktériumok fotoszintetikus magkomponense. Bemutattuk a Rhodopseudomonas palustris RC-LH1 komplexének két krioelektronmikroszkópos szerkezetét. Az RC-LH114-W komplex 2,65 Å felbontású szerkezete 14 alegységből álló LH1 hurokból áll, amelyek körülveszik az RC-t, amelyet a W fehérje szakít meg, míg a W fehérje nélküli komplex teljes egészében RC összetételű, amelyet RC vesz körül. Zárt, 16 alegységből álló LH1 hurok. Ezen szerkezetek összehasonlítása betekintést nyújt a kinon dinamikájába az RC-LH1 komplexben, beleértve a korábban nem meghatározott konformációs változásokat, amikor a kinon az RC QB helyéhez kötődik, valamint a járulékos kinonkötőhelyek elhelyezkedését, amelyek elősegítik azok RC-hez való átadását. A W fehérje egyedi szerkezete megakadályozza az LH1 hurok záródását, ezáltal egy csatornát hoz létre a kinon/kinolon csere felgyorsításához.
A fotoszintézis által biztosított energia szinte az összes földi élet fenntartására alkalmas, és nagy potenciállal rendelkezik a napenergia biotechnológiája számára. A globális fotoszintézis elősegítése mellett a bíbor fototróf baktériumok különféle energiamódokat és anyagcsere-képességeket is mutatnak. Elkerülhetik a fotoszintézist, és heterotróf baktériumként növekedhetnek a sötétben, megköthetik a nitrogént és a szén-dioxidot, hidrogént termelhetnek, és lebonthatják az aromás vegyületeket (1-3). Ahhoz, hogy energiát biztosítsanak ezekhez a folyamatokhoz, a fényt gyorsan és hatékonyan kémiai energiává kell alakítani. Ez a folyamat akkor kezdődik, amikor a fényt csapdázó antenna komplex elnyeli a fényt, és a csapdába esett energiát a reakcióközpontba (RC) továbbítja, ezáltal megindítva a töltésszétválást (4-7). A bíbor fototróf baktériumok fotoszintézisének alapegységét a 2-es típusú RC alkotja, amelyet az 1-es típusú fénygyűjtő komplex (LH1) vesz körül, és ez alkotja az RC-LH1 magkomplexet. Az LH1-et görbült αβ heterodimerek tömbje alkotja, amelyek mindegyike két bakteriális klorofill (BChl) α molekulát és egy vagy két karotinoidot köt meg (8-12). A legegyszerűbb LH1 antenna 16 vagy 17 αβ heterodimerből áll, amelyek zárt hurokban veszik körül az RC-t (9-13), de más magkomplexekben a transzmembrán peptidek megszakítják a környező LH1 folytonosságát, ezáltal elősegítve a kinol/kinon diffúziót az RC és a citokróm bc1 komplex között (11, 13-15). A bíbor fototróf növény, a Rhodopseudomonas (Rps.) egy modellorganizmus, amely képes megérteni a fotoszintézist támogató energia- és elektronátvitelt. Az Rps első kristályszerkezete. A palustris RC-LH1 komplex modellje az RC, amelyet 15 heterodimer LH1 hurok vesz körül, amelyeket egy ismeretlen fehérje, a „Protein W” szakít meg (14). A Protein-W-t később RPA4402-ként azonosították, amely egy jellemzetlen 10,5 kDa-os fehérje három feltételezett transzmembrán hélixszel (TMH) (16). Javasoljuk az rpa4402 W fehérjét kódoló gén pufW-re való átnevezését, hogy összhangban legyen az RC-L, M (pufL, pufM) és LH1α, β (pufA, pufB) alegységeket kódoló gének nómenklatúrájával. Érdekes módon a W fehérje az RC-LH1-nek csak körülbelül 10%-ában van jelen, ami azt mutatja, hogy az Rps. palustris két különböző RC-LH1 komplexet termel. Jelen tanulmányban két magkomplex nagy felbontású krio-EM (cryo-EM) szerkezetét mutatjuk be, az egyikben W fehérje és 14 αβ heterodimer található, a másikban W fehérje nélkül, és egy zárt, 16 heterodimerből álló LH1 hurok található. Szerkezetünk lépésváltást jelent az Rps. palustris RC-LH1 komplexének megértésében, mivel elemeztük az egyes variánsok homogén populációját, és elegendő felbontással rendelkezünk ahhoz, hogy egyértelműen hozzárendeljük az egyes peptideket és a kötött pigmenteket, valamint a kapcsolódó lipideket és kinonokat. Ezen szerkezetek összehasonlítása azt mutatja, hogy a három TMH fehérje-W, amelyeket eddig egyetlen más RC-LH1 komplexben sem találtak meg, kinoncsatornát hoz létre a kinon/kinolon kicserélődés felgyorsítására. Számos konzervált lipid- és kinonkötőhelyet azonosítottunk, és egy új konformációs változást fedeztünk fel a kinon és az RC kombinációja után, amely alkalmas lehet az oxigénezett fototróf organizmusok fotoszisztéma II (PSII) RC-jéhez. Eredményeink új ismereteket nyújtanak a kinon/kinolon kötődés és kicserélődés kinetikájáról a bíbor fototróf baktériumok RC-LH1 magkomplexumában.
Az Rps. palustrisban található két komplex részletes tanulmányozásának megkönnyítése érdekében biokémiai módszerekkel izoláltuk az RC-LH1-et. A W-fehérjét tartalmazó komplexet (a továbbiakban ΔpufW) a pufW gént nem tartalmazó törzsből tisztítottuk (16), és csak egy RC-LH1 komplex állítható elő. A W-fehérjét tartalmazó komplexet egy törzs termeli. Ennek a törzsnek a W-fehérjét egy 10x His-jelöléssel módosítják a C-terminálisán, így a W-fehérjét tartalmazó komplex fém immobilizálásával hatékonyan kombinálható a legtöbb W-fehérjével. A komplexet hatékonyan elválasztjuk (16) affinitáskromatográfiával (IMAC).
Amint az 1. ábrán látható, mindkét komplex egy három alegységből álló RC-t (RC-L, RC-M és RC-H) tartalmaz, amelyet egy LH1 antenna vesz körül. A protein-W nélküli komplex 2,80-A szerkezete 16 αβ heterodimert mutat, amelyek egy zárt LH1 hurkot alkotnak, amely teljesen körülveszi az RC-t, a továbbiakban RC-LH116 komplexként hivatkozunk rá. A protein-W-t tartalmazó komplex 2,65Å szerkezete egy 14 heterodimerből álló LH1-et tartalmaz, amelyet protein-W szakít meg, a továbbiakban RC-LH114-W-ként hivatkozunk rá.
(A és B) A vegyület felszíni ábrázolása. (C és D) Kötött pigmentek rudakkal kifejezve. (E és F) A citoplazmatikus felszínről megfigyelt komplexekben a peptidek és az LH1 alegységek karikatúrákban vannak ábrázolva, és az óramutató járásával megegyezően vannak számozva a fehérje-W réstől kiindulva [összhangban az Rba számozással. sphaeroides komplex (13)]. Az LH1-α esetében a fehérje alegység színe sárga; az LH1-β esetében a fehérje alegység színe kék; a fehérje-W esetében a fehérje piros; az RC-H esetében cián; az RC-L esetében narancssárga; az RC-M esetében bíbor. A kofaktorokat rudak jelölik, a zöld a BChl és BPh a molekulákat, a lila a karotinoidokat, a sárga pedig az UQ10 molekulákat jelöli. (G és H) A fehérje-W rés nagyított nézete az RC-LH114-W komplex (G) és az RC-LH116 komplex (H) ekvivalens régiójában. A kofaktorok térkitöltés formájában jelennek meg, a kelátkötésű kinon kék színnel látható. A (G) ábrán a fehérje-W rést kék szaggatott vonal jelöli, a (H) ábrán pedig fekete szaggatott vonal jelöli azokat a kis lyukakat, ahol a kinon/kinolol diffundál az LH116 gyűrűn.
Az 1. ábra (A és B) az RC-t mutatja, amelyet LH1αβ heterodimerek nyitott vagy zárt tömbjei vesznek körül, amelyek mindegyike két BChl-t és egy karotinoidot köt (1. ábra, C és D). Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az Rps az LH1 komplex. A spirulina xantin bioszintézis útvonalában ezek a fajok vegyes karotinoid populációkat tartalmaznak (17). Azonban a spiropirroxantin a domináns karotinoid, és sűrűsége kielégítő. Ezért úgy döntöttünk, hogy a spiroxantint az összes LH1 kötőhelyen modellezzük. Az alfa- és béta-polipeptidek egyetlen TMH-k rövid membrán külső régiókkal (1. ábra, A, B, E és F). Bár a C-terminálison 17 aminosav sűrűségét nem figyeltük meg, az alfa-polipeptid mindkét komplexben Met1-ről Ala46-ra hasadt. A β-polipeptid Gly4-ről Tyr52-re redukálódott az RC-LH116-ban, és Ser5-ről Tyr52-re az RC-LH114-W-ben. Nem figyeltek meg 3 vagy 4 N-terminális vagy 13 C-terminális aminosav sűrűséget (S1. ábra). A vad típusú törzsből előállított vegyes RC-LH1 komplex tömegspektrometriás elemzése azt mutatta, hogy a hiányzó régió ezen peptidek heterológ hasításának eredménye (S1. és S2. ábra). Az α-Met1 N-terminális formilációját is megfigyelték (f). Az elemzés kimutatta, hogy az α-peptid az fMet1-től Asp42-ig/Ala46/Ala47/Ala50-ig terjedő aminosavmaradékokból, a β-peptid pedig a Ser2-től Ala53-ig terjedő aminosavmaradékokból áll, ami jó egyezést mutat az alacsony hőmérsékletű EM sűrűségtérképével.
Az α-His29 és β-His36 koordinációja miatt a BChl-ek szemtől szemben helyezkednek el; mindegyik αβ heterodimer a szomszédaival összeáll, és egy nyílt hurkot (RC-LH114-W) vagy egy zárt hurkot (RC-LH116) alkot az RC körül. Az excitoncsatolt pigmentmátrix (1. ábra, C és D). Az RC-LH114-W 877 nm-es sávjához képest az RC-LH116 880 nm-es abszorpciós vöröseltolódása 3 nm (2A. ábra). A cirkuláris dikroizmus spektrum azonban majdnem megegyezik (2B. ábra), ami azt jelzi, hogy bár egyértelmű különbség van a nyílt és a zárt hurkok között, a BChl-ek lokális környezete nagyon hasonló. Az abszorpciós vöröseltolódás a zárt hurok csökkent hőmozgásának és a megnövekedett stabilitásnak (18, 19), a zárt hurok által okozott pigmentcsatolás változásának (20, 21) vagy e két hatás kombinációjának eredménye lehet (11).
(A) Ultraibolya/látható/közeli infravörös abszorpciós spektrum, melynek csúcsait a megfelelő pigmentekkel jelöltük és a 775 nm-es BPh csúcsra normalizáltuk. (B) Cirkuláris dikroizmus spektrum, 805 nm-en a BChl abszorbanciára normalizálva. (C és D) Az RC-LH114-W komplex (C) és az RC-LH116 komplex (D) időfelbontásos abszorpciós spektrumából kiválasztott ΔA spektrumok. A jobb összehasonlíthatóság érdekében minden spektrumot a −A ∆A-jára normalizáltunk 0,2 ps-nál. (E) A citokróm c2 oxidációjának sebessége besugárzás után különböző UQ2 koncentrációk jelenlétében (a nyers adatokat lásd az S8. ábrán). (F) Alacsony, közepes vagy nagy intenzitású fényben (10, 30 vagy 300 μMm-2 s-1) tenyésztett sejtekben a tisztított komplex W és RC-L alegységei és az elválasztott membrán arány. A fehérjeszintet SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel és immunvizsgálattal határoztuk meg (a nyers adatokat lásd az S9. ábrán). Határozza meg az arányt a tisztított RC-LH114-W komplexhez viszonyítva. A komplex RC-L és protein-W sztöchiometrikus aránya 1:1.
Az RC-LH114-W deformált αβ14 hurokjában az 1-es pozícióban lévő BChl-ek (1. ábra, A, C és E) 6,8Å-rel közelebb vannak az RC primer donorhoz (P), mint az RC-LH116-ban lévő ekvivalens BChl-ek (1. ábra, B, D és F, valamint S3. ábra); azonban a két komplex tranziens abszorpciós kinetikája azt mutatja, hogy az RC-LH114-W és az RC-LH116 esetében a gerjesztési energiaátviteli időállandók az LH1-ről az RC-re 40 ±4 és 44 ±3 ps (2. ábra). , C és D, S4. ábra és S2. táblázat). Az RC-n belüli elektronikus átvitelben sincs szignifikáns különbség (S5. ábra és a kapcsolódó kiegészítő szöveg). Gyanítjuk, hogy az LH1 és az RC-P közötti energiaátviteli idő szoros megfelelése a két LH1 hurokban lévő legtöbb BChl hasonló távolságának, szögének és potenciális energiájának köszönhető. Úgy tűnik, hogy az LH1 energiamintázatának a minimális távolság eléréséhez történő feltárása nem gyorsabb, mint a közvetlen energiaátadás a szuboptimális helyekről az RC-re. Az RC-LH114-W nyílt hurkú LH1 hurokja alacsony hőmérsékleti körülmények között a szerkezeti elemzés szempontjából jelentéktelen hőmozgáson is áteshet, és szobahőmérsékleten hosszabb αβ14 gyűrűkonformáció van a βBChls pigmentációs távolságától az RC 1 pozíciójában.
Az RC-LH116 komplex 32 BChl-t és 16 karotinoidot tartalmaz, és teljes elrendeződése megegyezik a Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), a Thiorhodovibrio (Trv.) 970 törzs (PDB ID 7C9R) (12) és a zöld algák (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) esetében kapottakkal. Az illesztés után az αβ heterodimerek pozícióiban csak kis eltéréseket figyeltek meg, különösen az 1-5, 15 és 16 esetében (S6. ábra). A protein-W jelenléte jelentős hatással van az LH1 szerkezetére. Három TMH-ja rövid hurkokkal kapcsolódik össze, az N-terminális a komplex lumen oldalán, a C-terminális pedig a citoplazmatikus oldalon található (1A. és 3. ábra, A-D). A Protein-W nagyrészt hidrofób (3B. ábra), és a TMH2 és a TMH3 kölcsönhatásba lép az LH1αβ-14-gyel, transzmembrán felületet képezve (3. ábra, B és E-G). A határfelületet főként Phe, Leu és Val aminosavak alkotják a transzmembrán régióban. Ezek a aminosavak hidrofób aminosavakkal és αβ-14 pigmentekkel vannak egymásra rakva. Néhány poláris aminosav is hozzájárul a kölcsönhatáshoz, beleértve a W-Thr68 és a β-Trp42 közötti hidrogénkötést a komplex üreg felszínén (3. ábra, F és G). A citoplazma felszínén a Gln34 az αβ-14 karotinoidok ketocsoportja mellett helyezkedik el. Ezenkívül az n-dodecil-β-d-maltozid (β-DDM) molekula feloldódott, és hidrofób farkát kiterjesztették a protein-W és az αβ-14 közötti határfelületre, és a lipid farok a testben helyezkedhet el. Azt is megfigyeltük, hogy a W protein és az RCH C-terminális rezolválási régiói nagyon közel vannak egymáshoz, de nem annyira, hogy specifikus kölcsönhatások alakuljanak ki (1. ábra, A és E). Azonban előfordulhatnak kölcsönhatások e két fehérje fel nem oldott C-terminális aminosavaiban, amelyek mechanizmust biztosíthatnak a W protein toborzásához az RC-LH114-W komplex összeszerelése során.
(A) A W fehérje, amely rajzfilmfigurán az LH1αβ14 határfelületén néz szembe, pálcika alakú oldallánccal (piros) rendelkezik, amely az elektrosztatikus potenciáldiagram egy részén látható (átlátszó szürke felület, 0,13 kontúrszinttel). (B) A W fehérjét hidrofób színes felülettel ábrázoltuk. A poláris és töltéssel rendelkező területek ciánkékkel, a hidrofób területek fehérrel, az erősen hidrofób területek pedig narancssárgával vannak ábrázolva. (C és D) A W fehérje rajzfilmfigurán ábrázolva, orientációja megegyezik az (A) (C) ábrán láthatóval, és 180°-kal elforgatva (D). A szekvenciában elfoglalt pozíciójuktól függően a megkülönböztethető aminosavak szivárványszíneket vesznek fel, ahol az N-terminális kék, a C-terminális pedig piros. (E) A W fehérje ugyanabban a nézetben, mint az (A) ábrán, és a W fehérje:LH1 határfelületén lévő aminosavakat rudak jelölik, amelyekhez jelöléseket csatoltak. (F) A W fehérje 90°-kal el van forgatva az (E) és az LH1αβ14 ábrához képest a rajzfilmfigurán, valamint a határfelületi aminosavakhoz képest az oszlopdiagramon. A béta-polipeptid túlnyúló aminosavait jelöltük. A kofaktort az 1. ábrával megegyező színű oszlopként, a lebomlott β-DDM-et szürke, az oxigént pedig piros szín mutatja. (G) Az (F) ábrán látható nézet 180°-kal elforgatott, a jelölt alfa-polipeptid kiemelkedő aminosavaival.
A Protein-W egy αβ heterodimert (a 15. az 1F ábrán) helyettesít, ezáltal megakadályozza a hurok bezáródását és az első három αβ heterodimer megdőlését. Megfigyelték, hogy az első αβ-1 heterodimer maximális dőlésszöge a film normálisához képest 25° és 29° között volt (1. ábra, A és E), amelyet az αβ-1 2° és 8° közötti dőlésszöge alakított ki az RC A éles kontraszt-LH116-ban (1. ábra, B és F). A második és a harmadik heterodimer 12° és 22°, illetve 5° és 10° közötti szögben dől. Az RC sztérikus gátlása miatt az αβ-1 dőlése nem tartalmazza a második αβ párt (amely az 1F ábrán a 16. αβ-nak felel meg), így egy tiszta rést képez az LH1 gyűrűben (1. ábra, A és E). Két αβ heterodimer hiánya, valamint négy BChl és két karotinoid elvesztése miatt egyik karotinoid sem kötődik a csavart αβ-1 alegységhez, így egy LH114-W gyűrű jön létre, amely 13 karotinoidot (vegetáriánus) és 28 BChl-t tartalmaz. Az αβ1-7 régiókban található két komplex lokális felbontási becslései alacsonyabbak, mint az LH1 hurok többi részének értékei, ami tükrözheti az RC QB helyhez szomszédos LH1 alegység inherens plaszticitását (4. ábra).
Az RC-LH114-W (A és B) és az RC-LH116 (C és D) képei ugyanabból a felülnézetből/oldalnézetből (A és B) (A és C) és üregfelületből (B és D) láthatók, mint az 1. ábrán. A színes gombok a jobb oldalon láthatók.
Az egyetlen másik jellemző, 1:14 sztöchiometrikus arányú magkomplex a Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). A W protein és a PufX között azonban nincs nyilvánvaló homológia, és jelentős hatással vannak a megfelelő LH1 szerkezetükre. A PufX egyetlen TMH egy N-terminális citoplazmatikus doménnel, amely az RC-H alegység citoplazmatikus oldalával lép kölcsönhatásba (13) az Rps. palustris LH116αβ-16-nak megfelelő pozícióban. A PufX egy csatornát hoz létre a kinon/kinolon cseréhez az RC-LH1 és a citokróm bcl komplex között, és jelen van az összes Rba. sphaeroides magkomplexben (13). Bár a monomer-monomer határfelület az Rba-ban található, a sphaeroides RC-LH1-PufX dimer a W protein kötőhelyén található az RC-LH114-W-ben, és a PufX és a W protein által indukált rés ezzel ekvivalens pozícióban van (S7A. ábra). Az RC-LH114-W rés összhangban van a Pseudomonas rosea LH1 hipotetikus kinoncsatornájával (8), amelyet a W fehérjéhez vagy a PufX-hez nem kapcsolódó peptidek alkotnak (S7B. ábra). Ezenkívül a Blc kinoncsatornája is hasonló pozícióban található. A smaragdzöld LH1, amely egy γ alegység kizárásával képződik (7), hasonló helyen található (S7C. ábra). Bár különböző fehérjék közvetítik, ezen kinon/kinolol csatornák megjelenése egy közös pozícióban az RC-LH1 komplexben a konvergens evolúció példájának tűnik, ami arra utal, hogy a W fehérje által létrehozott rés kinoncsatornaként működhet.
Az LH114-W hurokban lévő rés lehetővé teszi egy folytonos membránrégió kialakulását az RC-LH114-W komplex belső tere és a membrán között (1G. ábra), ahelyett, hogy a két domént egy fehérjepórus kötné össze, mint a fehérjékben. Az RC-LH116 komplex hasonló egy zárt Tch. tűszerű komplexhez (22) (1H. ábra). Mivel a kinon diffúziója a membránon keresztül gyorsabb, mint a keskeny fehérjecsatornán keresztüli diffúzió, a nyitott LH114-W hurok gyorsabb RC-forgalmat tesz lehetővé, mint a zárt LH116 hurok, és a kinon diffúziója az RC-be korlátozottabb lehet. Annak tesztelésére, hogy a W fehérje befolyásolja-e a kinonok RC-n keresztüli átalakulását, citokróm-oxidációs vizsgálatot végeztünk bizonyos koncentrációjú ubikinon 2-n (UQ2) (a természetes UQ10 analógja rövidebb izoprén farokkal) (2E. ábra). Bár a kelátkötésű kinon jelenléte akadályozza a látszólagos Michaelis-állandó pontos meghatározását (az RC-LH114-W és az RC-LH116 0,2±0,1μM, illetve 0,5±0,2μM értékekre alkalmas), az RC-LH114-W maximális sebessége (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) 28±5%-kal nagyobb, mint az RC-LH116-é (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Kezdetben úgy becsültük, hogy a protein-W a magkomplex körülbelül 10%-ában van jelen (16); itt az alacsony, közepes és magas fényviszonyok melletti növekedési sejtek betöltöttségi aránya rendre 15±0,6%, 11±1% és 0,9±0,5% (2F. ábra). A tömegspektrometria kvantitatív összehasonlítása azt mutatta, hogy a hisztidin-címke hozzáadása nem csökkentette a protein-W relatív mennyiségét a vad típusú törzsekhez képest (P = 0,59), tehát ezek a szintek nem a módosított protein-W műtermékei (S10. ábra). A protein-W alacsony betöltöttsége az RC-LH1 komplexben azonban lehetővé teheti egyes RC-k gyorsított ütemű átfordulását, ezáltal mérsékelve a lassabb kinon/kinolon cserét az RC-LH116 komplexben. Észrevettük, hogy a magas fényviszonyok melletti betöltöttségi arány nincs összhangban a legújabb transzkriptomikai adatokkal, amelyek azt jelzik, hogy a pufW gén expressziója erős fény hatására fokozódik (S11. ábra) (23). A pufW transzkripció és a protein-W RC-LH1 komplexbe történő beépülése közötti különbség zavaró, és tükrözheti a fehérje komplex szabályozását.
Az RC-LH114-W struktúrában 6 kardiolipin (CDL), 7 foszfatidilkolin (POPC), 1 foszfatidilglicerin (POPG) és 29 β-DDM molekula található és modellezhető: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG és 12 βDDM. Az RC-LH116 komplexben (5. ábra, A és B) található (5. ábra). Ebben a két struktúrában a CDL szinte a komplex citoplazmatikus oldalán helyezkedik el, míg a POPC, a POPG és a β-DDM többnyire a luminális oldalon helyezkednek el. Két lipid- és detergensmolekulát izoláltak az RC-LH114-W komplex αβ-1-αβ-6 régiójában (5. ábra, A), ötöt pedig az RC-LH116 ekvivalens régiójában (5. ábra, B). További lipideket találtak a komplex másik oldalán, főként CDL-t, amelyek az RC és az αβ-7-αβ-13 között halmozódtak fel (5. ábra, A és B). Más szerkezetileg felbontott lipidek és detergensek az LH1 gyűrűn kívül helyezkednek el, és jól felbontott acilláncok húzódnak az LH1 alegységek között, amelyeket az RC-LH114-W-ben β-DDM-nek, az RC-A β-DDM és POPC-LH116 keverékében pedig β-DDM-nek nevezünk. A kelátképző lipidek és detergensek hasonló pozíciói a szerkezetünkben arra utalnak, hogy fiziológiailag releváns kötőhelyek (S12A. ábra). Az ekvivalens molekulák pozíciói a Tch-ban is jó konzisztenciát mutatnak. A Gentle és a Trv. 970-es törzs RC-LH1-ei (S12. ábra, B-től E-ig) (9, 12) és a lipid fejcsoport hidrogénkötési maradékai meglehetősen jó konzerváltságot mutattak a szekvenciaillesztésben (S13. ábra), ami azt jelzi, hogy az RC-hez kötődő konzervált CDL (24) miatt ezek a helyek konzerválódhatnak az RC-LH1 komplexben.
(A és B) Az RC-LH114-W (A) és RC-LH116 (B) peptideket rajzfilmek, a pigmenteket pedig rudak ábrázolják, az 1. ábrán látható színséma szerint. A lipidek pirossal, a detergensek pedig szürkével vannak jelölve. Az RC QA és QB helyekhez kötött UQ sárga, míg az izolált UQ kék. (C és D) Ugyanazok a nézetek, mint az (A) és (B) esetében, lipidek nélkül. (E-től G-ig) Az RC-LH116 Q1(E), Q2(F) és Q3(G) peptidjeinek nagyított nézete, az egymást befolyásoló oldalláncokkal. A hidrogénkötéseket fekete szaggatott vonalak jelölik.
Az RC-LH116-ban mind az RC QA, mind a QB UQ, amelyek részt vesznek az elektronátvitelben a töltésszétválasztási folyamatban, a kötőhelyeiken bomlanak le. Az RC-LH114-W-ben azonban a QB kinont nem sikerült felbontani, ezért az alábbiakban részletesen tárgyaljuk. A QA és QB kinonok mellett két kelátkötésű UQ molekula (az RC és LH1 gyűrűk között helyezkednek el) is elosztva az RC-LH114-W szerkezetében a jól felbontott fejcsoportjaik szerint (Q1 és Q2 térben helyezkednek el). 5C. ábra). Két izoprén egység van hozzárendelve a Q1-hez, és a sűrűségtérkép a Q2 teljes 10 izoprén farkát felbontja. Az RC-LH116 szerkezetében három kelátkötésű UQ10 molekula (Q1-től Q3-ig, 5D. ábra) lett felbontva, és minden molekula egyértelmű sűrűséggel rendelkezik a fark mentén (5. ábra, D-től G-ig). A két szerkezetben a Q1 és Q2 kinon fejcsoportjainak pozíciói kiváló konzisztenciát mutatnak (S12F. ábra), és csak az RC-vel lépnek kölcsönhatásba. A Q1 az RC-LH114-W W résének bejáratánál található (1G. és 5. ábra, C, D és E), a Q2 pedig a QB kötőhely közelében (5. ábra, C, D és F). A konzervált L-Trp143 és L-Trp269 aminosavak nagyon közel vannak a Q1-hez és Q2-höz, és potenciális π-halmozási kölcsönhatásokat biztosítanak (5. ábra, E és F, valamint S12. ábra). Az L-Gln88, 3,0 Å távolságra a Q1 disztális oxigénatomjától, erős hidrogénkötést biztosít (5E. ábra); ez a aminosav az összes RC-ben konzervált, kivéve a legtávolabbi kapcsolatot (S13. ábra). Az L-Ser91 a legtöbb más RC-ben konzervatív módon helyettesíti a Thr-t (S13. ábra), 3,8 Angström távolságra van a Q1 metil-oxigénjétől, és gyenge hidrogénkötéseket képezhet (5E. ábra). A Q3-nak nincs specifikus kölcsönhatása, de a hidrofób régióban található az RC-M alegység és az LH1-α 5-6. alegységek között (5. ábra, D és G). A Q1, Q2 és Q3, illetve a közeli kelátképző kinonokat a Tch. Gentle, a Trv. 970-es törzs és a Blc törzsekben is felbontották. Az írisz szerkezet (9, 10, 12) egy konzervált járulékos kinonkötőhelyre utal az RC-LH1 komplexben (S12G. ábra). Az RC-LH116-ban lebomlott öt UQ jó egyezést mutat az egyes komplexek nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) meghatározott 5,8±0,7 értékével, míg az RC-LH114-W-ben lebomlott három UQ alacsonyabb, mint a <0,05. A mért 6,2±0,3 érték (S14. ábra) arra utal, hogy a szerkezetben fel nem oldott UQ molekulák vannak.
A pszeudoszimmetrikus L és M polipeptidek mindegyike öt TMH-t tartalmaz, és egy heterodimert alkot, amely egy BChl dimert, két BChl monomert, két bakteriofág (BPh) monomert, egy nem hem vasat és egy vagy két UQ10 molekulát kombinál. A terminális ketoncsoporton lévő hidrogénkötések jelenléte és az Rps-ben ismert felhalmozódása révén a karotinoidok beépülnek az M-alegységbe, amelyet cisz-3,4-dehidroorhodopinnak neveznek el. Species (25). Az RC-H külső membrán doménje egyetlen TMH-val rögzül a membránhoz. Az RC teljes szerkezete hasonló a rokon fajok (például az Rba) három alegységből álló RC-jéhez. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). A BChl és BPh makrociklusai, a karotinoid gerinc és a nem hem vas átfedik egymást ezen struktúrák felbontási tartományán belül, akárcsak az UQ10 fejcsoport a QA helyen és a QB kinon az RC-LH116-nál (S15. ábra).
A két különböző QB hely betöltési arányú RC-struktúra elérhetősége új lehetőséget kínál a QB kinon kötődését kísérő konzisztens konformációs változások vizsgálatára. Az RC-LH116 komplexben a QB kinon a teljesen kötött „proximális” helyzetben található (26), de az RC-LH114-W szétválása nem tartalmaz QB kinont. Az RC-LH114-W-ben nincs QB kinon, ami meglepő, mivel a komplex aktívabb, jobban, mint a szerkezetileg felbontott QB kinont tartalmazó RC-LH116 komplex. Bár a két LH1 gyűrű hat kinonnal kelátot képez, öt szerkezetileg felbontott a zárt RC-LH116 gyűrűben, míg csak három szerkezetileg korlátozott a nyitott RC-LH114-W gyűrűben. Ez a fokozott szerkezeti rendezetlenség tükrözheti az RC-LH114-W QB helyeinek gyorsabb cseréjét, a komplex gyorsabb kinonkinetikáját és az LH1 hurkon való átjutás megnövekedett valószínűségét. Azt feltételezzük, hogy az RC-LH114-W RC QB helyén az UQ hiánya egy összetettebb és aktívabb komplex eredménye lehet, és az RC-LH114-W QB helyén az UQ átalakulása azonnal lefagyott. Ez a specifikus szakasz (a QB hely bejáratának bezárása) ennek az aktivitásnak a konformációját tükrözi.
QB nélkül az L-Phe217 ezzel együtt járó elfordulása egy olyan pozícióba történik, amely nem kompatibilis az UQ10 kötődéssel, mivel térbeli ütközést okoz a farok első izoprén egységgel (6A. ábra). Ezenkívül a nyilvánvaló fő konformációs változások is szembetűnőek, különösen a hélix de (rövid hélix a TMH D és E közötti hurokban), ahol az L-Phe217 a QB kötőhely felé tolódik el, valamint az L-Tyr223 elfordulása (6A. ábra), amely megszakítja a hidrogénkötést az M-Asp45 vázzal és bezárja a QB kötőhely bejáratát (6B. ábra). A hélix de az aljánál elfordul, az L-Ser209 Cα-ja 0,33Å-rel eltolódik, míg az L-Val221Cα 3,52Å-rel eltolódik. A TMH D és E esetében nincsenek megfigyelhető változások, amelyek mindkét struktúrában egymásra épülnek (6A. ábra). Tudomásunk szerint ez az első olyan szerkezet a természetes RC-ben, amely lezárja a QB helyet. Az összehasonlítás a teljes (QB-hez kötött) szerkezettel azt mutatja, hogy mielőtt a kinon redukálódna, konformációs változásra van szükség ahhoz, hogy belépjen a kinonba. Az L-Phe217 elfordul, és π-halmozási kölcsönhatást képez a kinon fejcsoportjával, a hélix pedig kifelé tolódik, lehetővé téve, hogy az L-Gly222 váza és az L-Tyr223 oldallánca stabil hidrogénkötés-szerkezettel rendelkező hidrogénkötés-hálózatot képezzen (6. ábra, A és C).
(A) Átfedő hologram (L lánc, narancssárga/M lánc, bíborvörös) és apo (szürke) szerkezet rajzfilm, amelyben a kulcs aminosavak rúdszerű ábrázolásban jelennek meg. Az UQ10-et egy sárga sáv jelöli. A szaggatott vonal a teljes szerkezetben kialakult hidrogénkötéseket jelzi. (B és C) Az apolipoprotein és a teljes gyűrűs szerkezet felszíni ábrázolása, kiemelve az L-Phe217 oldallánc oxigénjét kékkel és az L-Tyr223-at pirossal. Az L alegység narancssárga; az M és H alegységek nincsenek színezve. (D és E) Apolipoprotein (D) és a teljes (E) RC QB helyek [színezés az (A) szerint] és Thermophilus thermophilus PSII (zöld, kék plasztikus kinonnal; PDB ID: 3WU2) Igazítás (58).
Meglepő módon, bár számos QB-hiányos, LH1 nélküli RC-szerkezet áll rendelkezésre, az ebben a vizsgálatban megfigyelt konformációs változásokat korábban nem ismertették. Ezek közé tartozik a Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), a Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) és az Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) QB-kimerülési szerkezete, amelyek mindegyike szinte megegyezik a teljes QB szerkezetükkel. A 3PRC alaposabb vizsgálata kimutatta, hogy az LDAO (Lauril-dimetil-amin-oxid) detergens molekulák a QB pozíció bejáratánál kötődnek, ami megakadályozhatja a zárt konformációba való átrendeződést. Bár az LDAO nem ugyanabban a pozícióban bomlik le az 1EYS-ben vagy az 1OGV-ben, ezek az RC-k ugyanazzal a detergenssel készülnek, és ezért ugyanazt a hatást válthatják ki. A citokróm c2-vel kokristályosodott Rba. Sphaeroides RC (PDB ID: 1L9B) kristályszerkezete szintén zárt QB hellyel rendelkezik. Ebben az esetben azonban az RC-M polipeptid N-terminális régiója (amely a QB kötőhellyel a Q hélix Tyr aminosavának H-kötésén keresztül kölcsönhatásba lép) természetellenes konformációt vesz fel, és a QB konformációs változását a továbbiakban nem vizsgáljuk (30). Megnyugtató, hogy az RC-LH114-W struktúrában nem tapasztaltunk ilyen jellegű deformációt az M polipeptid esetében, amely szinte megegyezik az RC-LH116 RC N-terminális régiójával. Azt is meg kell jegyezni, hogy a detergens alapú LH1 antenna eltüntetése után a PDB-ben lévő apolipoprotein RC-k feloldódtak, ami megszüntette a belső kinonkészleteket és lipideket az RC és a környező LH1 gyűrű belső felülete közötti résben (31, 32). Az RC funkcionális marad, mivel megtartja az összes kofaktort, kivéve a lebontható QB kinont, amely kevésbé stabil, és gyakran elvész az előállítási folyamat során (33). Ezenkívül ismert, hogy az LH1 és a természetes ciklikus lipidek eltávolítása az RC-ből hatással lehet a funkciókra, például a töltésszeparált P+QB-állapot lerövidült élettartamára (31, 34, 35). Ezért feltételezzük, hogy az RC-t körülvevő lokális LH1 gyűrű megléte fenntarthatja a „zárt” QB helyet, ezáltal megőrizve a QB közelében lévő lokális környezetet.
Bár az apolipoprotein (QB kinon nélkül) és a teljes szerkezet csupán két pillanatképet képvisel a QB hely átalakulásának, nem pedig események sorozatát, vannak arra utaló jelek, hogy a kötődés kapuzható, hogy megakadályozza a hidrokinon általi újbóli kötődést a szubsztrát gátlásának gátlása érdekében. A kinolon és a kinon kölcsönhatása az apolipoprotein QB helye közelében eltérő lehet, ami a RC általi kilökődéshez vezet. Régóta feltételezik, hogy a konformációs változások szerepet játszanak a kinonok kötődésében és redukciójában. A fagyasztott RC-k kinonredukáló képessége a sötétadaptáció után károsodik (36); a röntgenkrisztallográfia azt mutatja, hogy ez a károsodás annak köszönhető, hogy a QB kinonok egy „disztális” konformációban csapdába esnek, körülbelül 4,5 Å-re az aktív proximális helyzettől (26), 37). Azt feltételezzük, hogy ez a disztális kötődési konformáció az apolipoprotein és a teljes gyűrűs szerkezet közötti köztes állapot pillanatképe, amely a kinonnal való kezdeti kölcsönhatást és a QB hely megnyílását követi.
A bizonyos fototróf baktériumok és cianobaktériumok, algák és növények PSII komplexében található II-es típusú RC szerkezeti és funkcionális konzerváltsággal rendelkezik (38). A 6. ábrán (D és E) látható szerkezeti igazodás hangsúlyozza a PSII RC-k és a bakteriális RC komplex QB helye közötti hasonlóságot. Ez az összehasonlítás régóta modellként szolgál a kinonkötés és -redukció szorosan összefüggő rendszereinek tanulmányozására. Korábbi publikációk azt sugallták, hogy a konformációs változásokat a kinonok PSII redukciója kíséri (39, 40). Ezért, figyelembe véve az RC evolúciós konzerváltságát, ez a korábban nem megfigyelt kötődési mechanizmus alkalmazható lehet a PSII RC QB helyére is oxigénnel telített fototróf növényekben.
Az Rps ΔpufW (jelöletlen pufW deléció) és PufW-His (C-terminális 10x His-jelölt protein-W, a természetes pufW lókuszról expresszálva) törzseket. A palustris CGA009 törzset korábbi munkánkban írtuk le (16). Ezeket a törzseket és az izogén vad típusú szülőt kis számú sejtszám PYE (egyenként 5 g/l) táptalajra (LB táptalajban tárolva -80 °C-on, 50% (tömeg/térfogat) glicerint tartalmazó, 50% (tömeg/térfogat) glicerint tartalmazó, 1,5% (tömeg/térfogat) tartalmú agarra szélesztettük a fagyasztóból. A lemezt egy éjszakán át sötétben, szobahőmérsékleten, anaerob körülmények között inkubáltuk, majd OSRAM 116-W halogénizzók (RS Components, Egyesült Királyság) által biztosított fehér fénnyel (~50 μmolm-2 s-1) világítottuk meg 3-5 napig, amíg egyetlen telep megjelent, amíg egyetlen telep meg nem jelent. Egyetlen telepet használtunk 10 ml, 0,1% (w/v) kazaminosavval kiegészített M22+ táptalaj (41) (a továbbiakban: M22) beoltására. A tenyészetet alacsony oxigénszint mellett, sötétben, 34°C-on, 180 fordulat/perc rázatással 48 órán át növesztettük, majd a tenyészet 70 ml-ét ugyanilyen körülmények között 24 órán át oltottuk be. Egy 1 ml térfogatú félaerob tenyészettel 30 ml M22 táptalajt oltottunk be egy 30 ml-es univerzális csavaros tetejű átlátszó üvegpalackban, és steril mágneses erővel működő keverőpálcával 48 órán át rázattuk (~50μmolm-2 s-1). Ezután a tenyészet 30 ml-ét körülbelül 1 liter tenyészettel oltottuk be ugyanilyen körülmények között, majd ezt követően körülbelül 9 liter, ~200 μmolm-2 s-1 fényerősséggel 72 órán át megvilágított tenyészetet oltottunk be. A sejteket 7132 RCF-en 30 percig centrifugálással gyűjtöttük össze, majd ~10 ml 20 mM trisz-HCl-ben (pH 8,0) reszuszpendáltuk, és -20°C-on tároltuk a felhasználásig.
Felolvasztás után adjunk néhány kristály dezoxiribonukleáz I-et (Merck, Egyesült Királyság), lizozimet (Merck, Egyesült Királyság) és két Roche holoenzim proteáz inhibitor tablettát (Merck, Egyesült Királyság) a reszuszpendált sejtekhez. Egy 20 000 psi nyomású francia nyomáscellában (Aminco, USA) a sejteket 8-12 alkalommal roncsoltuk. Miután a sértetlen sejteket és az oldhatatlan törmeléket 18 500 RCF-en 15 percig 4°C-on centrifugálással eltávolítottuk, a membránt a pigmentált lizátumból 113 000 RCF-en 2 órán át 43 000°C-on centrifugálással kicsaptuk. Az oldható frakciót eldobjuk, és a színes membránt 100-200 ml 20 mM trisz-HCl-ben (pH 8,0) reszuszpendáljuk, majd homogenizáljuk, amíg már nem láthatók aggregátumok. A szuszpendált membránt 20 mM trisz-HCl-ben (pH 8,0) (Anatrace, USA), amely 2% (w/v) β-DDM-et tartalmazott, 1 órán át, sötétben, 4°C-on, enyhe keverés mellett inkubáltuk. Ezután 70°C-on centrifugáltuk, hogy 150 000 RCF-et oldjunk fel 4°C-on 1 órán át, a maradék oldhatatlan anyagok eltávolítása érdekében.
A ΔpufW törzsből származó szolubilizáló membránt 50 ml-es DEAE Sepharose ioncserélő oszlopra vittük fel, háromszoros oszloptérfogatnyi (CV) kötőpufferrel [20 mM trisz-HCl (pH 8,0), 0,03% (w/v) β-DDM-mel]. Az oszlopot két CV kötőpufferrel, majd két, 50 mM NaCl-t tartalmazó kötőpufferrel mostuk. Az RC-LH116 komplexet 150-300 mM NaCl lineáris gradienssel (kötőpufferben) eluáltuk 1,75 CV-n, a maradék kötőkomplexet pedig 300 mM NaCl-t tartalmazó kötőpufferrel eluáltuk 0,5 CV-n. Az abszorpciós spektrumot 250 és 1000 nm között vettük fel, az abszorbanciaarányú (A880/A280) frakciót 880-280 nm-en 1-nél nagyobb értéken tartottuk, kétszer hígítottuk a kötőpufferben, és a tisztítás után ismételtük meg ugyanezt az eljárást a DEAE oszlopon. Hígítsuk fel az 1,7-nél nagyobb A880/A280 arányú és a 3,0-nál nagyobb A880/A805 arányú frakciókat, végezzük el a harmadik ioncsere kört, és tartsuk vissza a 2,2-nél nagyobb A880/A280 arányú és az 5,0-nél nagyobb A880/A805 arányú frakciókat. A részlegesen tisztított komplexet ~2 ml-re koncentráltuk egy Amicon 100 000 molekulatömeg-határértékű (MWCO) centrifugális szűrőben (Merck, Egyesült Királyság), majd egy 200 mM NaCl puffert tartalmazó Superdex 200 16/600 méretkizárásos oszlopra (GE Healthcare, USA) vittük fel, majd ugyanebben a pufferben 1,5 CV nyomáson eluáltuk. Gyűjtsük össze a méretkizárásos frakció abszorpciós spektrumait, majd koncentráljuk az abszorpciós spektrumokat 2,4-es A880/A280 arányokkal és 5,8-as A880/A805 arányokkal 100-as A880 értékre, és azonnal használjuk fel krio-TEM rács előkészítéséhez vagy tárolásához. -80°C-on tartandó, amíg szükséges.
A PufW-His törzsből származó szolubilizáló membránt egy 20 ml-es HisPrep FF Ni-NTA Sepharose oszlopra (20 mM trisz-HCl (pH 8,0), amely 200 mM NaCl-t és 0,03% (t/t) tartalmaz) vittük fel IMAC pufferben (GE Healthcare). v) β-DDM]. Az oszlopot öt CV-egyenértékkel mostuk IMAC pufferrel, majd öt CV-egyenértékkel, amely 10 mM hisztidint tartalmazott. A magkomplexet öt IMAC pufferrel, amelyek 100 mM hisztidint tartalmaztak, eluáltuk az oszlopról. Az RC-LH114-W komplexet tartalmazó frakciót ~10 ml-re koncentráltuk egy Amicon 100,000 MWCO szűrővel (Merck, Egyesült Királyság) felszerelt keverős tartályban, 20-szorosára hígítottuk kötőpufferrel, majd 25 ml-hez adtuk. A DEAE Sepharose oszlopban a pufferhez kötött négy CV-egyenértéket előzetesen felhasználtuk. Az oszlopot négy CV kötőpufferrel mossuk, majd a komplexet nyolc CV-n eluáljuk 0-100 mM NaCl lineáris gradienssel (kötőpufferben), a fennmaradó négy CV pedig 100 mM kötőpuffert tartalmaz. A nátrium-kloridon eluált maradék komplexeket, amelyekben az A880/A280 arány nagyobb, mint 2,4, és az A880/A805 arány nagyobb, mint 4,6, egy Amicon 100 000 MWCO centrifugális szűrőben ~2 ml-re koncentráljuk, majd 1,5 CV IMAC-kal töltjük fel előre pufferrel kiegyensúlyozott Superdex 200 16/600 méretkizárásos oszlopon, majd ugyanebben a pufferben 1,5 CV-n eluáljuk. Gyűjtsük össze a méretkizárásos frakciók abszorpciós spektrumait, és koncentráljuk az abszorpciós spektrumokat 2,1-es A880/A280 arányokkal és 4,6-os A880/A805 arányokkal 100-as A880 értékre, amelyeket azonnal felhasználunk a fagyasztott TEM rács elkészítéséhez, vagy -80°C-on tároljuk a felhasználásig.
Az alacsony hőmérsékletű TEM rácsok elkészítéséhez Leica EM GP immerziós fagyasztót használtunk. A komplexet IMAC pufferben 50-es A880 értékre hígítottuk, majd 5 μl-t vittünk egy újonnan, parázsfény-kisüléssel előállított QUANTIFOIL 1.2/1.3 szénbevonatú rézhálóra (Agar Scientific, Egyesült Királyság). A rácsot 20°C-on és 60% relatív páratartalom mellett inkubáltuk 30 másodpercig, majd 3 másodpercig itattuk szárazra, végül pedig folyékony etánban -176°C-on leállítottuk a reakciót.
Az RC-LH114-W komplex adatait az eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) készüléken rögzítettük egy Titan Krios mikroszkóppal, amely 300 kV gyorsítófeszültséggel, 130 000× névleges nagyítással és 20 eV energiával működik. Az adatgyűjtéshez egy K2 csúcsdetektorral ellátott Gatan 968 GIF Quantum mikroszkópot használtunk a képek számláló módban történő rögzítésére. A kalibrált pixelméret 1,048 Å, a dózisteljesítmény pedig 3,83 e-Å⁻²s⁻¹. A felvételt 11 másodperc alatt gyűjtöttük össze, majd 40 részre osztottuk. A szénbevonatú területet használtuk a mikroszkóp újrafókuszálásához, majd lyukanként három felvételt készítettünk. Összesen 3130 felvételt gyűjtöttünk, -1 és -3 μm közötti defókuszértékekkel.
Az RC-LH116 komplex adatait ugyanazzal a mikroszkóppal gyűjtötték az Asterbury Bioszerkezeti Laboratóriumban (Leeds-i Egyetem, Egyesült Királyság). Az adatokat számláló módban, 130 k nagyítással gyűjtötték, a pixelméretet 1,065 Å-re kalibrálták 4,6 e-Å-2s-1 dózissal. A filmet 12 másodperc alatt rögzítették, és 48 részre osztották. Összesen 3359 filmet gyűjtöttek, -1 és -3 μm közötti defókuszértékekkel.
Minden adatfeldolgozás a Relion 3.0 folyamatban (42) történik. A Motioncorr 2 (43) segítségével dózis súlyozással korrigálható a nyaláb mozgása, majd a CTFFIND 4.1 (44) segítségével meghatározható a CTF (kontrasztátviteli függvény) paraméter. A kezdeti feldolgozási szakaszok utáni tipikus mikrofotográfiák a 2. ábrán láthatók. S16. Az automatikus kiválasztási sablont úgy generálják, hogy manuálisan kiválasztanak körülbelül 250 pixelt, 1000 részecskéből álló csoportot egy 250 pixeles keretben, referencia kétdimenziós (2D) osztályozás nélkül, ezáltal elutasítva azokat az osztályozásokat, amelyek megfelelnek a minta szennyeződésének, vagy nem rendelkeznek megkülönböztethető jellemzőkkel. Ezután automatikus kiválasztást végeztek az összes mikrofotográfián, és az RC-LH114-W 849 359 részecskét, az RC-LH116 komplex pedig 476 547 részecskét tartalmazott. Minden kiválasztott részecske két, nem referencia 2D osztályozási körben került osztályozásra, és minden futtatás után a szénterülettel, a minta szennyeződésével, a nyilvánvaló jellemzők hiányával vagy az erősen átfedő részecskékkel rendelkező részecskéket kiszűrik, így 772 033 (90,9%) és 359 678 (75,5%) részecskét használnak az RC-LH114-W és az RC-LH116 3D osztályozására. A kezdeti 3D referenciamodellt sztochasztikus gradiens ereszkedés módszerével generálták. A kezdeti modellt referenciaként használva a kiválasztott részecskéket négy kategóriába sorolják 3D-ben. Az ebben a kategóriában lévő modellt referenciaként használva 3D finomítást végeznek a legnagyobb kategóriába tartozó részecskéken, majd a kezdeti 15 Å aluláteresztő szűrővel lefedik az oldószer területét, 6 pixel lágy éleket adnak hozzá, és utófeldolgozással korrigálják a pixeleket a felső detektor Gatan K2 csúcs modulációs átviteli függvényének korrigálásához. Az RC-LH114-W adathalmaz esetében ezt a kezdeti modellt úgy módosították, hogy eltávolították a maszk szélein lévő erős sűrűséget (ez elkülönül az UCSF Chimera magkomplex sűrűségétől). Az így kapott modelleket (az RC-LH114-W és az RC-LH116 felbontása 3,91, illetve 4,16 Å) referenciaként használták a 3D osztályozás második köréhez. A felhasznált részecskék a kezdeti 3D osztályba vannak csoportosítva, és nem mutatnak erős korrelációt a szomszédsággal. Átfedés vagy nyilvánvaló szerkezeti jellemzők hiánya. A 3D osztályozás második köre után a legnagyobb felbontású kategóriát választották ki [az RC-LH114-W esetében az egyik kategória 377 703 részecske (44,5%), az RC-LH116 esetében két kategória van, összesen 260 752 részecske (54,7%), ahol ezek csak akkor azonosak, ha a kezdeti forgatás után egymáshoz igazítják őket, kis eltéréssel]. A kiválasztott részecskéket egy 400 pixeles dobozban újra kivonják, majd 3D finomítással finomítják. Az oldószeres maszkot a kezdeti 15Å aluláteresztő szűrő, 3 pixeles térképkiterjesztés és 3 pixeles lágy maszk segítségével generálják. Részecskénkénti CTF finomítás, részecskénkénti mozgáskorrekció és a részecskénkénti CTF finomítás második körének alkalmazásával minden lépés után 3D finomítást, oldószeres maszkolást és utófeldolgozást végeznek a kapott textúra további finomítása érdekében. A 0,143-as FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) határérték alkalmazásával az RC-LH114-W és az RC-LH116 végső modelljének felbontása 2,65, illetve 2,80Å. A végső modell FSC görbéjét a 2. ábra S17 mutatja.
Minden fehérjeszekvencia az UniProtKB-ből lett letöltve: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). A SWISS-MODEL (45) programot használtuk az RC homológ modelljének elkészítéséhez, amely az RC-L, RC-M és RC-H fehérjeszekvenciáit, valamint az Rba kristályszerkezetét tartalmazza. A sphaeroides RC-t használtuk templátként (PDB ID: 5LSE) (46). Az UCSF Chimera „illesztési térkép” eszközével illesztettük a létrehozott modellt a térképhez (47), javítottuk a fehérjeszerkezetet, és a kofaktort [4×BChl a (monomerkönyvtár aminosav neve = BCL), 2×BPh a (BPH), egy vagy kétféle UQ10 (U10), egy nem hem vas (Fe) és egy 3,4-dihidrohexakarbonilkolin (QAK)] Coot (48) segítségével adtuk hozzá. Mivel a QAK nem áll rendelkezésre a monomerkönyvtárban, a PHENIX (49) eLBOW eszközével paramétereztük.
Ezután megépítettük az LH1 alegységet. Kezdetben a PHENIX (49) automatikus szerkesztőeszközét használtuk az LH1 szekvencia egy részének automatikus megalkotására a térkép és az LH1-α és LH1-β fehérjeszekvenciák bemenetként való felhasználásával. Választottuk ki a legteljesebb LH1 alegységet, vontuk ki és töltsük be a Cootba, manuálisan adjuk hozzá a hiányzó szekvenciát, és manuálisan finomítottuk a teljes szerkezetet, mielőtt hozzáadtunk volna két BCls a-t (BCL) és egy spirilloxantint (CRT) [a vonatkozó Rps szerint]. Az LH1 komplex sűrűsége és az ismert karotinoid-tartalom. Species (17)]. Másoljuk le a teljes LH1 alegységet, és az UCSF Chimera „Docking Map Tool” segítségével dokkoljuk az LH1 sűrűség szomszédos, nem modellezett területét, majd finomítsuk a Cootban; ismételjük a folyamatot, amíg az összes LH1 alegységet modelleztük. Az RC-LH114-W szerkezet esetében a Coot-ban található nem allokált sűrűség kinyerésével a fehérjét szegmentálják az USCF Chimera térképen fennmaradó nem fehérje komponensektől, és az Autobuild eszközzel létrehozzák a kezdeti modellt, valamint a fennmaradó alegységek (protein-W) modellezését. A PHENIX (49) programban. Adják hozzá a hiányzó szekvenciákat a kapott modellhez a Coot-ban (48), majd manuálisan finomítsák a teljes alegységet. A fennmaradó nem allokált sűrűség illeszkedik a lipidek (CDL = CDL, POPC = 6PL és POPG = PGT PDB monomer könyvtár azonosítója), a β-DDM detergens (LMT) és az UQ10 molekulák (U10) kombinációjához. Használja a PHENIX optimalizálást (49) és a Coot-ban (48) található manuális optimalizálást a teljes kezdeti modell tökéletesítéséhez, amíg a modell statisztikái és az illesztés vizuális minősége már nem javítható tovább. Végül használja a LocScale-t (50) a lokális térkép élesítéséhez, majd hajtson végre több további ciklust a nem allokált sűrűség modellezésére, valamint az automatikus és manuális optimalizálásra.
A megfelelő sűrűségükön belül dokkolt megfelelő peptideket, kofaktorokat és egyéb lipideket és kinonokat az 1. és 2. ábra mutatja. S18–S23. A végső modell statisztikai adatait az S1. táblázat mutatja.
Eltérő rendelkezés hiányában az UV/Vis/NIR abszorpciós spektrumokat Cary60 spektrofotométeren (Agilent, USA) vettük fel 1 nm-es intervallumokban, 250 nm és 1000 nm között, 0,1 másodperces integrációs idővel.
A mintát egy 2 mm-es úthosszúságú kvarcküvettában hígítjuk 1-es A880-ig, és felvesszük az abszorpciós spektrumot 400 és 1000 nm között. A cirkuláris dikroikus spektrumokat Jasco 810 spektropolariméteren (Jasco, Japán) vettük fel 1 nm-es intervallumokban 400 nm és 950 nm között, 20 nm/perc pásztázási sebességgel.
A moláris extinkciós együtthatót úgy határozzuk meg, hogy a magkomplexet körülbelül 50-es A880 értékre hígítjuk. A 10 μl térfogatot 990 μl kötőpufferben vagy metanolban hígítjuk, és azonnal felvesszük az abszorpciós spektrumot a BChl lebomlásának minimalizálása érdekében. Az egyes metanolminták BChl-tartalmát a 771 nm-en mért 54,8 mM-1 cm-1 extinkciós koefficienssel számítottuk ki, és meghatároztuk az extinkciós koefficienst (51). A mért BChl-koncentrációt elosztjuk 32-vel (RC-LH114-W) vagy 36-tal (RC-LH116) a magkomplex koncentrációjának meghatározásához, amelyet ezután a pufferben gyűjtött ugyanazon minta abszorpciós spektrumának meghatározására használunk. Extinkciós koefficiens. Három ismételt mérést végeztünk minden mintánál, és a BChl Qy maximum átlagos abszorbanciáját használtuk a számításhoz. Az RC-LH114-W 878 nm-en mért extinkciós együtthatója 3280±140 mM-1 cm-1, míg az RC-LH116 880 nm-en mért extinkciós együtthatója 3800±30 mM-1 cm-1.
Az UQ10 mennyiségi meghatározása az (52)-ben leírt módszer szerint történt. Röviden, a fordított fázisú HPLC-t (RP-HPLC) az Agilent 1200 HPLC rendszerrel végeztük. Oldjunk fel körülbelül 0,02 nmol RC-LH116-ot vagy RC-LH114-W-t 50 μl 50:50 metanol:kloroform elegyben, amely 0,02% (w/v) vas(III)-kloridot tartalmaz, majd injektáljuk az előegyensúlyozott Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm-t. Oldjuk fel 1 ml-1 perc-1 sebességgel 40°C-on HPLC oldószerben (80:20 metanol:2-propanol) egy ×25 cm-es oszlopra. Izokratikus elúciót végezzünk HPLC oldószerben az abszorbancia monitorozásához 275 nm-en (UQ10), 450 nm-en (karotinoidok) és 780 nm-en (BChl) 1 órán át. A 275 nm-es kromatogramon 25,5 percnél látható csúcsot integrálták, amely nem tartalmazott más kimutatható vegyületet. Az integrált területet használták a kivont UQ10 moláris mennyiségének kiszámítására a 0 és 5,8 nmol közötti tiszta standardok injektálásával számított kalibrációs görbéhez viszonyítva (S14. ábra). Minden mintát három ismétlésben elemeztek, és a jelentett hiba az átlag szórásának felel meg.
Egy 0,1 maximális Qy abszorpciójú RC-LH1 komplexet tartalmazó oldatot készítettünk 30 μM redukált lószív citokróm c2-vel (Merck, Egyesült Királyság) és 0-50 μMUQ2-vel (Merck, Egyesült Királyság). Minden UQ2 koncentrációban három 1 ml-es mintát készítettünk, és egy éjszakán át sötétben, 4°C-on inkubáltuk, hogy a mérés előtt teljesen alkalmazkodjunk a sötéthez. Az oldatot egy OLIS RSM1000 moduláris spektrofotométerbe töltöttük, amely 300 nm-es lánggal/500 vonalráccsal, 1,24 mm-es bemenettel, 0,12 mm-es középső és 0,6 mm-es kimeneti résekkel volt felszerelve. A gerjesztő fény kizárására egy 600 nm hosszú áteresztő szűrőt helyeztünk a minta fototubusának és a referencia fotoelektronsokszorozó csőnek a bejáratához. Az abszorbanciát 550 nm-en monitoroztuk, 0,15 másodperces integrációs idővel. A gerjesztő fényt egy 880 nm-es M880F2 LED (fénykibocsátó dióda) (Thorlabs Ltd., Egyesült Királyság) bocsátja ki egy optikai kábelen keresztül 90%-os intenzitással egy DC2200 vezérlőn (Thorlabs Ltd., Egyesült Királyság) keresztül, és 90°-os szögben bocsátja ki a fényforráshoz. A mérőnyaláb a tükörrel szemben helyezkedik el, hogy visszaverje a minta által kezdetben el nem nyelt fényt. Az abszorbanciát 10 másodperccel az 50 másodperces megvilágítási intenzitás elérése előtt figyeljük. Ezután az abszorbanciát további 60 másodpercig sötétben figyeljük, hogy felmérjük, milyen mértékben redukálja a kinolol spontán módon a citokróm c23+-t (lásd az S8. ábrát a nyers adatokért).
Az adatokat úgy dolgoztuk fel, hogy 0,5 és 10 másodperc között lineáris kezdeti sebességet illesztettünk (az UQ2 koncentrációjától függően), és átlagoltuk mindhárom minta sebességét az egyes UQ2 koncentrációknál. A megfelelő extinkciós együttható alapján számított RC-LH1 koncentrációt használtuk a sebesség katalitikus hatékonysággá való átszámítására, amelyet az Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) szoftverben ábrázoltunk, és a Michaelis-Menten modellhez illesztettünk a látszólagos Km és Kcat értékek meghatározásához.
Az átmeneti abszorpciós mérésekhez az RC-LH1 mintát ~2 μM-ra hígítottuk IMAC pufferben, amely 50 mM nátrium-aszkorbátot (Merck, USA) és 0,4 mM terbutint (Merck, USA) tartalmazott. Az aszkorbinsavat áldozati elektrondonorként, a terc-butaklofent pedig QB-gátlóként használtuk annak biztosítására, hogy a fő RC donor redukált maradjon (azaz ne fotooxidálódjon) a mérési folyamat során. Körülbelül 3 ml mintát adtunk egy egyedi forgó cellába (kb. 0,1 m átmérőjű, 350 RPM) 2 mm optikai úthosszal, hogy a lézerpályán lévő mintának elegendő ideje legyen a sötétadaptációra a gerjesztő impulzusok között. ~100 fs lézerimpulzusokat használtunk a Ti:Zafír lézerrendszer (Spectra Physics, USA) erősítésére, hogy a mintát 880 nm-en gerjesztsük 1 kHz ismétlési frekvenciával (20 nJ közeli infravörös vagy 100 nJ látható tartományban). Az adatgyűjtés előtt a mintát körülbelül 30 percig gerjesztő fénynek tettük ki. Az expozíció a QA inaktiválódását okozza (esetleg egyszer vagy kétszer csökkentve a QA-t). Felhívjuk azonban a figyelmet, hogy ez a folyamat visszafordítható, mivel hosszú sötétadaptációs időszak után az RC lassan visszatér a QA aktivitáshoz. A tranziens spektrumokat Helios spektrométerrel (Ultrafast Systems, USA) mérték, -10 és 7000 ps közötti késleltetési idővel. A Surface Xplorer szoftverrel (Ultrafast Systems, USA) bontották szét az adatkészleteket, majd egyesítették és szabványosították azokat. A CarpetView szoftvercsomaggal (Light Conversion Ltd., Litvánia) egyesített adatkészletet használtak a bomlással kapcsolatos differenciálspektrumok előállításához, vagy olyan függvényt használtak, amely több kitevőt konvolúcióval kezel a műszer válaszával, hogy illeszkedjen az Origin (OriginLab, USA) egyhullámú spektrális evolúciójához.
Amint azt fentebb említettük (53), egy fotoszintetikus filmet készítettünk, amely LH1 komplexet tartalmazott, és amelyből hiányzott mind az RC, mind a perifériás LH2 antenna. A membránt 20 mM Tris-ben (pH 8,0) hígítottuk, majd egy 2 mm-es optikai úthosszúságú kvarcküvettába helyeztük. Egy 30 nJ-os lézerimpulzust alkalmaztunk a minta gerjesztésére 540 nm hullámhosszon, -10 és 7000 ps közötti késleltetési idővel. Az adathalmazt az Rps.pal minta esetében leírtak szerint dolgoztuk fel.
A membránt 150 000 RCF-fel, 2 órán át 4°C-on centrifugálással ülepítettük, majd 880 nm-en mért abszorbanciáját 20 mM trisz-HCl-ben (pH 8,0) és 200 mM NaCl-ban reszuszpendáltuk. A membránt lassú keveréssel oldottuk fel 2% (w/v) β-DDM-ben 1 órán át sötétben, 4°C-on. A mintát 100 mM trietilamónium-karbonátban (pH 8,0) (TEAB; Merck, Egyesült Királyság) hígítottuk 2,5 mg ml-1 fehérjekoncentrációra (Bio-Rad analízis). A további feldolgozást a korábban publikált módszer (54) szerint végeztük, 50 μg fehérje hígításával kezdve, összesen 50 μl, 1% (w/v) nátrium-laurátot (Merck, Egyesült Királyság) tartalmazó TEAB-ban. 60 másodperces ultrahangos kezelés után 5 mM trisz(2-karboxietil)foszfinnal (Merck, Egyesült Királyság) redukáltuk 37°C-on 30 percig. S-alkilezéshez a mintát 10 mM metil-S-metiltiometánszulfonáttal (Merck, Egyesült Királyság) inkubáltuk, és 200 mM izopropanol törzsoldatból adtuk hozzá 10 percig szobahőmérsékleten. A proteolitikus emésztést 2 μg tripszin/endoproteináz Lys-C keverék (Promega UK) hozzáadásával és 3 órás 37°C-on történő inkubálásával végeztük. A laurát felületaktív anyagot 50 μl etil-acetát és 10 μl 10% (v/v) LC minőségű trifluor-ecetsav (TFA; Thermo Fisher Scientific, Egyesült Királyság) hozzáadásával, majd 60 másodperces vortexeléssel extraháltuk. A fázisszétválást 15 700 RCF-en 5 percig tartó centrifugálással elősegítettük. A gyártó protokollja szerint C18 spin oszlopot (Thermo Fisher Scientific, Egyesült Királyság) használtunk a peptidet tartalmazó alsó fázis óvatos leszívására és sómentesítésére. Vákuumcentrifugálással történő szárítás után a mintát 0,5% TFA-ban és 3% acetonitrilben oldottuk, és 500 ng-ot nanoflow RP kromatográfiával és tömegspektrometriával elemeztünk a korábban részletezett rendszerparaméterek alkalmazásával.
A fehérjeazonosításhoz és -kvantifikáláshoz a MaxQuant v.1.5.3.30 (56) programmal keresse meg az Rps. palustris proteom adatbázisát (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). A tömegspektrometriás proteomikai adatokat a ProteomeXchange Alliance-ban helyezték el a PRIDE partner adattárán (http://proteomecentral.proteomexchange.org) keresztül a PXD020402 adatkészlet-azonosító alatt.
Az elektrospray ionizációs tömegspektrometriával kapcsolt RPLC-vel végzett analízishez az RC-LH1 komplexet vad típusú Rps-ből állították elő. A korábban publikált módszerrel (16) a palustris sejtekben termelt fehérjekoncentráció 2 mg ml-1 volt 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl és 0,03% (w/v) β- (Bio-Rad analízis) ) DDM összetételében. A gyártó protokollja szerint 2D tisztító készlettel (GE Healthcare, USA) kivontak 10 μg fehérjét kicsapási módszerrel, és a csapadékot 20 μl 60% (v/v) hangyasav (FA), 20% (v/v) acetonitril és 20% (v/v) víz oldatában oldották fel. Öt mikrolitert elemeztek RPLC-vel (Dionex RSLC) tömegspektrometriával (Maxis UHR-TOF, Bruker). MabPac 1,2×100 mm-es oszlopot (Thermo Fisher Scientific, Egyesült Királyság) használunk az elválasztáshoz 60°C-on és 100 μlperc-1 sebességgel, 85% (v/v) A oldószer [0,1% (v/v) FA és 0,02% (V/v) TFA vizes oldat] - 85% (v/v) B oldószer [0,1% (v/v) FA és 0,02% (v/v) 90% (v/v) acetonitril TFA-ban] gradienssel. Standard elektrospray ionizációs forrást és alapértelmezett paramétereket használva 60 percnél hosszabb ideig, a tömegspektrométer 100-2750 m/z (tömeg-töltés arány) értéket kap. Az ExPASy bioinformatikai erőforrásportál FindPept eszközének (https://web.expasy.org/findpept/) segítségével képezzük le a tömegspektrumot a komplex alegységeire.
A sejteket 72 órán át tenyésztettük 100 ml NF-alacsony (10 μMm-2 s-1), közepes (30 μMm-2 s-1) vagy magas (300 μMm-2 s-1) fény mellett. M22 táptalaj (M22 táptalaj, amelyben nincs ammónium-szulfát, és a nátrium-szukcinátot nátrium-acetát helyettesíti) egy 100 ml-es csavaros tetejű palackban (23). Öt 30 másodperces ciklusban 0,1 mikronos üveggyöngyöket gyöngyöztünk 1:1 térfogatarányban a sejtek lizálása érdekében, majd 5 percig jégen hűtöttük. Az oldhatatlan anyagot, a sértetlen sejteket és az üveggyöngyöket centrifugálással távolítottuk el 16 000 RCF-en 10 percig egy asztali mikrocentrifugában. A membránt Ti 70.1 rotorban választottuk szét 100 000 RCF-fel 20 mM trisz-HCl-ben (pH 8,0), 40/15% (t/t) szacharóz gradienssel 10 órán át.
Ahogyan azt korábbi munkánkban leírtuk, a His-címke immunológiai kimutatása PufW-n (16). Röviden, a tisztított magkomplex (11,8 nM) vagy az azonos koncentrációjú RC-t tartalmazó membrán (oxidációval meghatározva, a redukált különbségi spektrum kivonásával és a festett gélen lévő töltet illesztésével) 2x SDS betöltő pufferben (Merck, Egyesült Királyság) kétszer hígítva. A fehérjéket replika 12%-os bisz-trisz NuPage gélen (Thermo Fisher Scientific, Egyesült Királyság) választottuk el. A gélt Coomassie Brilliant Blue-val (Bio-Rad, Egyesült Királyság) festettük az RC-L alegység feltöltéséhez és vizualizálásához. A második gélen lévő fehérjét metanollal aktivált polivinilidén-fluorid (PVDF) membránra (Thermo Fisher Scientific, Egyesült Királyság) vittük át immunvizsgálat céljából. A PVDF membránt 50 mM trisz-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 és 5% (w/v) sovány tejpor összetételű oldatban blokkoltuk, majd 4 órán át inkubáltuk az anti-His primer antitesttel (az antitest puffert [50 mM trisz-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl és 0,05% (v/v) Tween-20] 1:1000 arányban hígított A190-114A pufferben, Bethyl Laboratories, USA). Miután 3-szor 5 percig mostuk antitest pufferben, a membránt torma-peroxidázzal (Sigma-Aldrich, Egyesült Királyság) kombináltuk egér elleni másodlagos antitesttel (1:10 000 arányban hígítva antitest pufferben). Inkubáltuk a detektálás lehetővé tétele érdekében (5 perccel az antitest pufferben 3 mosás után) WESTAR ETA C 2.0 kemilumineszcencia szubsztráttal (Cyanagen, Olaszország) és Amersham Imager 600-zal (GE Healthcare, Egyesült Királyság).
Az ImageJ (57) programban az egyes festett gélek vagy immunvizsgálati sávok intenzitáseloszlásának megrajzolásával, a csúcs alatti terület integrálásával és az RC-L (festett gél) és a Protein-W (immunvizsgálat) intenzitásarányának kiszámításával a kép feldolgozása. Ezeket az arányokat moláris arányokká alakítottuk át, feltételezve, hogy az RC-L és a protein-W aránya a tiszta RC-LH114-W mintában 1:1, és ennek megfelelően normalizáltuk a teljes adathalmazt.
A cikkhez tartozó kiegészítő anyagokért kérjük, látogassa meg a http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 weboldalt.
Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, amely a Creative Commons Nevezd meg! licenc feltételei szerint kerül terjesztésre. A cikk korlátlanul felhasználható, terjeszthető és sokszorosítható bármilyen médiumban, azzal a feltétellel, hogy az eredeti mű megfelelően hivatkozik rá.
Megjegyzés: Csak azért kérjük az e-mail címed megadását, hogy az oldalra ajánlott személy tudja, hogy szeretnéd, ha látná az e-mailt, és hogy az nem spam. Nem fogunk rögzíteni semmilyen e-mail címet.
Ez a kérdés arra szolgál, hogy teszteljük, látogató-e, és megakadályozzuk az automatikus spamküldést.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
A reakcióközpontban található 1-es fénycsapda komplex nagy felbontású szerkezete új ismereteket nyújt a kinondinamikáról.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
A reakcióközpontban található 1-es fénycsapda komplex nagy felbontású szerkezete új ismereteket nyújt a kinondinamikáról.
©2021 American Association for the Advancement of Science. minden jog fenntartva. Az AAAS a HINARI, az AGORA, az OARE, a CHORUS, a CLOCKSS, a CrossRef és a COUNTER partnere. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.